Summary
다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.
Abstract
TH17 세포는 17 (IL-17) 인터루킨 생산하는 것으로 확인 된 T 세포의 서브 세트 별개이며, TH1, TH2, 규제 T 세포를 포함한 다른 T 세포의 서브 세트에서 기능이 다르다. TH17 세포는 많은자가 면역 질환과 관련된 지나치게 염증 면역 반응의 중심 원인으로 등장했습니다. 이 방법에서 우리는 C57BL / 6 마우스의 비장과 림프절에서 T 림프구를 정화하고, 제어 및 TH17 유도하는 환경에서 정제 된 CD4 + T 세포를 자극한다. TH17 유발 환경은 항 CD3 및 항 CD28 항체, IL-6와 TGF-β의 존재에 자극을 포함한다. 최소 72 시간 동안 배양 한 후 37 ° C에서 최대 5 일 동안 세포는 이후 세포 계측법, qPCR에, 및 ELISA를 흐름을 통해 IL-17을 생산하는 기능을 분석하고 있습니다. TH17 분화 된 CD4 + CD25-T 세포는 또한 TH17 세포가자가 면역 및 호스트 드의 발병 및 진행에서 재생하는 역할을 규명하기 위해 이용 될 수있다범법. 또한, 별개의 쥐 녹아웃 / 질병 모델에서 CD4 + CD25-림프구의 TH17 분화는 세포의 운명의 가소성에 대한 우리의 이해에 기여할 수있다.
Introduction
CD4 + T 림프구 (T 세포) 전염성 미생물에 대한 면역 체계가 중재 방어에 중요한 역할을한다. 역으로, T 세포들은 속속들이 예컨대 제 1 형 당뇨병, 전신성 홍 반성 루푸스, 류마티스 관절염과 같은자가 면역 질환의 발병 및 진행과 연관된다. CD4 + T 림프구는 T 세포 수용체 동족 항원 / 주요 조직 적합성 복합체 II (MHCII) 분자 (TCR)의 상호 작용의 결합을 통해 활성화되고, B7.1/B7.2와 CD28 수용체의 상호 작용은 15 리간드. TCR 자극 및 CD28 동시 자극의 제공뿐만 아니라, 항원 제시 세포는 또한 이에 관련 항원에 T 림프구의 응답을 연출, T 림프구의 분화 상태를 결정 사이토킨 환경을 제공한다. 고유 병원체 / 항원 제시 세포 상호 작용은 T는 엘리에 초점을 맞춘 독특한 경로를 림프구 왜곡 별개의 사이토 카인 환경을 만들고,시작 병원체의 mination. 불행하게도, 원래 병원균을 침해 근절하기 위해 디자인 된 T 림프구의 음향 경로는 잘못 자기 조직 (15)에 대항 할 수 있습니다. 따라서, 각 별개의 CD4 + T 세포의 부분 집합의 분화 상태를 더 잘 이해 병원균의 제거 및 자기 내성 사이의 균형을 조절하는 방법에 대한 우리의 이해에 중요합니다.
TH1, TH2, 및 유도 성 조절 T 세포 분화 경로 이외에, 나이브 T 림프구는 TH17 통로 다운 사이토킨에 의해 구동 될 수있다. Th1 세포 전투 세포 내 병원체 반면에, TH2 세포는 세포 외 병원균을 제거하고, 규제 T 세포 (Tregs가)는 염증 반응 하나, (16)을 최소화; TH17 세포는 세포 외 박테리아 및 곰팡이의 제거에 중요한 역할을한다. TH17 세포는 일반적 계보 특정 전사 인자 및 IL RORγT 생산의 식으로 표시된다대식 세포와 호중구 1, 7의 활성화를 촉진-17A.
