Summary
Werkwijze voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen beschreven. We maken gebruik van TVA specificiteit van een upstream cel te peilen of een cel populatie van belang synaptische input van genetische gedefinieerde celtypes ontvangt.
Abstract
Klassieke methodes voor het bestuderen van neuronale circuits zijn vrij geringe capaciteit. Transsynaptic virussen, met name de pseudorabies (PRV) en rabiësvirus (RABV), en meer recent vesiculair stomatitis virus (VSV), voor het bestuderen schakelingen, wordt steeds populairder. Deze hogere doorvoersnelheid methoden gebruiken virussen die overbrengen tussen neuronen in zowel de anterograde of retrograde richting.
Onlangs werd een aangepaste RABV voor monosynaptic retrograde tracing ontwikkeld. (Figuur 1A). In deze methode wordt het glycoproteïne (G) gen verwijderd uit het virale genoom en alleen in bevoorraad gerichte neuronen. Infectie specificiteit wordt bereikt door het substitueren van een chimeer G, bestaande uit het extracellulaire domein van de ASLV-A glycoproteïne en het cytoplasmatische domein van de G-RABV (A / RG) voor de normale RABV-G 1. Deze chimere G infecteert specifiek cellen die de TVA-receptor 1. Het gen dat codeert TVA kan zijn delivered op verschillende manieren 2-8. Na RABV-G infectie van een TVA-expressie neuron kan de RABV verzenden naar andere, synaptisch verbonden neuronen in een achteruitgaande richting van nature eigen G was geleverd samen met TVA receptor. Deze techniek labels een relatief groot aantal ingangen (5-10%) 2 op een bepaald celtype, die een bemonstering van alle ingangen op een bepaald celtype starter.
We hebben onlangs gemodificeerd deze techniek VSV als een tracer transsynaptic 9. VSV heeft een aantal voordelen, waaronder de snelheid van genexpressie. Hier hebben we detail een nieuwe virale tracing systeem met behulp van VSV nuttig voor het sonderen van microcircuits met verhoogde resolutie. Terwijl de oorspronkelijke gepubliceerde strategieën Wickersham et al.. 4 en Beier et al.. 9 vergunning etiket van neuronen die aanvankelijk op geïnfecteerd TVA-expressie-cellen hier VSV werd ontworpen om slechts aan TVA-expressie brengende cellen (Figuur 1B). Het virus wordt eerst met pseudogetypeerd RABV-G infectie van neuronen stroomafwaarts van TVA-expressie neuronen mogelijk. Na het infecteren deze eerste populatie van cellen, het virus infecteren model alleen TVA tot expressie brengende cellen. Omdat de transsynaptic virale verspreiding beperkt tot TVA tot expressie brengende cellen, of afwezigheid van connectiviteit van gedefinieerde celtypes kunnen worden onderzocht met hoge resolutie. Een experimentele stroomschema van deze experimenten wordt getoond in Figuur 2. Hier laten we een model circuit, dat van richting-selectiviteit in de muis retina. We onderzoeken de connectiviteit van starburst amacrine cellen (SBZ) aan retinale ganglioncellen (RGC).
Protocol
1. Virus maken van cDNA: Terugwinning van VSV uit cDNA met Vaccinia-T7 System 10
- Een dag voor experiment, BsrT7 cellen verdeeld in 60 mm schaaltje met DMEM + 10% FBS. Zaad 2E6 cellen per schaal. BsrT7 cellen afkomstig zijn van BHK21 of babyhamsterniercellen cellen.
- Warm PBS met 1 mM magnesium en 1 mM calcium tot 37 ° C.
