בVivo שני פוטונים מיקרוסקופית של קצות עצבים בודדים בעור

Summary

הפרוטוקול להדמיה אורך דינמית ונגע לייזר סלקטיבית של קצות עצבים בעכברים מהונדסים כתב מוצג.

Abstract

קצות עצבים בעור מעורבים בתהליכים פיסיולוגיים כגון חישת ^1, כמו גם בתהליכים פתולוגיים כגון כאב נוירופתי ^2. המיקום קרוב לפני השטח שלהם מאפשר הדמיה מיקרוסקופית של קצות עצבים בעור בחיים של בעלי חיים בשלמותה. באמצעות מיקרוסקופ multiphoton, זה אפשרי כדי להשיג תמונות משובחות להתגבר על הבעיה של פיזור אור החזק של רקמת העור. עכברים הטרנסגניים כתב שמבטאים EYFP תחת השליטה של ​​אמרגן Thy-1 בתאי עצב (כולל פריפריה עצב סנסורי) הם גם מתאימים למחקרים ארוכי הטווח של קצות עצבים בודדים על פני תקופות זמן ארוכות עד מספר חודשים או אפילו לכל חיים. יתר על כן, שימוש באותו הלייזר femtosecond כלהדמיה, ניתן לייצר נגעים סלקטיבית מאוד של סיבי עצב למחקרים של הארגון מחדש סיבי עצב. כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ואמין לmultiphoton אורך בתחום ההדמיה vivo ומייקרו מבוסס לייזר על קצות עצבים בעור עכבר.

Introduction

קצות עצבים עורית עוברים שינויים הדינמיים במדינות pathophysiological שונות. סיבי עצב יכולים לעבור את התהליך של ניוון והתחדשות או ארגון מחדש בקורס של מחלות כגון נוירופתיה היקפית ² או מורטון נוירומה של ^3. לאחר פציעה טראומטית, חלק חשוב מדינמיקת קצות עצבים בעור הוא עצבוב של האזור הפגוע. עם זאת, הגישה המקובלת לחקירה של קצות עצבים היא vivo לשעבר חתך היסטולוגית שחסרי מידע בזמן אמת על התהליכים המתמשכים ^4. באמצעות סמני ניאון מקודדים גנטיים, ניתן לעקוב אחר קצות עצבים בעור של בעלי חיים, וכך להשיג מידע עשיר ומשמעותי יותר רלוונטי בשינויים המבניים. החקירה של קצות עצבים עורית אפשרית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי, לעומת זאת, פיזור האור החזק של רקמת העור חזק פוגע באיכותשל נתונים שנרכשו ^5. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת רכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה ברקמות מאוד הפיזור בשל הסיכום שאינו ליניארי של אנרגיה של פוטונים אור העירור וכתוצאה מכך הפליטה של ​​הקרינה רק מנקודת האובייקטיבית מוקדי. השפעה זו מובילה לעלייה חזקה בעומק החדירה ושיפור של יחס אות לרעש למדידה ברקמות עור ^6. באמצעות אותו הלייזר כמו הדמיה, ניתן לייצר לנתיחה סלקטיבית של סיבי עצב ^7. בפרוטוקול הבא מציגים את השיטה של הדמיה האורך של קצות עצבים עורית in vivo בעכברים מהונדסים כתב בשילוב עם נגע לייזר סלקטיבי באמצעות מערכת מיקרוסקופ multiphoton זמינה מסחרי.

Protocol

נהלים הקשורים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי מועצת המנהלים ניסוי בבעלי חיים הלאומיים, פינלנד.

.1 בעלי החיים הכנה להדמיה

1. הרדימי עכבר על ידי הזרקת intraperitional (IP) של קטמין (0.08 מ"ג למשקל גוף) ו xylazine (0.01 מ"ג למשקל גוף). בדוק את ההרדמה עם רפלקס קמצוץ הבוהן האחורי.
2. לטבול את עיניו של בעל חיים בטיפי עיניים (Viscotears) כדי להגן על העיניים מפני התייבשות.
3. שים את העכבר על כרית חימום (Supertech) בשעה 37 ° C כדי למנוע היפותרמיה.
4. נקה את כרית כף הרגל מיועדת להדמיה עם 70% אתנול.
5. הוסף טיפה של מים על העור של כרית כף הרגל לצימוד הטבילה בין העור ומכסה זכוכית.
6. שים חומר אריזת פלסטיק מתחת לכף הרגל האחורית שממוקמת מתחת טבעת מתכת עם כיסוי כיתה.
7. התאם את העובי של חומר אריזת הפלסטיק כדי לשטח את העור.
8. שים טיפת מים על גלאס הכיסויים לטבילה בין מכסה זכוכית והאובייקטיבי.

