Summary
Dette dokument viser en teknik til opsamling af blod fra den dorsale aorta af zebrafiskesperm. Det giver også instruktioner til opnåelse af serum til anvendelse i biokemiske analyser, såsom tests til bestemmelse af cholesterol-og triglyceridniveauer.
Abstract
Zebrafisken er blevet anvendt som en dyremodel til undersøgelse af adskillige humane sygdomme. Det kan tjene som en vigtig præklinisk platform for studier af molekylære begivenheder og terapeutiske strategier samt til evaluering af fysiologiske mekanismer nogle patologier 1.
Der er relativt få publikationer i forbindelse med voksne zebrafisk fysiologi af organer og systemer 2, hvilket kan føre forskerne til at udlede, at de grundlæggende teknikker er nødvendige for at tillade udforskning af zebrafisk systemer mangler 3. Hæmatologiske biokemiske værdier af zebrafisk blev først rapporteret i 2003 af Murtha og kolleger 4, der ansat en blodtapning teknik, første gang beskrevet af Jagadeeswaran og hans kolleger i 1999. Kort fortalt blev blod opsamlet via en mikropipettespids gennem en tværgående incision, ca 0,3 cm i længde i området af den dorsale aorta 5. På grund af de små involverede dimensioner, detteer en høj-præcisions teknik, der kræver en højt kvalificeret læge. Den samme teknik blev brugt af den samme gruppe i en anden publikation i samme år 6. I 2010 vurderede Eames og kolleger hele blodsukkerniveauet i zebrafisk 7. De fik adgang til blodet ved at udføre decapitations med en saks og derefter indsætte en hepariniseret mikrokapillær samling rør i brystfinner artikulation. De nævner problemer med hæmolyse, der blev løst med en passende opbevaringstemperatur baseret på arbejdet Kilpatrick et al. 8. Når man forsøger at anvende Jagadeeswaran Teknikken i vores laboratorium har vi fundet, at det var vanskeligt at snittet i nøjagtigt det rette sted, som ikke at tillade en væsentlig mængde blod tabt før opsamling kunne påbegyndes.
For nylig Gupta et al. 9 beskrevet, hvordan at dissekere voksne zebrafisk organer Kinkle et al. 10 beskrevet hvordan man udfører intraperitonEAL injektioner og Pugach et al. 11. beskrev, hvordan du udfører retro-orbital injektioner. Er dog mere arbejde for at mere fuldt ud at udforske grundlæggende teknikker til forskning i zebrafisk.
Den lille størrelse af zebrafisk en udfordring for forskere at bruge det som en eksperimentel model. Endvidere, givet på grund af små skala, er det vigtigt, at simple teknikker er udviklet til at forskere at undersøge fordelene ved zebrafisk model.
Protocol
1. Protokol tekst
- Før opsamling zebrafisk blod, er det nødvendigt at forberede bedøvelse vand. Hæld ~ 200 ml akvarievand i en beholder med en 500-ml. Tilsættes ~ 200 g is chips. Temperaturen bør være omkring 4 ° C. Som isspåner smelter, vil det være nødvendigt at tilføje flere isspåner at opretholde en konstant temperatur nær 4 ° C.
- Når bedøvelse vandet er klar, forberede de nødvendige materialer til opsamling af blod. Sæt en lav retention spids på en P20 pipette og lad pipette, hvor det kan være let tilgængelig. Lad ikke pipettespidsen til at kontakte alle kilder til forurening.
- Dæk en petriskål med et stykke tør gaze. En stålklinge og et andet stykke gaze bør placeres i et let tilgængeligt sted.
- En centrifuge indrettet til plastrør vil være nødvendig.
- Når de ovennævnte materialer er fremstillet, fange den første zebrafisk at være bedøvet witha fiskenet, og slip den i vandet, som er blevet forberedt til anæstesi. Zebrafisk kræver 3-6 sekunder i koldt vand for at være bedøvet, afhængigt af fisk. Hold fisken i koldt vand, indtil det ikke længere reagerer på eksterne stimuli.