TH17 세포는 여러 가지자가 면역 질환에 연루 및 관련 설치류 모델이되었다. 예를 들어,이 IL-23 (TH17 표현형을 유지하는데 요구되는) 것으로 증명되었다 아니지만 IL-12, 실험자가 면역성 뇌염 (EAE)의 중심 범인, MS를위한 설치류 질환 모델. 그것은 이후 IL-17의 생산 감소가 EAE 방지 2, 6, 17에 상관 관계가 있음을 보였다. 더욱이, TH17 세포 관절염 및 전신성 홍 반성 루푸스 (SLE) (10), (16)을 포함하는 다른 자기 면역 질환과 관련되었다. IL-23 결핍 P19 - / - 생쥐는 TH17 세포의 매우 낮은 숫자를 가지고 표시하고, EAE뿐만 아니라 개발에 저항했지만, 콜라겐 유도 관절염, 류마티스 관절염 10, 18 모델. 또, 마우스 후미 IL-17A의 중화 항체로 처리ER 콜라겐 - 유도 관절염의 발병은 또한 관절 손상 (18)의 해상도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이는 최근의 연구는 또한, 제 1 형 당뇨병으로 15, 11, 장내 염증 14 TH17 세포의 보호 역할을 나타낸 것처럼 면역 질환의 진행에 TH17 세포의 역할은 특성화 될 남아 있음을 주목해야한다. 이러한 연구는자가 면역에 TH17 차별화의 중요성을 확인합니다.
1) 정확히 어떻게 IL-6는 Treg의와 TH17 분화 사이의 균형을 조절 않으며, 2) 정확한 메커니즘은 무엇입니까 : 추가 조사가 필요 적어도 두 곤혹 질문이 있기 때문에 체외 TH17의 분화 T 세포 연구에 필요한 방법은 IL-17에 의한 염증성 질환 뒤에? 우리의 방법은 C57BL / 6 마우스의 비장 및 림프절에서 CD4 + CD25-T 세포를 이용한다. 그것은주의하는 것이 중요합니다 그것은 불순한를 사용 TH17 분화를 유도 할 수 있지만인구는 80 %의 순수한 CD4 + CD25-T 세포 인구를 획득하는 것은 오염의 걱정을 부정하고 성공 TH17 분화의 결과를 보장합니다. 적절한 TH17 감별을 달성하기 위하여, CD4 + CD25-T 세포는 각각 항-CD3 및 항-CD28, 활성화 신호를 제공하고, 1 및 2의 존재하에 배양하고, IL-06과 TGF-β. 이 IL-23 단독는 TH17 분화를 달성하는 데 사용될 수 있다고보고되었지만, 나중에 IL-23 TH17 세포군의 안정성 필요하다고 입증되었지만, IL-6, TGF-β는 TH17 분화에 필수적인 3, 18, 19. 쥐의 연구는 IL-23 수용체가 IL-6와 TGF-β 13, 18로 자극 된 후에 만 CD4 + T 세포에 발현되는 것으로 나타났습니다. 또한, TH17 세포가 성공적으로 한 IL-6와 TGF-β는 18, 19 존재로 IL-23-차단 항체의 존재에 개발할 것입니다. 이와 같이,이 TH17 분화 프로토콜 prov에성공적으로 TH17의 분화를 유도 할 수있는 적절한 조건을 십오. 자가 면역 질환 13을 목표로 더 나은 치료제의 개발을위한 기회를 제공 TH17 차별화와 IL-17 생산을 기본 메커니즘에 대한 이해의 개발.
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Protocol
모든 동물의 사용은 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 검토를 실시하였습니다.
1. 믹스 미디어의 준비
- 멸균 PBS 산도 : 7.3 (1 L)
0.23 g의의 NaH 2 PO 4
1.15 g 나 2 HPO 4
9.0 g의 NaCl
DI 물과 볼륨을 차지합니다. 오토 클레이브로 멸균. - 세포 배양 배지 (100 ㎖)
89 ML의 RPMI
10 ㎖의 10 % FBS
1 ㎖ 항생제 항진균 (ABAM) 100 μg하는 50 mM 2 - 머 캅토 에탄올 (96.5 μg PBS에 3.5 μg 주식 2 - 머 캅토 에탄올) - 멸균 PBS에 FACS 버퍼 (형광 활성화 셀 정렬) (유동 세포 계측법 동안 사용되는) 2 % FBS
- iTh17 믹스 (샘플 수에 따라 모든 믹스 및 미디어에 필요한 양을 결정)
1.5 ㎍ / ㎖의 항-CD28
20 NG / ML IL-6
5 NG / MLTGF-β
2. 세포는 이하의 조건 중으로 도금 될 것인가
- 항-CD3 바인딩 플레이트는, 항-CD28 (이것은 활성화 제어 혼합이다).
- iTH17 : 플레이트 항 CD3 결합, 항 CD28, IL-6, TGF-β.