.2 מתכת, קיבוע טבעת הכנה

1. לייצוב העור לנצל את קיבוע המתכת. אנו משתמשים בתופסנים שני אגפים מוגנים עיצוב קהילה עם טבעת מתכת (באדיבות Neurotar בע"מ, פינלנד). מלא את המזרק עם דבק מגע, לשים הטיפה הקטנה של דבק מגע דרך המחט על הטבעת בעדינות להפיץ את הדבק לכיסוי אחיד של פני השטח הטבעת. זה קריטי כדי לשים את הסכום המינימלי של דבק שיש צורך רק לכיסוי אחיד, בגלל כמות מוגזמת של דבק עשויה להפחית את השדה של הנוף ולחסום ההדמיה הבאה.
   הערה: לחלופין השילוב של מוט מתכת (מתחת) ושקופיות זכוכית מיקרוסקופ רגילות (ככיסוי) יכולה לשמש כדי לשטח את העור ולהבטיח צימוד אופטי תקין של ההרכבה ^14. שני מהדקי נייר יכולים לשמש כדי לתקן את הכפה בין הזכוכית ומשטח מוט מתכת (איור 4
2. כסה את הטבעת עם כיסוי מיקרוסקופ שקופיות (בקוטר 5 מ"מ, מיקרוסקופית אלקטרונים מדע).
3. לדפוק על תופסנים טבעת לבר מתכת הנוקשה המונטאז' על הבמה מיקרוסקופ הממונעת.

.3 הדמיה נוהל

1. במקרה של שימוש בעכברי Thy1-YFP-H, לבחור את החלק הכחול של ספקטרום מנורת הקרינה לדמיין סיבי עצב. מצא את העצב של עניין במצב epifluorescence ולהתמקד בו.
2. רשום את הקואורדינטות של נקודה להדמיה אורך. השתמש בכרית כף היד כנקודת התייחסות. במהלך פגישות ההדמיה הבאות, לזהות ראשון את כרית כף היד ולאחר מכן למצוא את אותו סיבי עצב גדולים במעלה הזרם ולחזור באמצעות הקואורדינטות הצילו. זה חיוני כדי למקם את כרית כף הרגל באותו הכיוון ניצב לסרגל המתכת כדי לשמור על אותה המערכת של התייחסות.
3. הפעל את מצב שני פוטונים. לעכברי Thy1-YFP-H, הוא מתאים לשימוש באורך גל 950 ננומטר של קרינת לייזרכדי להמחיש את סיבי העצב.
4. ערוצי אורך גל לייזר ופליטה בחרו (450-480 ננומטר לגילוי דור הרמוני שני, 520-550 ננומטר להדמיה של עצבים שכותרתו YFP ו580-630 ננומטר לצורך זיהוי של הקרינה YFP וautofluorescence של השיער), להתחיל עם צריכת חשמל נמוך לייזר (3-5%) כדי למנוע photodamage והלבנה. המתח הטיפוסי בצינורות מכפיל הוא 600-700 V להדמיה מסוג זה.
5. הגדר את הרזולוציה הרצויה (512 x 512 או 640 640 למדידות אירועים מהירות, 800 800 או 1,024 x 1,024 הדמיה מורפולוגית), צעד צירי (1-3 מיקרומטר), עובי של המדגם ומרווחי הזמן (1-10 דקות). זמן החשיפה הוא בסדר הגודל של 1 msec לפיקסל אחד.
6. לסמן ראשון את הגבולות העליונים ותחתונים של ההדמיה הנפח בתוכנה.
7. לרכוש את ערימת תמונת התייחסות להתייחסות לפני שהנגע. בעת צורך, ניתן להקליט את הבסיס במשך כמה דקות.
8. לאחר ההדמיה נקייה הכרית עם רקמה ולשים את העכבר בתיבת התאוששות ב36 ° C עד שהוא ער לחלוטין.
   הערה: בדרך כלל, משך פגישת הדמיה אחד בשילוב עם נגע לייזר מושרה (ראה להלן) לא יעלה על שעה 1. אנו ממליצים לוודא שהחיה מורדמת כל דקות 10-15 עמוקה; זה לא צריך להפריע להדמיה עצמה, אלא יש לשקול בעת הליך ניסוי מתוכנן. משך ההשפעה של מינון קטמין / xylazyne יחיד הוא סביב 30 עד 40 דקות, ובכך אנו ממליצים להחיל נוספים ¼ ל½ מנה אחרי 25-30 דקות.
   הערה: זה צריך להיחשב גם כאשר הניסויים מתכננים שהתדירות של פגישות הדמיה לבעלי חיים בודדים לא יעלה על 1 פגישה ל2 ימים כדי להימנע מתופעות לוואי של מחדשההרדמה petitive.