- Ved hjælp af fiskenet, den bedøvede fisken anbringes på et forberedt stykke gaze, der forlader hale ud af gaze. Fold gaze over fiskens hoved og krop udelade kun halen. Satte fisken dækket med gaze på petriskålen.
- Brug stålklinge til at foretage en diagonal snit kun mellem gatfinnen og halefinnen. Blodet begynder at komme ud. På dette tidspunkt, er det nødvendigt at arbejde hurtigt.
- Forsigtigt stræber efter det blod, der kommer ud med P20 pipettor (pre-loaded med en lav retention spids). Den mængde blod, som kan opsamles, afhænger af størrelsen af fisken og i hvilket omfang det var bedøvet korrekt. Det er normalt varierer fra 5 til 20 pi. Når blodet standser coming ud overføre forsigtigt aspirerede blodet ind i et rør.
- For at undgå hæmolyse, er det kritisk, at røret med blod i det håndteres meget forsigtigt, uden drastiske bevægelser, indtil den er placeret i centrifugen.
- For at undgå hæmolyse, er det også vigtigt, at blodprøven skal fastgøres i centrifugen inden for 10 minutter efter opsamling af blod.
- Om nødvendigt er det muligt at kombinere blod fra mere end en dyr, hvilket gør en pool. Samleprøver vil fungere fint, så længe forsinkelsen mellem tapning af blod fra den første fisk og centrifugering ikke overstiger 10 minutter.
- Når blodopsamling udføres, centrifugeres blodet i 10 minutter ved 0,5 g (Eppendorf Centrifuge 5415D).
- Efter centrifugering er serum ved det øverste lag af røret. Med en pipette, opsug serum, og sørg for at få lige serum samtidig holde begge lag godt opdelt og stabilt.
- Overføre serum i en ny mikrorør, og deter klar til anvendelse i biokemiske analyser. Serum kan opbevares på is, mens det vente med at de biokemiske analyser.
- Hvis serum ikke vil blive anvendt umiddelbart, kan det fryses ved -18 ° C i op til cirka 3 måneder.
2. Repræsentative resultater
Det var muligt at indsamle 5-20 pi helblod fra hver fisk hvad repræsenterer endnu 4 gange mere blod end tidligere beskrevne teknikker (tabel 2). Biokemisk analyse af total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol og triglycerider blev udført efter blodopsamling anvendelse af denne teknik. To grupper af begge køn fisk blev fastet i 24 timer før blodprøvetagning at undgå fødeindtagelsen interferens. Analyserne blev udført med små-skalerede kolorimetriske test (Labtest Diagnostica SA, Brasilien) for total kolesterol og triglycerid analyser, blev 3 gl serum, der anvendes. For LDL-cholesterol og HDL-cholesterolanalyse, 4 pi og 10 pi serum blev anvendt henholdsvis. Disse analyser blev udført på puljede prøver af 10 zebrafisk per prøve.
Serum lipid niveauer blev sammenlignet mellem fisk, adgang til deres egne æg, og dem, der, i en bund dækket akvarium, ikke har haft adgang til deres egne æg til en eksperimentel varighed på 2 uger. Serum analyse viste, at serum-niveauer af total kolesterol (med æg 362 ± 42 mg / dl og uden æg 357 ± 13 mg / dl), HDL-kolesterol (med æg 91,22 ± 1,79 mg / dl og uden æg 72,14 ± 2,89 mg / dl), og LDL-kolesterol (med æg 55,68 ± 10,88 mg / dl og uden æg 44,18 ± 9,84 mg / dl) var ikke signifikant forskellig mellem grupperne. Imidlertid triglyceridniveauer var signifikant lavere i den eksperimentelle gruppe (uden æg 292 ± 64 mg / dL) end i kontrolgruppen (med æg 457 ± 25 mg / dl, P = 0,03).
