Summary
본 논문은 Zebrafish의 지느러미 대동맥에서 혈액을 수집하는 기술을 선물한다. 그것은 또한 콜레스테롤과 트리 글리세 라이드 수준을 결정하기위한 시험과 같은 생화 학적 분석에 사용을 위해 혈청을 얻기위한 지침을 제공합니다.
Abstract
zebrafish는 여러 인간의 질병 연구를위한 동물 모델로 사용되었습니다. 그것은 분자 이벤트 및 치료 전략의 공부뿐만 아니라 일부 pathologies 1의 생리적 메커니즘을 평가하기위한 강력한 잠복기 플랫폼으로 검색할 수 있습니다.
연구자들이 zebrafish 시스템의 탐사를 허용하는 데 필요한 기본적인 기법 3 부족한 것을 추측하는 위험성이있다 장기 및 시스템 2의 성인 zebrafish의 생리학에 관련된 상대적으로 몇 가지 간행물이 있습니다. zebrafish의 Hematologic 생화학 값은 첫 번째 1999 년 Jagadeeswaran 및 동료에 의해 기술된 혈액 수집 기술을 채용 Murtha 및 동료의 사에 의해 2003 년에보고되었다. 간단히, 혈액은 길이 약 0.3 cm는 지느러미 대동맥 5 지역에서, 가로 절개를 통해 micropipette 팁 통해 수집되었다. 참여하는 순간 차원이 때문에고도로 숙련된 실천을 요구하는 고정밀도의 기술이다. 동일한 기술은 같은 해에 6에있는 다른 간행물에 동일한 그룹에 의해 사용되었다. 2010 년에는 Eames와 동료 zebrafish 7 전체 혈당 수준을 평가. 그들은 가위로 해고당하는 것까지을 수행하고 가슴 분절로 heparinized microcapillary 수거 튜브를 삽입하여 혈액에 접속할 수있었습니다. 그들은 작품 Kilpatrick 외 토대로 적절한 보관 온도로 해결되었다 용혈 어려움을 언급. 8. 저희 연구실에서 Jagadeeswaran의 기술을 사용하려고 시도하면, 우리는 모음이 시작되기 전에 손실되는 혈액의 상당량을 허용하지 않기로 정확하게 올바른 장소에 절개를 만들기 위해 어려운 것으로 나타났습니다.
최근 굽타 외 9.는 성인 zebrafish 기관, Kinkle 외 해부하는 방법을 설명했다. 10 intraperiton을 수행하는 방법을 설명eal 주사, 그리고 Pugach 외. 11 역전사 궤도 주사를 수행하는 방법을 설명했다. 그러나, 더 많은 작품은보다 완벽하게 zebrafish 연구를위한 기본적인 기술을 탐구하는 데 필요합니다.
zebrafish의 작은 크기는 실험 모델로 이용하여 연구자에 대한 도전을 선물한다. 또한 규모의이 소 주어, 그것은 단순한 기술이 연구자들이 zebrafish 모델의 장점을 탐험 수 있도록 개발된 것이 중요합니다.
Protocol
1. 프로토콜 텍스트
- zebrafish 혈액을 수집하기 전에 anesthetizing 물을 준비할 필요가 있습니다. 500 ML 용량의 용기에 수족관 물 ~ 200 ML 하거라. 얼음 칩의 ~ 200g을 추가합니다. 온도는 4 ° C.에 대해이어야합니다 얼음 조각이 녹아 때문에, 4 ° C. 가까운 일정한 온도를 유지하는 것이 더 아이스 칩을 추가할 필요합니다
- anesthetizing 물이 준비되면, 혈액 수집에 필요한 자료를 준비합니다. P20 pipettor에 낮은 유지 팁을 넣고 그것을 쉽게 액세스할 수 pipettor 둡니다. 피펫 팁은 오염에 대한 소스로 연락하도록 허용하지 마십시오.
- 마른 거즈 한 조각과 페트리 접시를 덮어. 강철 칼날과 거즈의 다른 조각이 쉽게 접근할 장소에 배치해야합니다.
- 플라스틱 튜브에 맞게 원심 분리기가 필요합니다.
