Summary
Abbiamo sviluppato un modello fetta cervello che può essere usato per esaminare meccanismi molecolari coinvolti nel trauma cranico eccitotossicità mediata. Questa tecnica genera tessuto cerebrale maturo vitale e riduce il numero di animali necessari per la sperimentazione, pur mantenendo la circuiteria neuronale, interazioni cellulari e compartimenti post-sinaptici in parte intatto.
Abstract
Esaminare i meccanismi molecolari coinvolti in condizioni neuropatologici, come l'ictus ischemico, può essere difficile quando si utilizzano sistemi animali interi. Come 'neuronale, come i «sistemi di coltura di cellule tale, primaria o vengono comunemente utilizzati. Mentre questi sistemi sono relativamente facili da lavorare, e sono sistemi modello utile in cui diversi esiti funzionali (come la morte cellulare) può essere facilmente quantificato, i risultati esaminati e percorsi nei neuroni immaturi coltura (come vie di morte cellulare eccitotossicità mediata) non sono necessariamente uguali a quelli osservati nel cervello maturo, o in tessuto intatto. Pertanto, vi è la necessità di sviluppare modelli in cui meccanismi cellulari nel tessuto neurale maturo può essere esaminato. Abbiamo sviluppato una tecnica in vitro che può essere usato per studiare una varietà di vie molecolari nel tessuto nervoso intatto. La tecnica descritta qui utilizza tessuti di ratto corticale, ma questa tecnica può essere adattato per usare tessutoda una varietà di specie (come topo, coniglio, cavia, e pollo) o regioni cerebrali (ad esempio, ippocampo, striato, ecc). Inoltre, una varietà di stimoli / trattamenti può essere utilizzato (ad esempio, eccitotossico, somministrazione di inibitori, ecc). In conclusione, il modello fetta cervello qui descritto può essere usato per esaminare una serie di meccanismi molecolari coinvolti nel trauma cranico eccitotossicità mediata.
Introduction
La forma più comune di ictus è ictus ischemico, che si verifica quando un vaso sanguigno cerebrale diventa occlusa. L'ischemia del tessuto risultante dalla cessazione del flusso sanguigno provoca diffusa depolarizzazione delle membrane, rilascio di neurotrasmettitori eccitatori, e aumento prolungato del calcio intracellulare, che porta all'attivazione di morte cellulare Percorsi di 1. Questo processo è stato definito 'eccitotossicità', ed è un percorso comune coinvolto nella morte neuronale prodotta da una varietà di patologie, compreso il colpo 2. Inibizione delle vie di segnalazione coinvolte nella excitotoxicity e altre cascate di morte delle cellule neuronali è un approccio interessante per limitare i danni neuronali dopo l'ictus.
Identificare i meccanismi molecolari precisi coinvolti nella excitotoxicity e ictus ischemico può essere difficile quando si utilizzano sistemi animali interi. Come tale, embrionale primario e 'neuronale-like' (ad es neuroblastomacchine e linee di adenocarcinoma immortalati) sistemi di colture cellulari vengono spesso utilizzati. I principali vantaggi di questi modelli sono che sono facili da manipolare, relativamente conveniente, e morte cellulare possono essere facilmente misurati e quantificati. Tuttavia, vie di segnalazione possono essere modificati dalle condizioni di coltura utilizzate 3,4, ei neuroni immaturi e immortalati linee possono esprimere i recettori diversi e molecole di segnalazione rispetto a maturare cervello 5-8. Inoltre, neuroni in coltura consentono solo l'esame di un tipo di cellula (o due, se viene usato un sistema di co-coltura), mentre il tessuto cerebrale intatto è eterogenea, contenente una varietà di tipi di cellule che interagiscono tra loro. Sistemi di coltura organotipica fetta (espianti sottili di tessuto cerebrale) sono anche utilizzati, e questi modelli permettono lo studio delle popolazioni eterogenee di cellule come si trovano in vivo. Tuttavia, solo una quantità limitata di tessuto può essere ottenuto da ciascun animale quando si utilizza questa tecnica, fette puònon essere in coltura a lungo come linee cellulari immortalizzate e medio coltura a lungo termine può provocare alterazioni in vie di segnalazione e recettori nelle fette. Mentre cervello maturo può essere utilizzato per generare fette organotipiche, fette di cervello immaturo sono più suscettibili alla cultura, e sono più comunemente utilizzati. Vi è quindi la necessità di sviluppare modelli che mimano o rappresentano intatta cervello maturo, che sono facili da usare, in cui vie di segnalazione neuronali possono essere esaminate.
