Summary
Эта статья представляет собой технику для сбора крови из спинной аорты данио рерио. Он также содержит инструкции для получения сыворотки для использования в биохимических анализов, таких как тесты для определения уровня холестерина и триглицеридов.
Abstract
Данио был использован в качестве животной модели для изучения нескольких заболеваний человека. Это может служить мощным доклинических платформы для изучения молекулярных событий и терапевтических стратегий, а также для оценки физиологических механизмов некоторых патологий 1.
Есть относительно небольшое число публикаций, связанных с физиологией взрослые данио органов и систем 2, что может привести исследователей к выводу, что основные приемы необходимы, чтобы исследование системы данио не хватает 3. Гематологические биохимических показателей данио были впервые опубликованы в 2003 году Мурта и его коллеги 4, которые использовали метод сбора крови впервые описал Jagadeeswaran и его коллеги в 1999 году. Короче говоря, кровь была собрана с помощью пипетки кончик через боковой разрез, примерно 0,3 см в длину, в области спинной аорты 5. В связи с минуту размеры участие, этоявляется высокоточной техники требует высококвалифицированного врача. Та же самая техника была использована та же группа в другой публикации в том же году 6. В 2010 году Эймс и его коллеги оценивали все уровни глюкозы в крови у данио 7. Они получили доступ к крови, выполняя обезглавливания с ножницами, а затем вставить гепаринизированной микрокапиллярных трубы коллекции в грудной артикуляции. Они отмечают трудности с гемолизом, которые были решены с соответствующей температуры хранения на основе работы Килпатрик и соавт. 8. При попытке использовать метод Jagadeeswaran в нашей лаборатории, мы обнаружили, что это было трудно сделать разрез в точно в нужное место, как не допустить значительного количества крови к потере до сбора может быть запущен.
В последнее время Гупта и др. 9. Описал, как анализировать взрослого органов данио, небольшой изгиб и др. 10. Описано, как выполнять intraperitonEAL инъекций, и Пугач и др. 11. описано, как выполнить ретро-орбитальной инъекций. Тем не менее, многое еще предстоит сделать, чтобы более полно изучить основные методы исследования в данио.
Небольшой размер данио создает проблемы для исследователей, используя его в качестве экспериментальной модели. Кроме того, учитывая эту малость масштаба, важно, что простые методы разработаны, чтобы позволить исследователям изучить преимущества данио модели.
Protocol
1. Текст протокола
- Перед сбором данио крови, необходимо подготовить обезболивающим воды. Налейте ~ 200 мл аквариумной воды в емкость с 500 мл. Добавить ~ 200 г кусочки льда. Температура должна быть около 4 ° C. Как кусочки льда растает, нужно будет добавить больше фишек льда для поддержания постоянной температуры около 4 ° C.
- Когда обезболивающее воды готова, подготовить материалы, необходимые для сбора крови. Положите низким сохранение отзыв на P20 пипетки и оставить пипетки, где она может быть легко доступны. Не допускайте, пипетки, чтобы связаться с любых источников загрязнения.
- Накройте чашку Петри с куском сухой марли. Стальным лезвием, а другой кусок марли должен быть помещен в легко доступном месте.
- Центрифуга адаптированы для пластиковых труб будет необходимо.
- Когда вышеупомянутые материалы готовы, захватить первый данио, чтобы быть под наркозом остроумиега рыболовную сеть и отпустить его в воду, которая была подготовлена для анестезии. Данио рерио требуется 3-6 с в охлажденную воду, чтобы быть под наркозом, в зависимости от рыбы. Хранить рыбу в холодной воде, пока она не реагирует на внешние раздражители.
- С помощью рыболовной сети, поместите под наркозом рыбу на подготовленный кусок марли, оставляя хвост прочь марлю. Сложите марлю над головой рыбы и тела, оставляя только хвост ее. Положите рыбу покрытые марлей на чашке Петри.
- Используйте стальным лезвием, чтобы диагональ разрез только между анальным плавником и хвостовым плавником. Кровь начнет выходить. В этот момент необходимо работать быстро.
- Осторожно стремятся кровь, которая выходит с пипетки P20 (предварительно загружены с низким кончик удержание). Количество крови, которые могут быть собраны в зависимости от размера рыбы и в какой степени, что под наркозом правильно. Это обычно колеблется от 5 до 20 мкл. Когда кровь останавливается сoming из, мягко передать стремился кровь в пробирку.
- Для того чтобы избежать гемолиза, очень важно, чтобы трубка с кровью в ней обращаться очень осторожно, без резких движений, пока она не помещается в центрифугу.
- Для того чтобы избежать гемолиза, также важно, что пробы крови были закреплены в центрифуге в течение 10 минут для сбора крови.
- При необходимости можно объединить кровь из более чем одного животного, что делает бассейн. Объединенные образцы будут работать нормально до тех пор, как задержка между забора крови из первых рыб и центрифугирования, не превышает 10 минут.
- Когда сбор крови не будет сделано, центрифуги крови в течение 10 минут в 0,5 г (центрифуга Eppendorf 5415D).
- После центрифугирования сыворотки на верхний слой трубы. С помощью пипетки, аспирации в сыворотке крови, следя, чтобы получить только в сыворотке крови, сохраняя при этом оба слоя хорошо разделены и стабильной.
- Трансфер в сыворотке крови в новый микропробирок иготов для использования в биохимических анализах. Сыворотка может храниться во льду при его ждать, чтобы начать биохимических анализов.
- Если сыворотка не будет использоваться сразу, могут быть заморожены при температуре -18 ° C до примерно 3 месяца.