- 상기 자료를 준비하면 anesthetized 재치로 첫 번째 zebrafish를 캡처헥타르 낚시 그물과 마취에 대비되어 물속에 그것을 풀어주고있다. Zebrafish는 차가운 물에 3-6의이 물고기에 따라 anesthetized해야합니다. 그것이 더 이상 외부 자극에 응답 없을 때까지 차가운 물에 물고기를 유지.
- 낚시 그물을 사용, 거즈의 꼬리를 떠나, 거즈의 준비된 조각에 anesthetized 물고기를 넣습니다. 오직 꼬리를 빠뜨린 생선의 머리와 몸 위에 거즈를 접으십시오. 배양 접시에 거즈로 덮여 생선을 넣어.
- 단지 항문 지느러미와 꼬리 지느러미 사이에 대각선 절개를 만들기 위해 강철 칼날을 사용합니다. 피가 나올 시작합니다. 이 시점에서 그것은 신속하게 일할 필요가 있습니다.
- 부드럽게는 P20의 pipettor (낮은 유지 팁과 함께 미리로드)와 함께 나오는 혈액을 열망. 수집될 수있는 혈액의 양은 생선의 크기에 무엇을 제대로 anesthetized 것을 어느 정도까지 달려있다. 그것은 보통 5 ~ 20 μl에 따라 다릅니다. 혈액은 C를 멈추면아웃 oming, 부드럽게 튜브로 했잖아요 혈액을 전송합니다.
- 용혈을 피하기 위해, 그것은 원심 분리기에 배치 될때까지 피가 묻어있는 튜브가 어떤 과감한 움직임없이 매우 신중하게 처리하는 것이 중요합니다.
- 용혈을 피하기 위해서는 혈액 샘플은 혈액의 10 분 이내에 원심 분리기에 확보하는 것이 또한 중요합니다.
- 필요하다면, 그것은 수영장을 만드는 하나 이상의 동물에서 혈액을 결합할 수 있습니다. 풀링된 샘플은 첫 번째 물고기와 원심 분리의 혈액 사이의 지연 시간이 10 분을 초과하지 않는만큼 잘 동작합니다.
- 혈액 수집이 완료되면, 0.5 G (Eppendorf의 원심 5415D)에서 10 분 동안 혈액을 원심 분리기.
- 원심 분리 후, 혈청 튜브의 상단 레이어에 있습니다. 피펫으로 두 레이어가 잘 나누어하고 안정적인 유지하면서 단지 혈청을 받아보실 만드는 혈청 기음.
- 새로운 microtube에 혈청을 전송하고생화 학적 분석에 사용될 준비가되어 있습니다. 이것은 생화 학적 분석을 시작 기다리는 동안 혈청은 얼음에 저장할 수 있습니다.
- 혈청은 즉시 사용하지 않을 경우에는, 약 3 개월 -18시 ° C에 냉동 수 있습니다.
2. 대표 결과
그것은 이전에 설명한 기법 (표 2)보다 4 배 더 많은 혈액을 상징하는 그 무엇을 각 생선 전체 혈액의 5-20 μl를 수집하는 것이 가능했습니다. 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 트리 글리세 리드의 생화 학적 및 분석이 기법을 사용하여 혈액 후에 수행되었다. 혈액 수집은 식품 섭취량의 간섭을 피하기 위해 전에 남녀 물고기 두 그룹은 24 시간 동안 금식했습니다. 분석은 총 콜레스테롤 및 트리 글리세 라이드 분석을위한 작은 비늘 colorimetric 테스트 (Labtest Diagnóstica SA, 브라질) 다 있었는데, 혈청 중 3 μl가 사용되었습니다. LDL-콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤의 경우분석, 4 μl 및 혈청 10 μl는 각각 사용 하였다. 이러한 분석은 시료 당 10 zebrafish의 풀링된 샘플에서 수행되었다.