- Aanschaffen kleine hoeveelheid vTF7-3, een vaccinia virus dat T7 polymerase en ontdooien tot kamertemperatuur. vTF7-3 is een besmettelijke vacciniavirus de uiting van de T7-polymerase 11, en mag alleen worden gebruikt in bioveiligheid inperkingsniveau 2. Deze uitdrukking wordt gebruikt om maximale niveaus van het gewenste transcripten van plasmiden getransfecteerd in stap 1,9 genereren. Vortex virus gedurende 30 seconden bij max. snelheid. Sonificeer in een tafelblad sonicator gedurende 2 minuten in een waterbad bij kamertemperatuur. Vortex nogmaals gedurende 30 seconden te breken virale klonten.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit de BSRT7 cellen.
- Voeg 11,7 ul vTF7-3tot 600 pi PBS met calcium en magnesium en voeg het mengsel op de cellen.
- Verplaatsen platen in een 34 ° C incubator met 5% CO 2. Rock platen voorzichtig een keer per 10 minuten.
- Na 45 min verstreken, beginnen transfectie. Voeg 20 ul lipofectamine 2.000 tot 1 ml DMEM en meng. Wacht 5 min.
- Voeg 5,25 ug pN, 2,3 ug pP, 1,2 pg pl, 1 ug pCAG RABV-G en 6 ug VSV genomisch cDNA van 500 ul DMEM. pN, PP en pl plasmiden zijn een expressie van VSV virale genen onder de T7 promoter 10, waarbij de bedragen empirisch bepaald voor optimale redding van het virus.
- Combineer beide buizen en meng. Wacht 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder PBS en een keer wassen van de platen met 1,5 ml DMEM.
- Zuig spoelen media. Voeg transfectie mix tot op het bord. Verplaats platen in 34 ° C incubator.
- Wacht 5 uur, verwijder media.
- Veranderingsmedia tot 4 ml DMEM + 2% FBS + 1x penicilline-streptomycine + 10 mM HEPES pH 7,4. De toevoeging van Penicillin-streptomycine, om verontreiniging te voorkomen en HEPES, de pH van de media houden, zijn zeer belangrijk. De FBS inhoud kan worden gedaald tot 2%, de cellen worden vernietigd in een paar dagen met het virus en hoeven dus geen 10% FBS.
- Plaats de platen in 34 ° C incubator gedurende 48-72 uur.
- Verzamel media na 3 en 6 dagen na transfectie, en onmiddellijk spuitfilter door een 0,20 urn filter. Deze maat filter verwijdert het vaccinia virus, maar niet de VSV.
- Aangezien we RABV-G leveren aan de virale envelop en het genoom codeert niet de RABV-G gen, moet het voortdurend worden verstrekt in trans. Om dit te doen, maak dan een aparte plaat van 293T TVA800 (TVA800) cellen. Dit zijn cellen die constitutief het TVA receptor, waardoor ENVA gemedieerde virale infectie 12. Bij 80% confluentie in DMEM media verandert alleen, dan transfecteren van de cellen met 5 pg van plasmide coderend G eiwit (dwz pCAG RABV-G) per plaat. We gebruiken de PEI transfectiereagens, een polykationisch polymeer dat veel goedkoper is dan vergelijkbare lipide-gebaseerde methoden. Echter, lipofectamine ook effectief worden gebruikt voor dit doel. De optimale PEI: DNA-verhouding moet empirisch worden bepaald. Doe dit in een afzonderlijk experiment met een fluorescerende reporter, dat wil zeggen pCAG GFP. We 10 ul PEI: 4 pg DNA.
- Breng het supernatans van stap 16 op de getransfecteerde plaat van TVA800 cellen.
- Let op deze plaat de volgende dag voor het bewijs van de fluorescentie van het viraal uitgedrukt fluorofoor. Virale fluorescentie wordt eerst waargenomen als een enkele cel, en geleidelijk verspreidt over tijd (Figuur 3). Het virus zou verspreiden binnen een paar uur.