3. 플레이트 바인딩 항 CD3 (10 ㎍ / ㎖)
그것은 플레이트 바인딩 항 CD3 판의 준비는 이전에 세포가 플레이트에 추가 할 시간을 적어도 4 시간을 수행하는 것이 좋습니다.
- 웰에 30 ㎕의 항 CD3 추가 새 96 잘 U 바닥 MICROTEST 조직 배양 플레이트 (항 CD3 멸균 PBS에 희석), 그리고 우물의 균일 한 커버리지를 보장하기 위해 판의 측면을 누릅니다. 이 판에 믹스 및 셀을 추가하는 시간이 될 때까지 냉장 후 4 시간 동안 37 ° C에서 부화합니다.
4. 마우스 해부
- 이 프로토콜은 C57BL / 6 MIC의 사용에 기초전자, 3-8 세의 월, 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 구입.
- CO 2 질식을 사용하여 마우스를 희생하고, 이후의 자궁 경부 탈구 죽음을 확인합니다.
- 70 % 에탄올로 쥐 해부 도구와 절개 영역을 소독하고 해부를 시작합니다.
- 복부보기에서 요도구에 앞쪽에 피부를 잡아 턱의 영역에 도달 할 때까지 가위로 복부 중간 선을 절단 시작합니다. 주의 눈물이나 복막 벽의 안감으로 절단하지보십시오.
- 피부에 당겨 제거하는 동안 림프절에 편안하게 액세스 할 수 있도록 아래로 핀.
- 수집 된 림프절과 비장은 모든 집게로 제거하고, 버퍼 (림프절, 비장 제거 다이어그램 그림 2와 그림 3 참조)있는 Miltenyi Biotec은에서 구입 한 실행 autoMACS 5 ㎖를 포함하는 멸균 페트리 접시에 배치됩니다.
- 있는 액와 림프절을 제거각 마우스의 가슴 근육 뒤에 겨드랑이 (겨드랑이) 근처에서 발견.
- 각각의 겨드랑이 근처에있는 결합 조직에있는 상완 림프절을 제거합니다.
- 각 마우스의 목에서 발견 된 표면 경부 림프절을 제거합니다.
- 3 혈관의 결합에 엉덩이 지역에 위치한 서혜부 림프절을 제거합니다.
- 복막 안감까지 복부 정중선을 극복 장간막 림프절을 액세스 할 수 있습니다. 장간막 림프절은 내장을 함께 보유하고있는 결합 조직에서 발견된다. 그들은 일반적으로 4-8 노드의 문자열에서 발견되고, "진주의 문자열"로 나타날 수 있습니다. 전체 문자열을 당겨해야합니다.
- 비장은 위장 뒤에 복부 지역에 위치하고 있습니다. 췌장에서 당겨 분리하여 제거합니다.
- 2 젖빛 현미경 슬라이드를 사용하여 멸균 후드 기관을 갈기. 림프절이나 비장에 배치해체 될 때까지 두 번째 슬라이드의 프로스트면이 하나의 현미경 슬라이드, 문지의 프로스트 쪽. 모든 림프절, 비장 접지 될 때까지 반복합니다.
참고 : 혈액이 어려운 autoMACs 버퍼에 남아있는 림프절을 볼 것 같은 그것은, 림프절로 시작하고 비장 마무리하는 것이 좋습니다.
- 단일 세포 현탁액으로 접지 장기를 필터링하기 위해 40 ㎛의 나일론 조각 위에 재료를 여러 번 접어, 및 15 ㎖의 원심 관의 상부에 위치시킴으로써 시작된다. 나일론 소재는 약 3 × 3인치해야
- 버퍼와 지상 장기 실행 autoMACs의 5 ㎖를 흡인하는 5 ML의 주사기와 21 G 바늘을 사용합니다. 접힌 나일론 소재로 천천히 분배. 바늘과 재료를 천공 않도록주의하십시오.
참고 : 하나의 세포 현탁액이 달성되면,이 솔루션은 visib없이 함께 창백한, 일관된 솔루션으로 나타납니다단단한 조직의 르 조각. 고체, 다시 대기음을 유지하고 새로운 15 ML의 원심 분리기 튜브에 넣고 나일론의 새로운 접힌 부분을 분배합니다.
- 사용하지 않을 때는 항상 얼음에 세포를 유지.