.4 לייזר נגע

1. לאחר שרכש את ערימת תמונת ההתייחסות, משתמש בפרוטוקול ההלבנה לעשות נגע מיקרו.
2. להגדיל את כוח הלייזר ל100%.
3. להגדיל את זמן חשיפה ל100-1,000 אלפית שניים לאזור של עניין (100-1,000x יותר מאשר במקרה של הדמיה סטנדרטית).
4. להתוות את האזור לנגע.
5. הפוך את הנגע על ידי מעבר על ההלבנה.
6. לחזור למצב ההדמיה הרגיל ולהמשיך עם הקלטות הזמן לשגות.

.5 עיבוד נתונים וניתוח

1. להמשיך עם unmixing באמצעות תוסף ספקטרלי unmixing בImageJ ⁸ (יואכים וולטר, http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html).
2. פתח את ערימת התמונה ולפצל את הערוצים.
3. מצא את השטח החופשי של עצבים או שיער למדידות רקע. שים o אזורעניין f באזור זה.
4. מתאר בזהירות את החלק של השיער שבו הוא להבחין בין העצבים באופן ברור.
5. להתוות את העצב בחלק של התמונה שבה היא נפרדת מהשיער.
6. חוסך אינה מתרככים מטריצה.
7. החל מטריצת unmixing מדודה לכל הערימה.
8. שמור את ערימות תמונת מעובד החדשות בפורמט * tif.

Representative Results

שימוש בטכניקה המתוארת ניתן לעקוב אחר אותו הסיבים לאחר הפגיעה וללמוד את ההשפלה של קצוות פגומים עצב (איור 1). רכישה של המחסנית עם העובי של 120-150 מיקרומטר היא בדרך כלל מתאימה להדמיה החוזרת ונשנית במשך מספר ימים על מנת לשמור את כל הסיבים בשדה הראייה.

הנגע בדרך כלל יכול להיות מיוצר בצורה תמציתית, כאשר חומר אריזות הפלסטיק מותאם לשטח העור, כך שכבות קולגן מופיעות בעוצמה אחידה על התמונה (איור 2). קצות העצבים מעל שכבת קולגן הם המתאימים ביותר כדי לייצר את הנגע המדויק.

במקרה העור אינו שטוח, התמונה עלולה להתרחש ליהיה מטושטשת (איור 3). העצמה במצב זה עדיין יכולה להיות מתאימה לחקירות מורפולוגיות של סיבי העצב אבל ההליך היית נגע הלייזר להתעכב.

מסלול 1 זמן איור של ההשפעה של נגע לייזר בסיב העצב המוצגת כתמונות הקרנה המרביות. תמונות העליונות להראות סיבים לפני ומייד לאחר הנגע, הפנל התחתון מציג את אותה סיבים אחרי ו30 דקות ו10 ימים (משמאל לוחות מימין, בהתאמה). יש כמה מבנים להביע YFP של הטבע שאינו עצבי המופיעים 10 ימים לאחר הנגע. מבנים אלה עשויים להיות קרטינוציטים שידועים כי הם מביעים את גן Thy1 זמני בתנאים טראומתיים. הקרינה YFP של סיבי עצב מוצגת בצהוב. חץ מסמן את האזור של הנגע. סרגל קנה מידה 30 מיקרומטר.

/ftp_upload/51045/51045fig2highres.jpg "src =" / קבצים / ftp_upload / 51,045 / 51045fig2.jpg "/>
איור 2 תמונת השלכה המרבית לקצות עצבים באזור עור שטוח. הקרינה YFP של סיבי עצב מוצגת בצהוב, הדור ההרמוני השני של קולגן מוצג בכחול. סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר.