2. Passage en Concentratie van VSV
- Splitsen TVA800 cellen in media met DMEM + 10% FBS, zodat u vier 10-cm platen bij ongeveer 80% confluentie worden de volgende dag. 293T-gebaseerde cellen werken goed als gevolg van hun hoge transfectability, en het gebruik van TVA tot expressie brengende cellen verhoogt de snelheid waarmee de cellen in de schaal geïnfecteerd. Andere zeer transfecteerbare cellijnen kan dienen het doel ook.
- Bij 80% confluentie in DMEM media verandert alleen, dan transfecteren van de cellen met 5 pg van plasmide coderend voor het G-eiwit gewenste te gebruiken (pCAG RABV-G) per plaat. We maken gebruik van PEI, maar Fugene / Lipofectamine zo goed werkt.
- Wacht een dag na de transfectie voor glycoproteïne expressie / oppervlak accumulatie. Verander de media (5 ml / plaat) in DMEM + 10% FBS, vervolgens infecteren met rVSV (A / RG) virus bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,01 <x <0,1.
- Controleer de hoeveelheid infectie 24 uur later. U ziet geïnfecteerde cellen (geïdentificeerd door GFP fluorescentie), sommige met aangrenzende stukken geïnfecteerde cellen (bijvoorbeeld figuur 3). Typisch is het alleen de moeite waard het verzamelen van de supernatant als je> 50% van de cellen die zijn geïnfecteerd, anders wordt de virale titers obtained concentratie van suboptimaal.
- Als> 50%, het verzamelen van de 5 ml van media / plaat, en te vervangen door 5 ml vers medium. Als er te weinig cellen worden geïnfecteerd, wachten op een andere 12 tot 24 uur, en controleer opnieuw. Bevriezen de verzamelde supernatanten bij -80 ° C.
- Daarna elke 24 uur verzamelen gedurende 3 dagen voor een totaal van 4 dagen.
- In totaal, als je begon met 4 platen, moet u 20 ml van media van elke dag - dus 80 ml totaal, of 2 ultracentrifuge buizen ter waarde van supernatant. Ontdooi de supernatanten op 37 ° C en filtreer dan 0,45 urn filters op ijs. Aliquot 36 ml virus in Beckman centrifugebuizen.
- Concentreer het supernatant (21.000 K in een SW28 rotor (= 80.000 xg) gedurende 90 min) bij 4 ° C. Giet het supernatans in een bekerglas met 10% bleekmiddel en terwijl de buis wordt omgekeerd, met een aspirator om zoveel materiaal uit de zijkant van de buis mogelijk.
- Terwijl gedekt. Schud de virale buizen bij 4 ° C gedurende 1 uur. Een standaard schudmachine bij about 120 rpm voldoende.
- Voorzichtig vermalen pellet in de overige media voorzichtig en neer te pipetteren 30 keer. Zorg dat er geen luchtbellen te introduceren. De overige media volume moet ongeveer 30 ul worden. Aliquot deze te verdelen in meerdere buizen om meerdere vries-ontdooi cycli voor een bepaald bestand voorkomen, aangezien dit kan leiden tot een afname in virale titer. Deze monsters worden ingevroren bij -80 ° C.
- Titer van het virus. Titreren tot ongeveer 2 dagen na infectie optimaal. Eerste infectie kan worden waargenomen in een kwestie van uren, maar je krijgt een ondervertegenwoordiging van titer als je wacht slechts 1 dag. Om de virale titer te verkrijgen, het uitvoeren van een experiment beperkende verdunning van de geconcentreerde virus op de geschikte cellijn (293T cellen werken well) in een 24-well plaat, verdunnen virus 10-fold 1 tot 1: 1.000.000. De titers zijn we typisch in het bereik van 10 8 -10 10 gericht vormende eenheden (FFU) / ml.