5. 세포 분리
- 최적의 결과를 MACS CD4 + CD25 + 조절 T 세포 격리 키트, 마우스를 사용 autoMACS 프로 셀 구분을 통해 80 %의 순수한 CD4 + CD25-세포 집단을 구하십시오. CD4 + CD25-세포 집단의 네거티브 유지를위한 프로토콜이있는 Miltenyi Biotec 사를 통해 얻을 수있다.
6. TH17 차별화
- autoMACS 프로 전지 세퍼레이터로 분리 한 후 CD4 + CD25-세포 인구를 수집합니다.
- 혈구를 사용하여 트리 판 블루 1:1000 비율로 희석하여 세포를 계산합니다.
- 농도 세포 수로부터 결정되면, 세포 배양 배지에서 1 × 106 세포 / ml로 세포 현탁액을 희석.
- 4 시간 후 항 CD3 바인딩 플레이트 96 웰 플레이트를 꺼내.
- PBS 200 μL와 항 CD3 코팅 우물을 씻으십시오. 2 회 반복한다.
- 세척하는 것은 항 CD3 코팅 우물에 멸균 PBS 200 ㎕를 추가하고 폐기물 용기에 PBS를 제거합니다.
- 세중 우물에 iTh17 혼합 또는 활성화 제어 믹스 100 μL (포인트 # 2 참조)를 추가합니다.
- 각 웰 TH17 혼합 또는 활성화 제어 혼합 하나가 배치 된에에 세포 100 μl를 추가합니다.
- 최소 72 시간 동안 5 일까지 세포를 품어 (TH17 분화는 72 시간 후 5 일 이후에 얻을 수있다.)
- TH17 분화 세포 내 염색과 유세포 분석, ELISA, 또는 qPCR에 의해 평가 될 수있다
7. 세포 활성화 (필요시에만 세포 내 염색 용)
- 72 시간 5 일 중 하나의 끝에 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 제거
- 그 리콜 TH17의 differentiatio여기서 n은 72 시간 5 일 중 하나 후에 달성 할 수있다.
- 각 조건 (예를 들어 활성화 제어 또는 iTh17)의 경우, 24 웰 세포 배양 플레이트 잘 하나에 세중의에 세포를 전송합니다. 96 잘 U 바닥 배양 접시에 회 반복되는 반대로 하나의 조건에 대한 세포는 지금 24 잘 문화 판의 한 우물에 풀링되었습니다.
- 24 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰의 총 부피는 지금 600 μL이다. 물론 세포 배양 배지 1 ml로 각각의 볼륨을 높이고.
- (1 μM)을 이오 노마 이신, PMA (포르 미리 스테이트 아세테이트) (50 NG / ML)를 추가하고, BFA (Brefeldin-A) (10 ㎍ / ml)에 나와있는 농도에서 24 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰.
- 4 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
8. 세포 내 염색
- 유세포 분석을위한 원하는 세포 외 및 세포 내 마커 스테인 세포. 프리젠 O를 검출F IL-17은 세포 내 염색은 항-IL-17A의 항체로 수행됩니다. 추천 세포 표면 마커는 CD4, CD8, 및 CD25 (가) 있습니다.
- IL-17 세포 내 염색에 BD 바이오 사이언스에서 세포 내 사이토 카인 염색법 스타터 키트 - 마우스를 사용합니다.
- 각 샘플의 경우, 펠렛 세포는, 상층 액을 제거하고, 200 ㎕의 FACS 버퍼 (PBS 2 % FBS)에 재현 탁 세포 펠렛.
- 플레이트 세포 계측법 96 셀 흐름에 재현 탁 세포를 전송합니다.
- 1,200 rpm에서 5 분 동안 세포를 스핀 다운 및 뜨는 폐기.
- 1,200 rpm에서 5 분 동안 200 ㎕의 PBS FACS 버퍼, 원심 분리기를 추가하고, 상층 액을 버린다.
- FACS 100 μL에 재현 탁 세포는 버퍼와 세포 항체 100 ㎕를 (AB) 혼합물 (AB 세포 혼합물을 FACS 버퍼 제)를 적용한다. 호일로 덮여 RT에서 15 분, 알을 품다.
- 8.1.4 단계를 반복합니다.
- 단계를 반복 8.1.5 배.
- BD Cytofix / Cytoperm 버퍼 100 μL의 세포를 Resuspend. Incub호일로 덮여 RT에서 20 분, 위해 먹었다.