세럼 lipidic 수준은 자신의 계란과 하단 커버 수족관에서 2 주 실험 기간 동안 자신의 달걀에 대한 액세스 권한이없는거야, 이들을 액세스할 생선 사이에 비교했다. 세럼 분석 보여주 그 혈청 총 콜레스테롤 수치 (계란 362 ± 42 밀리그램 / DL와 계란 357없이 ± 13 밀리그램 / DL), HDL-콜레스테롤 (달걀 91.22 ± 1.79 밀리그램 / DL과 계란 72.14없이 ± 2.89 밀리그램 / DL) 및 (계란 55.68 ± 10.88 MG / DL과 계란 44.18 ± 9.84 밀리그램 / DL 제외) LDL-콜레스테롤은 그룹간에 크게 다를하지 않았다. 그러나, 트리 글리세 라이드 수준은 (; P = 0.03 달걀 457 ± 25 밀리그램 / DL 포함) 컨트롤 그룹에서보다 (계란 292 ± 64 밀리그램 / DL없이) 실험 그룹에서 상당히 낮은 있었다.
| & NBSP; | 계란에 접근할 수있는 | 계란에 액세스하지 않고 |
| 총 콜레스테롤 (MG / DL) | 362.82 ± 73.11 | 357.69 ± 23.08 |
| LDL - 콜레스테롤 (MG / DL) | 55.69 ± 18.84 | 44.19 ± 17.05 |
| HDL - 콜레스테롤 (MG / DL) | 91.23 ± 3.11 | 72.14 ± 5.01 |
| 트리 글리세 리드 (MG / DL) | 457.64 ± 43.78 * | 292.36 ± 111.28 |
표 1. 두 연구 그룹에 대한 콜레스테롤과 트리 글리세 리드 seric 수준 (계란에 대한 액세스 권한이있는 계란에 대한 접근없이) 평균 ± 표준 편차로 표현.
* 통계적으로 의미 (P = 0.03). 학생 t 시험.
| AUT hors | 절개의 장소 | 수확 방법 | 마취 | 수집된 혈액의 금액 |
| Jagadeeswaran 동부 표준시. 알., 1999 Murtha 외., 2003 | 지느러미 지느러미에 미세 절개의 후부 | Micropipette | 언급되지 차가운 물에 MS222 3퍼센트 | 한 5 μl 5 10 μl |
| Eames 외., 2010 | 목베기 | 마이크로 모세관 튜브 | MS222 0,02 % 28 ° C 물 | 5 10 μl |
| 현재의 연구 | 항문 지느러미와 꼬리 지느러미 사이에 절개 | Micropipette과 낮은 유지 도움말 | 물과 얼음 칩 | 5 20 μl |
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Discussion
본 논문은 zebrafish 실험에 더 이상 혈액 및 혈청 분석을 수있는 간단한 방법을 제공합니다. 이 기술은 혈액 매개 변수 데이터를 필요로하는 미래의 zebrafish hematologic 연구에 기여할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그것은 또한 실험적인 모델로서 zebrafish의 큰 어플 리케이션을 위해 허용해야합니다.
이 기술은 특별한 기술이나 정밀한 기술의 구현을 필요로하지 않습니다. 또한, 그것으로써 생물 학적 물질 필요한 양을 얻을 적은 생선을 사용할 수 있도록 이중 최대의 다른 기술에 상대적으로 수집되는 혈액의 양을 수 있습니다. 기술은 zebrafish의 피가 아주 쉽게 용혈이 발생할 수 있으므로 혈액 샘플을 신중하게 처리하는 것이 한개 중요한 단계를 가지고 있습니다. 혈액 수집 및 원심 분리 사이의 시간 지연은 엄격하게 제한해야합니다. 10 분 제한이 용혈을 방지해야합니다. 원심 분리의 속도와 지속 시간 (10 분 0,5 G) 수오주민 등록증도 엄격히 수 있습니다.
이 기법이 개발되기 전에 다른 혈액 수집 기법 시도했다. 그러나, 사용되는 동물의 숫자는 혈액의 크고 매우 작은 양의 각 생선에서 수집한 있었지. 적은 동물의 사용을 허용이 새로운 기술은, 낮은 기술 수준의 실무자와 실현 가능한 것으로 입증하고 각 생선에서 수집한 혈액의 양 측면에서 다른 기술보다 더 나은 결과를 준되었다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
FIPE / HCPA - Fundo 드 Incentivo Pesquisa 전자 Eventos
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
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