Qui, una tecnica in vitro che coinvolge il tessuto nervoso intatto che può essere utilizzato per chiarire i meccanismi molecolari coinvolti nella morte delle cellule dopo un insulto ischemico o eccitotossico è descritto. Questa tecnica riduce il numero di animali necessari per eseguire un esperimento, è riproducibile, e genera tessuto vitale che si comporta in modo simile a metabolicamente più grandi fette organotipiche. Inoltre, la circuiteria neuronale, interazioni cellulari, e co postsinapticompartment rimane parzialmente intatta. Il buffer fisiologico utilizzati consente alle membrane cellulari per 'reseal', e permette alle cellule di recuperare la loro resistenza membrana originale 9. Questo modello fetta cervello è in grado di imitare fedelmente risposte osservate a seguito di eccitotossicità mediata da lesioni cerebrali di 10, e può essere utilizzato per esaminare i meccanismi molecolari coinvolti nella corsa.
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Protocol
Tutte le procedure vengono eseguite con l'approvazione presso l'Università di Newcastle cura degli animali e Comitato Etico, nonché in conformità con le linee guida e regolamenti pertinenti, tra cui il NSW Animal Research Act, il regolamento sugli animali NSW, e il Codice australiano di condotta per l' Cura e uso degli animali per fini scientifici.
1. Dissezione del tessuto cerebrale
- Sacrifica dodici settimane vecchi ratti maschi per decapitazione. I ratti possono sia essere sacrificati da una splendida e decapitazione, oppure possono essere prima anestetizzati con isoflurano (5% induzione, 1,5-2% di manutenzione) nel 70% N 2 e il 30% O 2, e poi decapitati.
- Rimuovere il cervello dal cranio più rapidamente possibile (idealmente, questa deve essere eseguita in meno di 2 minuti).
- Rimuovere la corteccia dalla dissezione a mano libera. La dissezione deve essere eseguito nel minor tempo possibile, con il minor danno al cervello più possibile in modo da Maintain l'integrità delle fette.
- Al fine di eliminare qualsiasi residuo pelle, pellicce, sangue, ecc, immergere il cervello in una piccola quantità (3-5 ml) di 37 ° C tampone Krebs (118 mM cloruro di sodio, cloruro di potassio 4,7 mM, 1,3 mM di cloruro di calcio, 1.2 mM di potassio fosfato monobasico, solfato di magnesio 1,2 mM, 25 mM carbonato acido di sodio, 11,7 mM di glucosio, sodio 0,03 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), equilibrati con il 95% di ossigeno / anidride carbonica del 5% (CarboGen), pH 7,4).
2. Preparazione di Microslices
- Posizionare il cervello sul palco di un elicottero McIlwain su cui sono stati collocati e inumidito con tampone caldo Krebs due fette di carta da filtro. Mantenere il cervello e carta da filtro inumidita con tampone Krebs caldo, ma non così bagnato che c'è liquido libero sulla superficie della carta che può causare il cervello a scivolare.
- Tagliate il cervello in 250 micron sezioni coronali. Come nutrienti, ossigeno e materiali di scarto °a normalmente scambiate con l'apporto di sangue sono scambiati con un fluido che circonda il tessuto isolato tessuto neurale, la dimensione delle fette non deve essere superiore a 400 pm di spessore per consentire un'adeguata ossigenazione e nutrienti scambio avvenga.
- Girare la fase McIlwain 90 °.
- Tagliate cervelli in 250 micron fette sagittali. Qui, queste sezioni cerebrali (250 micron x 250 micron fette di lunghezza variabile a seconda dello spessore del tessuto) sono indicati come microslices.
- Posizionare i microslices in un tubo fondo rotondo con 10-15 ml 37 ° C tampone Krebs (la quantità di tampone Krebs utilizzato dipenderà dalla quantità di tessuto).
3. Equilibrazione di Microslices
- Agitare delicatamente fino a quando i singoli microslices sono sospese, e poi permettere loro di stabilirsi per gravità.