- 1X BD 파마 / 워시 버퍼 100 μl를 추가, 1,200 rpm에서 5 분 동안 원심 분리하고, 상층 액을 버린다. 반복합니다.
- 세포 내 AB 혼합물의 50 μl를 추가합니다. 호일로 덮여, RT에서 15 분 동안 배양 (세포 내 AB 혼합물 1X BD 파마 / 워시 제).
- 8.1.10 단계를 반복합니다.
- BD 염색 버퍼 200 μL의 세포를 Resuspend.
- 200 ㎕의 BD 염색 버퍼 (최종 부피가 400 ㎕의 경우) 포함 튜브 유동 세포 계측법에 재현 탁 세포를 놓습니다.
- 4 ° C에서 보관 샘플을 읽을 준비가 될 때까지.
9. 유세포 분석
- 게이트 라이브 세포 인구.
- 라이브 세포 인구에서, CD4 + CD8 인구에 게이트.
- CD4 + CD8 인구에서, IL-17A + 인구에 문입니다.
- 우리의 이전 실험 결과에 기초하여, IL-17A + 인구의 100 %가 CD25 +의 것이다.
* 전체 절대 세포 수치는 샘플에서 삼중 풀링 후에 얻었다
** CD4 + CD25 + IL-17A + 세포의 절대 수는 라이브 게이트 백분율 및 계통 특이 마커, CD4, CD25, 및 IL-17A 베어링 전체 세포의 비율에 의해 셀의 총 개수를 곱으로 결정 하였다 유동 세포 계측법에 의해 결정.
10. qPCR에와 ELISA
- 장소 세포는 5 ~ 10 분 동안 13,000 rpm에서 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브와 원심 분리기에서 유세포 분석을 위해 사용되지 않습니다. 원심 분리 후 세포 펠렛에있는 세포의 qPCR 분석을 위해 사용될 것이다. 의 qPCR 분석은 PTC-200 펠티에 열 사이 클러 (바이오 래드)를 사용하여 실시 하였다.
- ELISA를위한 원심 분리 관에서 상층 액을 수집합니다. IL-17A ELISA를이 항체 쌍 TC11-18H10 (캡처, 카탈로그 번호 555068)를 사용하여 수행하고 TC11-8H4의 비오틴 (검출, 제품 번호 555067) BD 바이오 사이언스에서 구입했다. IL-17A ELISA 역ndards은의 eBioscience (카탈로그 번호 14-8171-80)으로 하였다.
- 상층 액을 제거한 후, (나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 RNA 추출, cDNA 합성 및 qPCR에, 또는 상점을 즉시 사용) 175 ㎕의 RNA 용해 버퍼에 qPCR에 사용되는 나머지 세포를 재현 탁.
- IL-17A와 말라 (집 지키는 유전자)에 대한 프라이머 시퀀스 표 2를 참조하십시오
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Representative Results
이 TH17 분화 프로토콜은 비장의 제거와 겨드랑이, 상완, 장간막, 자궁 경부, 서혜부 림프절로 시작합니다. 각각의 위치의 표현은,도 2 및 3에서 찾을 수있다. 그림 1과 5는 모두이 프로토콜에 설명 된 방법의 시각적 표현을 제공합니다.
이 TH17 프로토콜은 CD4 + CD25-T 림프구 인구에서 차별화에 초점을 맞추고 있습니다. 그것은 autoMACS 프로 세포 분리가 풀링 된 총 림프절, 비장 (그림 4)에서 우리의 원하는 CD4 + CD25-인구를 풍요롭게하는 방법을 효율적으로하는 것이 중요하다. 미분 획, 풀링 림프절과 비장 세포 및 autoMACS 분리 분획을 유세포 분석 (그림 4) 다음 antiCD4 및 antiCD25 항체로 염색 하였다. 그림 4a는 CD4 + CD25 +의 비율을 대표하는 프로파일을 보여줍니다그리고 CD4 유동 세포 계측법에 의해 미분 획, 풀링 림프절, 비장에 존재하는 CD25 + 림프구. 분리 절차는 추가적인 실험 (그림 4B)에서 사용할 수있는 C57BL / 6 마우스에서 풍부한 CD4 + CD25 + Treg의 인구를 제공합니다. 그림 4C는 84 % CD4 + CD25-T 세포 인 인구를 가진 우리의 원하는 세포 농축을 보여줍니다, CD4 + CD25 + Tregs가 대부분 제거와 함께. 우리는 일관 충실 CD4 +에 존재 작은 비 림프 세포 집단이 CD25을하지만 분화 과정 (도 4C)을 방해하지 않는다. 우리의 풍부한 CD4 + CD25-T 세포 인구는 성공 TH17 차별화를 보장하는 데 도움이됩니다.