3. Virons Injectie
- We gebruiken muizen, meestal tussen 6-10 weken oud, voor deze experimenten. Elke leeftijd waarna circuit is vastgesteld volstaan. Wij opteren voor de transmissie van retinale ganglioncellen (RGC) naar starburst amacrine cellen (SAC) als voorbeeld. Dit experiment, zoals diagrammatisch weergegeven in figuur 2, is een triple transgeen dier en slechts een enkele injectie van virus. (Alle getoonde procedures werden goedgekeurd door de IACUC aan de Harvard Medical School, en waren in overeenstemming met de richtlijnen).
- Eerste, de juiste dieren moeten worden gegenereerd. Het doel is om TVA uitgedrukt in het celtype dat men wenst te opsplitsen door middel van een virus (bijvoorbeeld adeno-geassocieerd virus, AAV) of een transgene allel. De cel-specificiteit wordt gewoonlijk verkregen door Cre expressie. Hier ook gekruist in een voorwaardelijke expressie TVA allel 7 een acetyl choline (ChAT)-Cre allel 13, zodat TVA uitgedruktin alle cellen met een Cre expressie geschiedenis (de SBZ). We hebben ook gekruist een voorwaardelijke expressie tdTomato allel (R26TdT) voor visualisatie van TVA-expressie brengen.
- De coördinaten voor de injectie locatie moeten worden geïdentificeerd. Deze coördinaten van belang kan worden gevonden in de hersenen atlas, dat wil zeggen de Franklin en Paxinos hersenen van muizen atlas 14. Deze coördinaten moeten opzichte van een bepaalde landmark de muis schedel opgemerkt. We gebruiken bregma, maar elke coördinatensysteem voldoende.
- Bereid de stereotaxische apparaat. Zet de microinjector controller, en beweeg de plunjer en de elektrodehouder op zijn plaats. Dan terug-fill de injectienaald met minerale olie tot een interface met het virus te bieden. Zet dan de naald op de zuiger, en zorg ervoor dat er geen luchtbellen achterblijven in de naald.
- Ontdooi de virus en op ijs tot een daling van de virale titer te voorkomen. Stel de microinjector op "terug te trekken" en de buis van het virus te verplaatsen, zodat die contacting het capillair op de microinjector. Neem de benodigde hoeveelheid rVSV (A / RG) pseudogetypeerd met RABV-G voor het experiment.
- Dieren krijgen een pre-operatieve dosis buprenorfine (0,05-0,1 mg / kg) voor de operatie begint. Voor verdoven van het dier, hetzij isofluraan inhalatie, of een intraperitoneale injectie van een ketamine (40-80 mg / kg) en xylazine (5-10 mg / kg) mengsel voldoende. Keuze van anesthesie is afhankelijk van de gebruiker. Een teen snuifje wordt vervolgens uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de dieren volledig verdoofd, als het dier niet reageert, kunt u doorgaan met de procedure. Zorg ervoor dat u de juiste licenties te verkrijgen voor het gebruik van deze drugs.
- Dieren op een verwarmde pad, dat op een beweegbare stand gepropt voor het positioneren van de muis. Het dier blijft daar gedurende de duur van de chirurgische procedure. Toepassing oogzalf het drogen van de cornea te voorkomen terwijl het dier verdoofd.
- De muis hoofd moet dan worden gestabiliseerd in een stereotaxischpparatus. Het oor balken aan de stereotactische inrichting te waarborgen dat het hoofd volledig beveiligd, zodat de kop is parallel aan de grond en niet zijdelings draaien. Zodra dit is voltooid, stelt de beet bar te stabiliseren het hoofd.
- Het dier de vacht wordt geschoren in de regio van de incisie op de top van het hoofd. Dit gebied wordt vervolgens driemaal gewassen met ethanol, gevolgd door driemaal met jodium. Een incisie wordt dan gemaakt in de huid met een scalpel, het openbaren van de schedel.
- Zodra de muis en injectie setup bereid, bregma aanwezig moet zijn. Dit is het gebied in het midden van het vel dat de sagittale en coronale twee hechtingen aan. Zodra dit gebied ligt, kan de knoppen op de stereotactische inrichting worden gebruikt om de microinjector stel de juiste coördinaten. Hier injecteren we de laterale geniculate kern (LGN), met coördinaten A / P -2.46 van bregma, L / M 2, D / V 2.75.
