Intravital Billeddannelse af mus popliteale lymfeknude

Summary

Nylige fremskridt inden for to-foton-mikroskopi har muliggjort realtid

Abstract

Lymfeknuder (LN) er sekundære lymfoide organer, som er strategisk placeret i hele kroppen for at tillade indfangning og præsentation af fremmede antigener fra perifere væv til at prime den adaptive immunreaktion. Sammenstillet mellem medfødte og adaptive immunrespons, at LN er et ideelt sted at studere immun celle interaktioner ^1,2. Lymfocytter (T-celler, B-celler og NK-celler), dendritiske celler (DC'er), og makrofager omfatter hovedparten af ​​knoglemarv-afledte cellulære elementer i LN. Disse celler er strategisk placeret i LN at muliggøre en effektiv overvågning af selv-antigener og potentielle udenlandske antigener ^3-5. Den proces, ved hvilken lymfocytter held støder beslægtede antigener er en genstand for intens undersøgelse i de senere år, og omfatter en integration af molekylære kontakter, herunder antigen-receptorer, adhæsionsmolekyler, kemokiner og stromale strukturer såsom fibro-retikulære netværk ^2,6-12 . Forud for udviklingen af ​​høj-opløsning real-time fluorescerende in vivo billeddannelse, efterforskere har påberåbt sig statisk billeddannelse, som kun giver svar vedrørende morfologi, placering og arkitektur. Selv om disse spørgsmål er grundlæggende i vores forståelse af immun celle adfærd, er de begrænsninger, der med denne teknik ikke tillader analyse til at dechifrere lymfocyt menneskehandel og miljømæssige spor, der påvirker dynamiske celle adfærd. For nylig, udvikling af intravital to-foton laser scanning mikroskopi (2P-LSM) har gjort det muligt for forskerne at se de dynamiske bevægelser og interaktioner af de enkelte celler i live LN i stedet ^12-16. Især har vi og andre anvendes denne teknik til billede cellulær adfærd og interaktioner inden den popliteale LN, hvor den kompakte, tætte natur giver den fordel, multipleks dataopsamling over et stort vævsområde med forskellige væv sub-strukturer ^11,17-18 . Det jeger vigtigt at bemærke, at denne teknik giver ekstra fordele i forhold til eksplanteret væv billedbehandling teknikker, som kræver afbrydelse af blod, lymfe flow, og i sidste ende de cellulære dynamik i systemet. Derudover eksplanterede væv har en meget begrænset tidsvindue, hvor vævet forbliver levedygtige efter billeddannelse efter eksplantation. Med ordentlig hydrering og overvågning af dyrets miljøforhold, kan den billeddannelse tiden blive udvidet betydeligt med denne intravital teknik. Her præsenterer vi en detaljeret metode til fremstilling af mus popliteal LN med det formål at udføre intravital billeddannelse.

Protocol

1. Mus Holder Assembly

1. Overlejre dækslet af en 100 mm glas petriskål på toppen af ​​en 100 mm plast Petri-skål låget nedad. Glasset skal næsten røre midtpunkt plastik fad. Ved hjælp af glas som en stencil, spore en mark på plastskål.
2. Anvende en håndboremaskine (dvs. Dremel) for at fjerne en del af en 100 mm plastskål låg for at skabe en halvmåneformet platform. Dette halvmåneformet plastlåg vil tjene som en understøtning for den øvre torso af mus (figur 1a). Bores to huller på halvmåneformede låg til at fastgøre gasmaske med et metal snoningsbinding. Fastgøre plastlåg til kanten af ​​glasset petriskålen hjælp superlim eller en ækvivalent stærk adhæsiv (figur 1b).
3. Lim lågene af to hvælvede-cap PCR-rør (skåret ved hængslet) 1 cm afstand til midten af ​​bunden skålen med henblik på forankring popliteale hudlapper.