| & Nbsp; | Med adgang til æg | Uden adgang til æg |
| Total cholesterol (mg / dL) | 362,82 ± 73,11 | 357,69 ± 23,08 |
| LDL - kolesterol (mg / dl) | 55,69 ± 18,84 | 44,19 ± 17,05 |
| HDL - kolesterol (mg / dl) | 91,23 ± 3,11 | 72,14 ± 5,01 |
| Triglycerider (mg / dl) | 457,64 ± 43,78 * | 292,36 ± 111,28 |
Tabel 1. Kolesterol og triglycerider seric niveauer for begge undersøgte grupper (med adgang til æg og uden adgang til æg) udtrykt i gennemsnit ± standardafvigelse.
* Statistisk signifikant (P = 0,03). Student t-test.
| Aut hors | Place of snit | Harvest metode | Anæstesi | Mængden af indsamlet blod |
| Jagadeeswaran et. al. 1999 Murtha et al., 2003 | Micro dissektion posterior til rygfinne | Mikropipette | Ikke nævnt MS222 3% i koldt vand | 1 en 5 ul 5 en 10 ul |
| Eames et al., 2010 | Halshugning | Micro kapillærer rør | MS222 0,02% 28 ° C vand | 5 en 10 ul |
| Denne undersøgelse | Incision mellem gatfinnen og halefinnen | Mikropipette og lav retention spidser | Vand og is chips | 5 en 20 ul |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel præsenterer en simpel teknik, der giver yderligere blod og serum analyse i zebrafisk eksperimenter. Denne teknik har potentialet til at bidrage til fremtidige zebrafisk hæmatologiske undersøgelser, der kræver blod parameterdata. Det bør også tillade større anvendelser af zebrafisk som en eksperimentel model.
Denne teknik kræver ikke særlige evner eller gennemførelse af en præcis teknik. Desuden sætter sig to gange den mængde blod, der skal opsamles i forhold til andre teknikker, hvorved for anvendelse af færre fisk for at opnå den nødvendige mængde af biologisk materiale. Teknikken har en kritisk fase, som er, at de blodprøver skal håndteres forsigtigt, da zebrafisk blodet kan medføre hæmolyse meget let. Den tidsforsinkelse mellem blodprøvetagning og centrifugering skal være strengt begrænset. En 10-minutters grænsen skal forhindre hæmolyse. Hastigheden og varigheden af centrifugering (0,5 g i 10 minutter) Should også følges nøje.
Andre blodprøvetagning teknikker blev forsøgt før denne teknik blev udviklet. Imidlertid er antallet af anvendte dyr var store og meget små mængder blod blev opsamlet fra hver fisk. Denne nye teknik tillod anvendelse af færre dyr, viste sig at være muligt med lav Færdighedsniveau praktiserende læger, og gav bedre resultater end andre teknikker med hensyn til mængden af blod fra hver fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
FIPE / HCPA - Fundo de Incentivo en Pesquisa e Eventos
Capes - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
- Schneider, A. C. R., dos Santo, J. L., Porawski, M., Schaefer, P. G., Maurer, R. L., Matte, U., da Silveira, T. R. Implementação de um novo modelo de experimentação animal Zebrafish. Rev. HCPA. 29, 100-103 (2009).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 282, 3-9 (2002).
- Menke, A. L., Sptsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P. M., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of adult Zebrafish. Toxicologic Pathology. 000, 1-16 (2011).
- Murtha, J. M., Qi, W., Keller, E. T. Hematologic and serum biochemical values for Zebrafish. Comp. Med. 53, 37-41 (2003).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br. J. Haematol. 107, 731-738 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P.
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Kilpatrick, E. S., Rumley, A. G., Rumley, C. N. The effect of haemolysis on blood glucose meter measurement. Diabet. Med. 12, 341-343 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (42), e2126 (2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L.