- Zodra de coördinaten zijn gekozen in moet de boor worden gemonteerd.Plaats de boor in de boor, zet de boor. Een klein gat worden geboord in de plaats geïdentificeerd als de injectieplaats. Wees zeer voorzichtig met de boor om niet schade aan de hersenen parenchym veroorzaken. Wanneer het bot erg dun, bloedvaten op de dura duidelijk. Op dit punt zorgvuldig perforeren de randen van de craniotomie met een klein (30 gauge) en een fijne naald (# 5) forceps om de resterende bot te verwijderen.
- Pas de capillaire naar een positie net dorsale van de hersenen oppervlak, waar het gat net werd geboord. De naald moet scherp genoeg zijn om de dura mater te dringen met gemak. Breng de naald op de gewenste diepte en begin injectie. We injecteren virus met een snelheid van 100 nl / min.
- De injectie procedure op dit punt duurt ongeveer tien minuten. Na injectie de naald blijft in de hersenen voor ongeveer zeven minuten. Dit is belangrijk, omdat het mogelijk maakt diffusie van het virus van de injectieplaats. Snel verwijderen van de naald vormen de injectie site resulteert in een verminderde infectie-efficiëntie op de plaats van injectie en infectie langs de naald darmkanaal.
- De naald wordt zeer langzaam verhoogd van de injectieplaats, over een tijdspanne van ongeveer twee minuten. Dit is wederom bedoeld om infectie te verminderen langs de naald darmkanaal.
- Eenmaal verwijderd, wordt de huid vervolgens gehecht. Dieren worden voortdurend bewaakt totdat ze herstellen van anesthesie. Buprenorfine (0,05-0,1 mg / kg) toegediend elke 12 uur gedurende 2 dagen.
4. Oogsten Tissue / Tissue Preparation
- Voor het oogsten het weefsel van belang de optimale tijd afhankelijk van de doelstellingen van het experiment. In het algemeen kan VSV transsynaptic spread eerst waargenomen door minder dan 24 uur na injectie. Echter wachten langere tijden tot meer verspreid.
- Om het netvlies te oogsten, worden dieren eerst gedood met behulp van kooldioxide inademing en cervicale dislocatie wordt uitgevoerd. De oogbol wordt vervolgens verwijderd en geplaatst in een buis conte handhaven 4% formaldehyde in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- De oogbol wordt vervolgens geplaatst in een petrischaal met PBS. Het netvlies wordt vervolgens weggesneden uit andere weefsels.
- Voor ganse berg analyse, de retinae zijn zo gesneden om plat, geplaatst op een glasplaatje, dan gemonteerd met verlengen goud montage media en bedekt met een zero-dikte glas dekglaasje aan. Silicone afstandhouders geplaatst tussen het schuifgedeelte en het dekglaasje te minimaliseren drukkrachten op het netvlies. Voor sectie analyse wordt de retina geplaatst in 30% sucrose in PBS tot het netvlies ten onder. Wordt vervolgens in een mengsel van 50% en 50% oktober 30% sucrose oplossing gedurende 3 uur. Vervolgens wordt knipperen ingevroren en bewaard bij -80 ° C tot gebruik te snijden.
5. Representatieve resultaten
Het virus dat wordt gered van cDNA moeten kunnen TVA800 cellen, maar niet 293T-cellen (Figuur 3) infecteren. Het leveren van de RABV-G maakt de infectie van meerdere cellen tYpes, inclusief 293T. Aangezien de A / RG genoom wordt gecodeerd in het genoom, verdeeld over cellen optreedt bij een veel hogere snelheid in TVA tot expressie brengende cellen.
Zodra het virus geconcentreerd, typisch titers tussen 10 8 ffu / ml en 10 10 ffu / ml. Deze titers zijn geschikt voor gebruik in vivo.