그림 5는 우리의 TH17 분화 과정의 개략도를 보여줍니다. 우리의 풍부한 CD4 + CD25-인구는 TH17 분화 조건에서 배양하거나 (항 CD3, 항-CD28, IL-6와 TGF-β) 또는 제어 (항-CD3, 항-CD28). 그것은 반면 CD25 + T 림프구를 굴복 5 일, TH17 유도 조건에서 배양을위한 항 CD3, 항-CD28와 CD4 + CD25-T 림프구의 배양은 IL17는 CD4 + CD25 + 림프구를 생산하는 하위 집합을 산출하는 것이 그림 6에서 볼 수 있습니다. iTh17 조건에서 5 주 배양 후 절대 셀 수 수율 + CD4 + CD25 + IL-17A의 예는 표 1을 참조하십시오.
TH17 분화 상태가 추가 양적 PCR과 ELISA를 통해 평가 될 수있다. 제어 또는 TH17 유도 조건에서 배양 농축 CD4 + CD25-T 림프구에서 7 선물 데이터를 그림. TH17 조건에서 배양 CD4 + CD25-T 림프구의 qPCR (그림 7A) 및 ELISA (그림 7B)를 통해 확인 될 수 IL17A을 상향 조정합니다. TH17 특정 전사 인자 RORγT도 TH17 유도 조건하에 배양 CD4 + CD25-T 세포에 의해 상향 조절되고, THR 확인 될 수있다ough의 qPCR (그림 7A).
그림 1. TH17 차별화 회로도. 37 ° C에서 4 시간 동안 인큐베이터에서 항 CD3 PBS에 희석 (10 ㎍ / mL)로 U-바닥 96 웰 플레이트 1. 코트 우물. 2. 장소 접시 플레이트를 배양하는 동안 마우스에서 림프절 (LN)과 비장을 해부하다. 장기를 갈아서 단일 세포 현탁액을 구하는 고를. CD4 + CD25 + T 세포 규제 분리 키트 및 Miltenyi 사 autoMACS 프로 세퍼레이터를 이용한 CD4 + CD25-T 세포를 분리. CD4 + CD25-세포는 1 × 10 6 세포 / ml로 희석해야한다. 3. 일단 96 웰 플레이트의 4 시간 배양이 완료, PBS (200 ㎕의 /도) 배. 4 우물을 씻어. 100 ㎕의 CD4 + 추가 CD25-T 세포는 할 (PB) 항-CD3 코팅 우물. 5 플레이트 바인딩. 100 ㎕의 항 CD28 또는 100 ㎕의 iTh17의 COC 추가ktail (antiCD28, TGF-β 및 IL-6). 6. 37 ℃에서 3 ~ 5 일 동안 접시를 품어 다음 배양 세포 내 염색, qPCR에, 및 / 또는 ELISA로 차별화를 평가합니다.
그림 2. LN 해부 가이드. A) 1 상완 림프절 1 액와 림프절이. C) 장간막 림프절에 있습니다 가슴 근육 뒤에, 각 겨드랑이에서 찾을 수있는 마우스. B의 각각의 겨드랑이 (겨드랑이) 근처에있는 결합 조직)에서 찾을 수 있습니다 내장의 결합 조직. 그들은 진주의 문자열을 닮은. D) 4 표면 경부 림프절이 마우스의 목에서 발견된다. E) 2 서혜부 림프절 (각면에 1) 3 혈관이 만나는 위치에있는 진보적 인 지역에 위치 할 수 있습니다 .
. 내 페이지 = "항상"> 
그림 3. 해부 가이드를 비장. 마우스 비장은 위장 뒤에 본체의 왼쪽에 발견된다. 단순히 당겨 집게로 분리하여 제거합니다.
그림 4. 풀링 LN에서 세포 분수 및 비장 세포 전후 autoMACS 프로 분리.) LN 및 비장 세포 후에는 분리하기 전에 기본 세포 집단을 설정, 생체, 염색 하였다. 다음 분리, CD4 + CD25 + (B) 및 CD4 + CD25-(C) 분획은 각각 CD4 + CD25 + 및 CD4 + CD25-T 림프구 집단의 순도를 평가하기 위해 염색 하였다. 모든 샘플은 CD4 + 및 CD25 + 항체로 염색 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다.