2. Mus Forberedelse

1. Bedøve mus med isofluran (2 til 2,5% for induktion, 1,5 til 2% til kirurgi / billeddannelse) blandes i 1:1 _O2: luftblanding ved en strømningshastighed på 1L/min anvendelse af en IACUC-godkendt procedure. Når musen er bedøvet, sikre en gasmaske over næsen med tape. Afgør, om musen er fuldt bedøvet på grund af manglende respons til tå og / eller hale kniber. Niveauet af isofluran kan justeres i overensstemmelse hermed for at sikre, at dyret er fuldt bedøvet med en stabil, ikke-arbejdede respirationsfrekvens mellem 60-80 vejrtrækninger / min.
2. Anvender en elektrisk trimmer at fjerne hår på det højre bagben og inguinale område af musen.
3. Børst væk løse hår og forsigtigt på et beskedent lag Nair lotion på barberede område med en vatpind. Efter et minut oprindelige ansøgning, skal du fjerne Nair og rense huden med en fugtigkøkkenrulle. Sørg for, at musen er ren og tør før du fortsætter.
4. Foretage en lille 2 til 3 mm incision med en saks til højre knæ at blotlægge extensor senen.
5. Anvendelse Vetbond langs midten af ​​muse holderen, hvor musen kroppen og ben vil blive placeret. Omhyggeligt sikres musen på holderen, med det højre knæ ned, for at eksponere den højre knæhasen. Fastgør højre knæ senen med Vetbond i mellem de 2 hud flap indehaveren ret til at hjælpe med at stabilisere det billeddannende felt.
6. Stretch og tape armene og venstre ben til den øverste platform af holderen.
7. Anvende en snoningsbinding at fastgøre gasmaske på plads.
8. Placere holderen under dissektion mikroskop. LN skal forblive helt stille, uafhængigt af vejrtrækning bevægelse af musen. Derfor skal der træffes forholdsregler, mens de udfører operationen for at optimere stabiliteten af ​​benet. Bestemme positionen af ​​halen (typisk over hovedet), som vil bidrage til den størststabilitet højre ben og tape halen ned.

3. Kirurgi

1. Mens under dissektion omfang, holde musen kropstemperatur ved hjælp af et varmeapparat eller en varmepude. For vellykket billeddannelse af den popliteale LN, er det vigtigt at opretholde korrekt kropstemperatur hele operationen såvel som at bevare væv fugtighed ved konstant at anvende varmt PBS for det eksponerede væv.
2. Sterilisere huden med Betadine. Med sterile sakse, at en midtlinjeincision gennem huden til højre midten kalv og fortsætte opskæring vertikalt op til den øvre del af højre lår.
3. Lave to vandrette snit i huden på toppen af ​​den lodrette snitlinien at skabe hudlapper på begge sider.
4. Træk og lim ned på begge hudlapper med Vetbond. Trække huden spændt forud for anvendelsen af ​​Vetbond vil yderligere fremme ben stabilitet, men sørg for, at huden spændingen ikke tilstoppe blodgennemstrømning (dvs. ændringer i vessel farve eller diameter). Fortsæt med at lim ned andre områder af huden for at sikre stabiliteten af ​​benet, før du udsætter LN. Størrelsen af ​​muse vil bestemme, hvor meget ekstra huden for at klæbning. Typisk vil større mus kræve mere huden, der skal limes til holderen.
5. LN bør ligge inden for knæhasen enten til højre eller til venstre for den popliteale vene, afhængig af placeringen af ​​musen på holderen. Adskil forsigtigt LN fra omkringliggende fedtvæv og muskler ved hjælp af mikro-dissekere pincetter og tænger. For at minimere blødning og traume, bruge splaying teknikker med mikro-dissekere en pincet til at separate væv. Forsigtigt udsætte popliteale LN uden at skade integriteten af ​​de afferente og efferente blodkar og de afferente lymfekar.
6. For tilsat vævsstabilitet, kan en kvadratisk dækglas anbringes over det fugtige LN, lige netop rører LN samtidig undgå karokklusion. Dækslet glas kan være SECURed med modellervoks på hver side af musen.
7. Fluorescerende fartøj farvestoffer i forskellige størrelser (fx TRITC-dextran, mindst 70kDa) kan indføres intravenøst ​​på dette tidspunkt for at fremhæve den strukturelle forhold og integritet af LN under billeddannelse.