Tijdens LGN injectie in de muis, doen we geen onderscheid dorsale LGN (dLGN) van ventrale LGN (vLGN), aangezien beide doorgaans besmet raken. Daarom raken meerdere types gelabeld RGC (figuur 4), inclusief die project de vLGN zoals melanopsine RGCs (Figuur 4D) en ON-DSGCs (Figuur 4E), en die aan het project dLGN zoals de kleine prieel RGC (Figuur 4C) en ON-OFF-DSGCs (Figuur 4F). Hoewel meer dan een type RGC overgebracht virus SACs, zoals elders beschreven (Beier et al.., In review), hier alleen richtenop de goed bestudeerde verbindingen van ON-OFF-DSGCs tot SBZ.
(-) Als we muizen van het genotype cTVA (+) / ChAT-Cre injecteren, waar geen TVA worden uitgedrukt, worden alleen RGCs gemerkt (bijvoorbeeld figuur 4). Deze zijn het gevolg van de eerste opname van de RABV-G pseudogetypeerde virus door de RGC en de verspreiding optreedt. Geen RGCs besmet door een infectie van LGN rVSV (A / RG) virus niet met pseudogetypeerd RABV-G, door een onvermogen van deze virions tot overdwarse de lange axonen van deze RGCs. Echter, bij het injecteren cTVA (+) / ChATCre (+) (en R26TdT (+)) muizen in de LGN gaat virusverspreiding optreden alleen rode cellen, die het Cre reporter (bijvoorbeeld figuur 5) te drukken. Deze cellen ook co-label met de anti-ChAT antilichaam en stratificeren gedurende maximaal twee laminae ChAT bevestigt hun identiteit als SAC (Figuren 5B ', C'). Het aantal viraal gelabeld SAC per DSGC varieerde van een tot negen.
Figuur 1. Onze retrograde transsynaptic tracering dan de oorspronkelijk ontwikkelde methode. (A) (i) In de werkwijze die door Wickersham en collega's "starter cellen" worden getransfecteerd met drie genen: het TVA receptor, die specifiek mogelijk infectie van getransfecteerde cellen, het RABV-G, gebruikt om de RABV vullen die zelf had het G-gen verwijderd en een rode fluorescerende eiwit getransfecteerde cellen. (Ii) A RABV pseudogetypeerd de A / RG eiwit infecteert TVA tot expressie brengende cellen, waardoor ze geel. (Iii) Retrograde transsynaptic overdracht plaatsvindt aan upstream neuronen. (B) (i) In onze methode worden TVA tot expressie brengende cellen genetisch bepaald en worden aangeduid met een voorwaardelijke rood fluorescerend protein (ii) De "starter cellen" zijn geïnfecteerd met een VSV codeert de A / RG gen in het virale genoom. Deze starter cellen niet drukken de TVA-receptor. (Iii) Retrograde transsynaptic overdracht plaatsvindt aan TVA-expressie neuronen alleen als deze cellen synaptische input op de starter neuronen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Schema van de experimentele procedure. (A) Eerst wordt het virus gered van cDNA. Vervolgens wordt gepasseerd en met pseudogetypeerd RABV-G, en geconcentreerd en getitreerd. Dit virus wordt dan geïnjecteerd in de hersenen, waar het is toegestaan te incuberen voor de gewenste tijdsduur. Hiernatijd wordt het oog geoogst en de retina ontleed en geanalyseerd. (B) Schematische voorstelling van pseudotypering het virus met RABV-G. Dit is noodzakelijk voor infectie van retinale ganglioncellen van hersenen injectie. De RABV-G-gen wordt eerst getransfecteerd in weefselkweek cellen die de TVA-receptor. Deze cellen worden vervolgens geïnfecteerd met het rVSV (A / RG) virus. Vrijgekomen virions zal RABV-G in de virale envelop, maar het gen voor RABV-G niet in