그림 5. TH17 분화. 최대 5 일 동안 세포를 품어. 세포 염색 및 qPCR에 대한 수확 세포, ELISA에 대한 수확 상층 액.
그림 6. TH17 차별화 유동 세포 계측법에 의해 평가. CD4 + CD25-T 림프구는 플레이트 바인딩 항 CD3의 면전에서 배양 한, 항 CD28, IL-6와 TGF-β (iTh17) 또는 항-CD3 플레이트 바인딩 및 항 CD28 형 (제어)에 대한 오일. 세포는 다음 37 ℃에서 4 시간 동안 PMA와 이오 노마 이신 활성화했다 활성화 후, 균체 TH17 분화를 평가하기 위해 안티-CD4, 안티-CD8, 항-CD25, 및 유세포 분석을위한 항-IL-17A 항체로 염색 하였다. iTh17 = TH17 유도 Conditions.
그림 7. C57BL / 6 마우스에서의 qPCR 및 ELISA. 림프구에 의해 평가 TH17 분화는 정렬시키고, CD4 + CD25-T 세포를 판 - 결합 항-CD3 (10 ㎍ / ㎖), 항-CD28 (1.5 ㎍ / ㎖의 존재하에 배양시켰다 ), IL-6 (20 NG / ML), 및 TGF-β (5 NG / ML) 또는 항-CD3 플레이트 바인딩 및 항 CD28 형 (제어) 5 일 동안.) 세포는 다음 RORγT을 평가하기 위해 수확 및 qPCR에. B를 통해 IL-17A 메시지 발현) 상청액은 ELISA에 의해 IL-17A 단백질의 발현을 평가하기 위해 수거 하였다.
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Discussion
여기에서 우리는 체외 TH17 차별화를 달성하기 위해 프로토콜을 설명했다. T의 분화가 인간의 병원균 (13)의 효과적인 제거를위한 중요 TH17 하위 집합으로 림프구로 TH17 분화 연구는 중요하다. 반대로, IL17의 생산은자가 면역 질환의 진행 (13)와 연결되어 있습니다. 이 면역 조절 및자가 면역의 수많은 별개의 뮤린 모델에 적용 할 수 TH17 분화의 방법은 많은 연구의 설정에 적용 가능하다. 이 방법은 면역 반응을 조절하는 IL-17A의 생산 및 전사 인자 RORγT의 표현으로이 프로토콜에 표시 TH17 세포로 분화하는 T 림프구의 기능,,,에 대한 질문에 대답하는 데 도움이됩니다. 또한, TH17 세포도 IL17F, Il22 및 GM-CSF 08 (12)의 생산에 의해 식별 될 수있는 다른 사람에 의해 밝혀졌다. 이 프로토콜은 서로에 대한 중요더 나은 T 림프구의 이펙터 기능이 면역 시스템 운영에 관한 방법을 이해하기 위해 이러한 프로토콜을 보완하기 위해 사용할 수 있기 때문에 이러한 TH1 또는 TH2 분화로 알려진 T 림프구의 분화 프로토콜.
이러한 실험을 수행 할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. TH17 분화는 불순한 CD4 + CD25-모집단을 통해 달성 될 수 있지만, 가장 효율적이고 신뢰성있는 결과를 위해, 적어도 80 % 순도의 CD4 + CD25-인구가 요망된다. 우리의 방법은 autoMACS 프로 전지 세퍼레이터에있는 Miltenyi Biotec은에서 제공하는 프로토콜을 사용합니다. autoMACS CD4 + CD25 + 조절 T 세포 격리 키트는, 마우스는 CD4 + CD25-세포 인구의 음의 선택에 사용됩니다. 부정적 선택은 잠재적으로 항체의 상호 작용에 의해 변경되지 않은 나이브 세포의 사용을 허용한다.