4. 2-Photon Imaging Acquisition **

1. Når LN er tilstrækkeligt eksponeret og stabilitet opnås omgående overføre hele muse fatningssamlingen på mikroskopbordet udstyret med en programmerbar temperatur feedback kontrolleret varmepude i et miljø mikroskop kammer holdt ved 37 ° C. Tilsættes tilstrækkeligt steril varm (37 ° C) PBS eller HBSS at nedsænke LN. Lydstyrken vil ændre sig afhængigt af størrelse og placering af musen. Alternativt kan varmt PBS eller HBSS påføres direkte på det dissekerede LN gennem et fint glaspipette monteret på en peristaltisk pumpe og klæbet til søjlen af ​​nedsænkning linsen mål. Strømningen af ​​væske skal være således, at enstabil vandsøjle kan opretholdes mellem linsen og vævet.
2. Opretholde PBS eller HBSS temperatur på 37 ° C under anvendelse af en varmepude med en feedback-probe. En separat temperatursonde skal placeres i mus holderen for at bekræfte temperaturen af ​​PBS i området fra 36,5 til 37,5 ° C. Rektal Proben kan også anvendes til at overvåge kropstemperaturen af ​​det eksperimentelle mus hele det billeddannende samling.
3. Brug en epi-lysstofrør til at hjælpe guide LN anbringelse under målet. Anskaf fluorescerende image stakke med tidsintervaller, der er passende for den ønskede cellulære interaktion (typisk 10 sekunder til 1 minut mellem hver XYZ billedstak).
4. Overvåge status for dyret i mikroskopet kammeret ofte ved visuel inspektion eller ved hjælp af et dyr overvågningssystem. Afgør, om musen er fuldt bedøvet på grund af manglende respons til tå og / eller negle klemmer, og en stabil, ikke-arbejdede respirationsfrekvens mellem 60-80 breaths / min. Niveauet af isofluran kan justeres i overensstemmelse hermed for at sikre, at dyret er fuldt bedøvet. Med korrekt overvågning og hydrering, kan dyr, der skal afbildes i 4-6 timer, eller eventuelt længere.
5. Efter billeddannelse eksperimentet aflive dyret i en CO ₂ kammeret under anvendelse IACUC-godkendt eutanasi protokol. Dyret bør ikke tillades at komme fra anæstesi før eutanasi.

** Denne kirurgiske procedure kan også være nyttige til andre former for intravital billeddannelse end 2P-LSM.

5. Repræsentative resultater

Forskellige cirkulerende immunceller rekrutteres til LN med forskellige hastigheder efter adoptiv transfer. For CD4 ⁺ og CD8 ^{+-lymfocytter,} disse celler begynder at komme i LN via de højt endotel venulen (HEV) minutter efter intravenøs overførsel med et større antal ankommer den popliteale LN efter 2 til 4 timer ^6,17-18. For B cells, vil et betydeligt antal akkumuleres efter 8 til 24 timer ^19. Aktiverede udviklingslandene bør begynde at dukke op i de drænende popliteale LN 8 til 16 timer efter trædepuden injektion ^3,11,16-17. Figur 2a viser, at selv uden andre seværdigheder, kan strukturer såsom B-celle hårsække anes let ved den runde kugleformede celleakkumulering synlige under 2P-LSM ^19. Ved hjælp af en endogen fluorescerende reporter såsom ubiquitin-GFP splenocytter (figur 2, Supplerende videoer 1 og 2), kan man spore disse lymfocyt migration og adfærd i dag op til en uge under ikke-stimulerende fysiologiske betingelser. Med multi-kanal høj følsomhed detektorer, er det muligt at erhverve en multiplex billedbehandling datasæt, som omfatter strukturel information samt interaktion dynamik mellem flere cellulære partnere ^17,19.

Når de kirurgiske teknikker er korrekt udført, og de miljømæssige forhold overvåges nøje, lymphocyTES skal udvise karakteristiske migration hastighed, som vist i figur 2c, 2d og andre steder ^13-14,16. Lymfocytter kan også udvise forskelle i migration hastighed afhængigt af sub-regioner i LN gennemgår billedbehandling, så vil yderligere seværdigheder såsom blodkar (som fremhævet ved indførelsen af ​​fartøjet farvestoffer) med til at bestemme den overordnede billedkvalitet (dvs. korrekt temperaturstyring , minimal traume LN, osv.) ^3,6,20.

Figur 1. Opførelse af en mus holder til musen popliteal LN Imaging a) Skematisk af muse holder samling;. B) Repræsentant intravital mus forberedelse c) Afsluttet musen holder samling d) Nærbilleder udsigt over popliteale LN efter kirurgisk eksponering.

Figur 2. Migration analyse af GFP +-lymfocytteri den popliteale LN. (a) 3D billede taget fra 2P-LSM billeddannelse sekvens af popliteale LN i en C57BL / 6 modtager mus adoptivt overført med 1x10 ⁷ GFP ^{+-lymfocytter} 1 dag før imagografi. Punkterede linie betegner kant af B-celle follikler (b) spor lymfocytmigrering løbet af 1 time med kontinuerlig billeddannelse c) fordeling af den samlede lymfocytmigrering hastighed. Gennemsnitshastighed = 10,04 ± 4,26 um / min (samlet 15,125 analyserede spor) d) Differential cellulære migration hastighed distribution af celler fundet i den B-celle follikel (åbne søjler; betyder hastighed = 8,79 ± 3,90 um / min; samlede 1.525 spor analyseret ) og T-celle zone (lukkede barer, betyder hastighed = 13,77 ± 5,93 um / min i alt 1.250 analyserede spor). Målestokken = 50 um.