het virale genoom. (C) Een schema van de muis kruist nodig triple transgene dieren. Voorwaardelijke TVA en tdTomato allelen gekruist met een Cre driver keuze, zodat beide TVA en tdTomato alleen worden uitgedrukt in cellen met een Cre expressie geschiedenis. In dit voorbeeld hebben we gebruik gemaakt ChAT-Cre. (D) Een schema van de retinale infectie om DSGC-SAC circuits sporen. De chat-cellen zijn gemaakt om uitdrukkelijke TVA en tdTomato, zoals in (C). RGC zijn besmet door een LGN infection van het virus geproduceerd in (B). Omdat het virus uitdrukt GFP, zullen deze RGC groen zijn. Het virus dan alleen uitbreiden tot TVA-expressie ChAT amacrine cellen als ze zijn aangesloten op de gelabelde RGC. Deze cellen zullen zowel rood en groen of geel. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Gedrag van rVSV (A / RG) virus op 293T en TVA800 cellen. Deze cellen werden geïnfecteerd met een lage titer rVSV (A / RG) pseudogetypeerd met RABV-G. Het virus spreads tussen TVA tot expressie brengende cellen in enkele uren, zoals bij 6 uur na infectie (HPI), 1 en 2 dagen na infectie (DPI). De spreiding op 293T-cellen die niet de expressie TVA receptor, hoewel ikt zich voordoen doet, gebeurt er veel trager. Schaal bar = 100 urn.
Figuur 4. Representatieve infecties van RGCs van niet-TVA expressie muizen. Dieren werden geïnjecteerd met de LGN rVSV (A / RG) virus met pseudogetypeerd RABV-G, en weefsel geoogst 2 dpi. (A) Sparse (RGC aangegeven door gele pijlpunten) of (B) dicht infecties kunnen worden verkregen, afhankelijk van de titer van virus en kwaliteit van injectie. Veel verschillende soorten RGC kan worden geïdentificeerd op basis van morfologie, met inbegrip van (C) klein prieel RGC, (D) type 1 melanopsine RGC, (E) ON-DSGCs, en (F) ON-OFF-DSGCs, onder anderen. Schaal bar = 50 um.
Figuur 5. RVSV (A / RG) overdracht van ON-OFF-DSGCs aan SBZ volgt het verwachte patroon. (A) ON-OFF-DSGCs (witte pijlpunt met groene vulling) virus overdragen naar meerdere SAC (gele pijlpunten). (A). Alle groene cellen die niet de DSGC co-label met het Cre verslaggever, wat aangeeft dat ze TVA-expressie SBZ. (BC) De DSGC (witte pijlpunt met groene vulling) en SAC (geel pijlpunten) stratificeren in de juiste ChAT lagen van het netvlies binnenste plexiform laag (IPL). De cellen waarin het virus verstuurt zowel op als buiten de SBZ. Getallen in panelen B 'en C' geven de IPL laminae. De locatie van het DSGC soma slechts aangegeven door de pijl, maar niet getoond in paneel C de SACs markeren. Schaal bar = 50 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met virussen neurale circuits studie een relatief high throughput werkwijze voor het analyseren verbonden neuronen. Echter, het genereren van zowel VSV en RABV virionen is niet triviaal. Hoewel het bovenstaande protocol voor reddings virus van cDNA wordt, is het nog steeds een lage waarschijnlijkheid event. De niveaus van elk van de N, P en L plasmiden moeten fijn worden aangepast en vele proeven en gerepliceerd moet worden gedaan om virale rescue waarborgen. De vorming van de ribonucleotide deeltjes waarin een volledige VSV-genoom RNA een lage waarschijnlijkheid event en daarom kunnen meerdere pogingen. Deze techniek kan het moeilijk te vereisen echter eenmaal is geoptimaliseerd, reddings virussen veel gemakkelijker.