איור 3 קצות העצבים באזור המעוגל של העור מתקבל כz-הקרנה מרבי לחלקים אופטיים מרובים. הקרינה YFP של סיבי עצב וautofluorescence של השיער מוצג בצהוב, הדור ההרמוני השני של קולגן מוצג בכחול. סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר.

ftp_upload / 51,045 / 51045fig4highres.jpg "src =" / קבצים / ftp_upload / 51,045 / 51045fig4.jpg "/>
איור 4 הליך קיבעון הכפה באמצעות שקופיות זכוכית מיקרוסקופ ככיסוי. השקופיות המצורפת לסרגל המתכת באמצעות אטבי נייר סטנדרטיים.

Discussion

בפרוטוקול וידאו זה אנו מדגימים את השיטה להדמית שני פוטונים אורך לא פולשנית של קצות עצבים בודדים.

הדינמיקה של עצבוב עור מושפעת במחלות כגון פסוריאזיס ונוירופתיה היקפית ^2, ובפציעות טראומטיות ^9. שני פוטונים הדמיה מאפשרת ניתוח מפורט של מבני סיבי עצב במטריצת קולגן. השימוש בעכברים מהונדסים כתב עוזר למנוע את הבעיות הנוגעות להכתמה של סיבי העצב. נראה זן Thy1-YFP-H להיות מספיק חזק לניתוח נתונים מורפולוגיים ¹⁰ ואילו עכברי Thy1-mitoCFP עשויים לספק הזדמנות ללימודים תפקודיים של דינמיקה של המיטוכונדריה בסיבי עצב ^11. שורת YFP-16 / ICR יכולה לשמש לתצפית של גופי מייסנר ^12. הגישה החלופית יכולה להיות ההזרקה הנגיפית לגנגליון שורש הגבי למעקב סלקטיבית של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות13.

כדאי לשים לב כי הייצור של נגע סלקטיבית בתוך מטריצת הקולגן בחום הפריע בהשוואה לשכבות העליונות של עור. זו הסיבה שלפעמים זמני חשיפה לנתיחה של סיבי עצב יכולים להשתנות ככל פי עשרה תוך עוצמת הקרינה להדמיה שונה בטווח של 10-20%. כדי לשמור על איכות טובה של תמונת צימוד הטבילה המתמדת צריך להיות כל הזמן.

הרזולוציה של התמונה בדרך כלל תלוי במהירות הרצויה של רכישה. זמן אופייני עבור ייצור של מחסנית frames- 30 עם 800 800 פיקסלים רזולוציה הוא 1 דקות, כך ניתן להקטין את הרזולוציה או עובי של אזור הדמיה כדי לזהות שינויים מהירים או להגדיל את הרזולוציה ללימודי תכונות מורפולוגיות בסדר.

הקיבוע של השודד צריך להיות הדוק מספיק כדי לא לאפשר לסחיפה של התמונה, אבל באותו הזמן זה לא צריך להשפיע על זרימת הדם בtהוא העור. לאופטימיזציה של ההליך, זריקות של קליעים נותבים כלי דם (למשל, TexasRed כותרת 70 kDa dextran) הם אפשריים, ומאפשרת להתאים את לחץ חומר אריזת הפלסטיק באמצעות ניטור זרימת הדם. ממצא תנועה בהכנה המתוארת בפרוטוקול זה לא סביר, כי כלב מורדם עמוק, הכפה עצמו מחובר היטב להרכבת הקיבעון, וכי הדופק ותנועת נשימה לא ישירות מועברים לכפה. עם זאת, תנועות קלות אפשריות במיוחד אם הדמיה הגדלה גבוהה מתבצעת. במקרה זה אנו יכולים להמליץ ​​על שימוש בתוספי ImageJ נועדו לפצות ממצא תנועה.

ההדמיה החוזרת ונשנית של אותו האזור עשוי להיות מושגת על ידי שימוש בנקודתי התייחסות כגון כרית הקרפלית ^14, או במקרה של הזרקה של כמה חומרים בשודדים את מקום הזרקה יכול לשמש כנקודת ציון ^6. האפשרות אחרת היא קעקוע של העור.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2 mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml	BD	300013
30 G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782