Supplerende Video 1. Time-lapse intravital 2P-LSM afbildning af en mus popliteale LN som beskrevet i figur 2. I alt 1x10 ⁷ lymfocytter blev isoleret fron en ubiquitin-GFP + donormus og adoptivt overført intravenøst ​​i en C57BL / 6 modtager mus 24 timer før imagografi. En række xy (750 um x 750 um) fluorescens billeder blev taget med fast z stablerne (5 um trin 13 trin) til opnåelse af en XYZ billeddannende stabel (750 um x 750 um x 65 um), som blev gentaget hver 20 sekunder i alt 60 minutter, hvilket resulterer i en xyzt billeddannende sekvens for hastighed analyse (figur 2c, 2d). Afspilningshastigheden = 450x. Målestokken = 50 um. Tidsstempling = min: sek. Klik her for at se supplerende video .

Supplerende Video 2 forstørret med henblik på billeddannelse sekvensen i Supplemental Video 1 til B-celle folliklen. - T-celle zone kant. Afspilningshastigheden = 450x. Målestokken = 25 um. Tidsstempling = min. Sek Cslikke her for at se supplerende video.

Discussion

Nylige fremskridt i høj opløsning in situ billeddannelsesteknikker, især 2P-LSM, er blevet ledsaget af en voksende interesse i studiet af dynamiske cellulær adfærd in vivo. Den 4D billeddannelse teknik på popliteale LN af en levende mus tillader sådanne analyser i den dynamiske opførsel af immunceller i uafbrudt vævet mikro-miljø. Anvendelsen af ​​2P-LSM med flere detektorer, der spænder over hele det synlige spektrum tillader samtidig billeddannelse indsamling af multiple cellepopulationer. Dette kan nu opnås ved anvendelse af in vivo celle-specifikke fluorescerende reporter-mus (f.eks Ubiquitin-EGFP-RFP eller-eCFP) kombineret med anvendelsen af adoptiv overføring af differentielt mærkede cellepopulationer under anvendelse af organiske fluorescerende celler farvestoffer (fx CFSE , SNARF-1, og Cell Tracker Orange) at undersøge cellulære mekanismer og funktion inden for LN. Ud over direkte observation af interaktioner mellem differentielt spores cell befolkninger, kan multiplex imaging datasættet gennemgå yderligere analyser med kommercielt tilgængelige billeddiagnostiske behandling programmer (f.eks Imaris, BitPlane Inc.) til yderligere at belyse celle adfærd og funktion. En bred vifte af muligheder eksisterer for at studere cellulære mekanismer til interaktion med disse in vivo og in silico teknikker.

Den væsentligste begrænsning af den eksperimentelle fremgangsmåde, der beskrives her er den tekniske kompleksitet, der ligger i kirurgi tilgang. Denne teknik kræver hård træning at blive fortrolig med den relevante anatomi og de præcise tekniske procedurer og færdigheder som krævet i denne protokol. Yderligere komplicerende faktorer omfatter det er vanskeligt at minimere vævsskader under LN udforskning, optimering af væv stabilitet under billedbehandling, og forhindre termisk og laser skade på LN før og under billedbehandling eksperimenter. Forstyrrelse nogen af ​​disse faktorer vil resultere i mindre end optimal lymfeknuderocyte motilitet og vil derfor interferere med den korrekte fortolkning af den resulterende billeddannelse dataanalyser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Baxter Internationl Inc.	NDC 10019-773-60
Vetbond	3M	1469SB
Nair - hair removal lotion	Nair
PBS, 1X	Cellgro	21-040-CV
Heating pad	Watlow
Heating Pad Controller	Watlow
Air and O2	Airgas
Temperature probe	Harvard Apparatus
Tweezers Dumont #5	World Precision Instruments, Inc.	14101
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved	World Precision Instruments, Inc.	14141
Scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Cover of 100x20 mm glass cell culture dish	Corning	70165-102
Cover of 100x20 mm polystyrene cell culture dish	Corning	430167
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution)	Purdue Products L.P.	NDC 67618-150-08