2. Представитель Результаты
Можно было собрать от 5 до 20 мкл цельной крови из каждой рыбы, что представляет даже в 4 раза больше крови, чем ранее описанные методы (табл. 2). Биохимический анализ общего холестерина, холестерина ЛПВП, ЛПНП-холестерина и триглицеридов были проведены после забора крови с помощью этой техники. Две группы, как рыба полов не кормили в течение 24 часов до забора крови, чтобы избежать помех приема пищи. Анализы были проведены с мелкомасштабных колориметрических тестов (Labtest Диагностика SA, Бразилия) Для полного анализа холестерина и триглицеридов, 3 мкл сыворотки были использованы. Для LDL-холестерина и ЛПВП-холестеринаанализ, 4 мкл и 10 мкл сыворотки были использованы, соответственно. Эти исследования проводились на объединенных пробах из 10 данио в образце.
Сыворотка липидный уровней по сравнению с рыбой, что доступ к их собственные яйца, и те, что в нижней покрыта аквариум, не имеют доступа к своим яйца для экспериментального продолжительностью 2 недели. Сыворотка анализ показал, что в сыворотке крови уровня общего холестерина (с яйцами 362 ± 42 мг / дл и без яиц 357 ± 13 мг / дл), HDL-холестерина (с яйцами 91,22 ± 1,79 мг / дл и без яиц 72,14 ± 2,89 мг / дл) и LDL-холестерина (с яйцами 55,68 ± 10,88 мг / дл и без яиц 44,18 ± 9,84 мг / дл) существенно не различались между группами. Тем не менее, уровни триглицеридов были значительно ниже в экспериментальной группе (без яиц 292 ± 64 мг / дл), чем в контрольной группе (с яйцами 457 ± 25 мг / дл, p = 0,03).
| И НБСр; | Имея доступ к яйцами | Без доступа к яйцами |
| Общий уровень холестерина (мг / дл) | 362,82 ± 73,11 | 357,69 ± 23,08 |
| LDL - холестерин (мг / дл) | 55,69 ± 18,84 | 44,19 ± 17,05 |
| HDL - холестерин (мг / дл) | 91,23 ± 3,11 | 72,14 ± 5,01 |
| Триглицериды (мг / дл) | 457,64 ± 43,78 * | 292,36 ± 111,28 |
Таблица 1. Холестерин и триглицериды Серик уровни для обеих исследованных группах (с выходом на яйца и без доступа к яйца), выраженная в среднее ± стандартное отклонение.
* Статистически значимое (р = 0,03). Тест Стьюдента.
| Aut закуски | Место разреза | Урожай метод | Анестезия | Объем собранной крови |
| Jagadeeswaran и др.. др.., 1999 Мурта и соавт., 2003 | Micro задней рассечение на спинном плавнике | Микропипетки | Не упоминается MS222 3% в холодной воде | 1 в 5 мкл 5 в 10 мкл |
| Эймс и соавт., 2010 | Обезглавливание | Micro капилляров трубы | MS222 0,02% 28 ° С водой | 5 в 10 мкл |
| Настоящее исследование | Разрез между анальным плавником и хвостовым плавником | Микропипетки и низкая задержка советы | Вода и кусочки льда | 5 в 20 мкл |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья представляет собой простой способ, который позволяет еще больше крови и сыворотки анализ рыбок данио экспериментов. Эта технология имеет потенциал внести свой вклад в будущее данио гематологические исследования требуют данных параметров крови. Необходимо также обеспечить большую применения данио качестве экспериментальной модели.
Этот метод не требует специальных навыков или осуществления точной техникой. Кроме того, он обеспечивает до двойного количества крови, которые должны быть собраны по сравнению с другими методами, тем самым позволяя использовать меньшее число рыб для получения необходимого количества биологического материала. Техника имеет один важный шаг, который является то, что образцы крови обращаться осторожно, как данио крови может нести гемолиза очень легко. Задержка между сбором крови и центрифугирование должно быть строго ограничено. 10-минутный лимит должен предотвратить гемолиз. Скорость и продолжительность центрифугирования (0,5 г в течение 10 минут) шоуД. также должны строго соблюдаться.
Другие методы сбора крови были попытки, прежде чем этот метод был разработан. Тем не менее, число животных, используемых была большая и очень небольшое количество крови были взяты у каждой рыбы. Этот новый метод позволяет использовать меньшее число животных, было доказано, что возможно с низким уровнем квалификации практикующих, и дала лучшие результаты, чем другие методы, с точки зрения количества крови, взятой из каждой рыбы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
FIPE / HCPA - Fundo де Incentivo Pesquisa электронной Eventos
CAPES - Coordenação-де-де Aperfeiçoamento Pessoal де Nivel улучшенный
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
- Schneider, A. C. R., dos Santo, J. L., Porawski, M., Schaefer, P. G., Maurer, R. L., Matte, U., da Silveira, T. R. Implementação de um novo modelo de experimentação animal Zebrafish. Rev. HCPA. 29, 100-103 (2009).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 282, 3-9 (2002).
- Menke, A. L., Sptsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P. M., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of adult Zebrafish. Toxicologic Pathology. 000, 1-16 (2011).
- Murtha, J. M., Qi, W., Keller, E. T. Hematologic and serum biochemical values for Zebrafish. Comp. Med. 53, 37-41 (2003).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br. J. Haematol. 107, 731-738 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P.
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Kilpatrick, E. S., Rumley, A. G., Rumley, C. N. The effect of haemolysis on blood glucose meter measurement. Diabet. Med. 12, 341-343 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (42), e2126 (2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L.