Analyse van virale transmissie van individuele RGC het beste doen als RGC dendritische priëlen elkaar niet overlappen (dwz Figuur 4A). De hoeveelheid virus geïnjecteerd en injectie coördinaten kunnen worden aangepast voor een optimale infectie. Ook thij plaats van injectie beïnvloedt de aantallen en typen gemerkte RGCs (ie superior colliculus of superchiasmatic atoomkern label verschillende aantallen en soorten RGCs dan een LGN injectie).
VSV heeft een aantal voordelen ten opzichte van PRV en RABV. Het expressieniveau van VSV is zeer snel, zichtbaar binnen enkele uren 9,15. Dit maakt kortere incubatietijden. In dit experiment werd de A / RG glycoproteïne gecodeerd in het virale genoom, waardoor de virus replicatie-competent. Terwijl het replicatie-competent rabies virus maakt BL3 inperkingsniveau nodig voor VSV, alleen BL2. Het glycoproteïne kan zijn in trans in RGCs, dwz door voorafgaande infectie van AAV codeert de A / RG fusieproteïne. Echter, deze berust op dubbele infectie, en de niveaus van expressie glycoproteïne niet optimaal. Uitgedrukt van het virale genoom, het glycoproteïne niveaus fijn afgestemd als inBij wild-type VSV. Zonder de noodzaak van co-infectie met het label alle RGC hebben het potentieel voor virale transmissie. Het grote nadeel van VSV is de relatief snelle celtoxiciteit. We hebben onderzocht VSV geïnfecteerde cellen door de fysiologie en werd opgemerkt dat zij fysiologisch normale met 18 uur na infectie, maar waren te ziek fysiologische metingen te verkrijgen door 48 uur na infectie. In het algemeen, neuronen zoek morfologisch normaal voor 2-3 dagen na infectie, maar beginnen te tekenen van ziekte (blaarachtig) tonen kort daarna. Dit is na de tijd waarin transsynaptic transmissie kan worden waargenomen (24 uur). Echter, alle transsynaptic virussen, waaronder RABV en PRV, toxisch zijn voor de cellen. Daarom VSV momenteel meest geschikt voor een anatomische labelprinter, hoewel we in het proces van het beter geschikt voor fysiologische manipulaties.
VSV is een bijzonder krachtige transsynaptic neuronale tracer. Door de aard van zijn vermogen om verschillende g accepterenlycoproteins, kan het traceren neuronen in de anterograde of retrograde route 9. Hier tonen we dat het ook gebruikt kan worden om een andere vraag sonde - of een genetisch gedefinieerde celtype ingangen op een starter celpopulatie. Hier laten we zien het nut ervan in het netvlies, maar ook wij hebben het gebruikt om genetisch omschreven etiket interneuronal populaties van de hersenen, met evenveel succes. Het kan ook worden gemodificeerd om een ander glycoproteïne bevatten te transsynaptic anterograde transmissie mogelijk te TVA tot expressie brengende cellen. De mogelijkheid van verdere manipulaties biedt de mogelijkheid om verder te helpen analyseren microschakelingen en decoderen van de complexe berekeningen van neurale verbindingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Sean Whelan erkennen voor hulp bij het redden van recombinante VSV-varianten, en Didem Goz en Ryan Chrenek voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door HHMI (CLC), en # NS068012-01 (KTB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
| vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
| pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
| Media : DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
| Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
| Viral Centrifugation | |||
| Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
| Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Mouse Injection | |||
| Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
| Stereotax | Narishige | SR-5M | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
| Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| Micr–lectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
| Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| Ethanol | Sigma | 493511 | |
| Iodine | Sigma | PVP1 | |
| Surgery and Dissection tools | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Dissection and antibody staining | |||
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Antibodies | |||
| Antibodies | millipore | AB144P | |
| Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
| Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Tissue mounting | |||
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
| Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
|
|||
References
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
- Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
- Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
- Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
- Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
- Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
- Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).
- van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).