유세포 분석에서 특정 세포 표면 마커를 사용하여 AP의 순도를 확인할 수있다opulation. 그들은 쉽게 원하는 CD4 + CD25-인구를 식별 할 수있는 권장 표면 마커는 CD4, CD8, 및 CD25입니다. B220 및 CD11b를 각각 B 세포 및 대식 세포의 오염 여부를 테스트하기 위해 사용될 수있다. 우리가이 농도 수익률 최적의 차별화를 발견로 샘플을 지속적으로 1 X 10 6 세포 / ml로 희석도 추천합니다. 과거에 우리는 종종 너무 높거나 너무 낮은했다 세포 농도는 세포의 확장 (예 : 기울어 IL-17A 생산으로) 편향된 결과를 교란 한 것으로 나타났습니다.
그것은 사용하지 않을 때는 항상 얼음에 샘플을 유지하기 위해 기억하는 것이 중요하다. 세포 생존율은 긍정적 TH17 감별을 달성하는 데 중요한 요인이다. 이 트리 판 블루 희석액을 사용하여 세포 계수를 통해 확인할 수있다. 이 프로토콜은 프로스트 현미경 슬라이드와 림프절, 비장을 연마하여 수동 조직의 균질화를 채용하고 있기 때문에, 이것은 시간이 소요 방법이 될 수 있습니다. 하나의 디자인 모dification 대안 옵션으로 자동 조직 dissociators을 활용하는 것입니다.
원하는 TH17 분화가 달성되지 않는 경우, 고려해야 할 몇 가지 트러블 슈팅 팁이 있습니다. TH17 분화의 진정한 정도를 제대로 측정 할 수 있도록 첫째, 컨트롤은 신중하게 고려되어야한다. 우리는 전형적으로 항-CD3 및 항-CD28 자극을받은 CD4 + T 림프구에 이들 결과를 비교하여 TH17 분화의 정도를 결정한다. 또한 CD4 + T 림프구가 주문 차별화 활성화 할 필요가 있음을 기억하십시오. 하나는 또한 시각적 블라스트 / 활성화 된 T 세포의 존재를 확인하기 위하여 현미경 하에서 배양 된 세포를 검사한다. 활성화 된 T 세포는 시각적 자극되지 않은 세포보다 유의하게 더 크게 나타난다. 클론 확장은 또한 하나의 T 세포 클론으로부터 유도 된 세포를 분사 가시 클러스터를 통해 관찰 할 수있다. 세포 활성화는 검증과 할 수있다CD4 + CD25 + 세포 활성화 4를 식별하기 위해 항-CD4 및 항-CD25 항체를 사용하여 유세포 분석의 사용을 통해 ED
그러나 그것은 TH17 분화가 NOD와 BALB / c 마우스 5, 11, 20 등의 다른 마우스 종자에 달성 될 수 있다는 것을 보여줍니다 데이터를 발표, 또한이 프로토콜은 C57BL / 6 마우스와 함께 사용하도록 최적화 된 것을 언급하는 것이 중요합니다. 그것은 전체 주파수와 차별화를받은 CD4 + T 림프구의 절대 수를 포함 TH17 분화가,, 20 (예 : 마우스 변형 등) 유전 적 요인 (예 : 식민지의 위치 등) 환경 적 요인 5에 의존하고 최적화가 필요할 수 있음을 유의해야한다.
이 TH17 분화 프로토콜은 더 TH17 부분 집합에있는 세포의 기능에 대한 질문에 대답 할 수있는 매우 중요한 수단으로 역할을 할 수 있습니다. TH17 분화의 우리의 방법은 몇 가지 중요한 장점이 있습니다. 앞서 사용을 언급최소 80 % 순수 CD4 + CD25의 세포 인구는보다 일관되고 효과적인 차별화 결과를 제공합니다. autoMACS 프로 전지 세퍼레이터의 사용을 통해 분리의 용이성은 추가 장점이다. 또한 최적의 사이토 카인 및 활성화 신호의 사용은 분화에 적합한 환경으로 T 세포를 제공한다. 이 프로토콜에 대한 미래의 의미는 TH17 세포와 IL-17A의 생산은자가 면역 질환의 발병과 진행에 관여하는 기계적인 방법을 결정하는 것을 포함.
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Disclosures
선언 할 수 없음 공개.
Acknowledgments
이 작품은 플로리다 TL1 TR000066 및 UL1 TR000064, 건강의 국립 연구소, BD Biosciences는 시약 부여에서 부모 그랜트 R01AI056152에서 다양성 보충 대학에 NIH / NCATS 임상과 번역 상 과학 포상 및 대학에 의해 부분적으로 지원됩니다 플로리다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1"1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt–thanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad | ||
References
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