- Rimuovere con attenzione il surnatante, che sarà nuvoloso a causa di detriti cellulari sospeso, e aggiungere 10 ml di fresco a 37 ° CKrebs tampone al tubo.
- Ripetere questa procedura quattro successivi lavaggi, che provocherà la rimozione della maggior parte dei detriti.
- Successivamente, equilibrare le microslices a 37 ° C agitando delicatamente / inversione, e cambia il tampone Krebs ogni 15 minuti per 1 ora in totale.
- A questo punto, aggiungere 2 ml di tampone fresco 37 ° C Krebs, e trasferire 15-20 microslices (150 microlitri di sospensione microslice) al polistirolo fondo piatto 5 ml provette usando un puntale foro molto ampio con bordi smussati (che possono essere creati da taglio ~ 2 mm dal termine di una punta P1000). Distribuire le microslices uniformemente sulla base del tubo in un unico strato, in modo che ogni microslice non è anche di pochi millimetri dal atmosfera ossigenato.
4. Stimolazione eccitotossica
- Incubare le microslices a 37 ° C, e continuamente passare Carbogen sulla superficie della sospensione 150 microlitri microslice, utilizzando una linea di gas che è la posizioneEd appena sopra la superficie della sospensione microslice (per evitare la rottura meccanica).
- Trattare microslices sia con 150 microlitri 5 glutammato mm + 100 mM glicina in tampone Krebs (stimolo eccitotossico: concentrazione finale 2.5 mM glutammato + 50 mM glicina) o 150 microlitri di buffer Krebs solo (controllo non stimolate). Una serie di stimoli può essere utilizzato in questo passaggio (compreso, ma non limitato a, AMPA, NMDA + glicina, KCl depolarizzazione, e ossigeno / glucosio privazione).
- Rimuovere la soluzione di incubazione a vari tempi dopo la stimolazione (0, 30, 60, 90, 120, e 300 sec), e sostituirla con 300 ml di ghiacciata tampone di omogeneizzazione (Tris 30 mM, pH 7,4, 1 mM glicole etilenico tetraacetico, EDTA 4 mm, 100 micron molibdato di ammonio, 5 mM pirofosfato di sodio, fluoruro di sodio 25 mm, 1 mm orthovanadate sodio, phenylmethanesulfonylfluoride 1 mm completo cocktail inibitore della proteasi).
- Omogeneizzare microslices sul ghiaccio, con un vetro-teflon Dounce Omogenizzatore(20 colpi; 700 rpm).
- Conservare omogenati a -80 ° C, e le varie molecole di segnalazione, le molecole di morte, ecc possono essere misurati mediante western blot.
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Representative Results
Microslices generati utilizzando questa procedura sono vitali, e una varietà di specie (ad esempio, ratto, topo, pollo e) possono essere utilizzati per produrre microslices. Sono state utilizzate tre misure indipendenti di redditività: il tasso di respirazione (Figura 1), i rapporti adenina nucleotide (Figura 2), e il contenuto di potassio tessuto (Figura 3). Utilizzando queste misure, è stato dimostrato che microslices rimangono vitali per almeno 2 ore post-generazione.
Microslices cerebrali possono essere utilizzati per esaminare varie molecole di segnalazione, a seguito di una varietà di stimoli (es. KCl depolarizzazione [figura 4], AMPA, NMDA, glutammato di stimolazione 10), e può anche essere utilizzata per confrontare le risposte di molecole di segnalazione cellulare tra più regioni cerebrali (Figura 4). Inoltre, l'effetto di vari trattamenti inibitori / droga su queste molecole può essere esaminata (come chinasi inibitori 10, agonisti del recettore del glutammato, acido 11 quisqualic 12).
Figura 1. Tassi di respirazione di microslices da proencefalo pollo I tassi di respirazione del tessuto cerebrale sono stati calcolati come segue:. La quantità di ossigeno consumato (differenza tra le letture elettrodi ossigeno all'inizio e alla fine dell'esperimento) moltiplicato per le moli di ossigeno in soluzione, divisa dal tempo di incubazione (ore) e quantità di proteine (mg). Tassi di respirazione tipici di isolato mammiferi corteccia cerebrale sono tra i 55-80 mmol O 2 / g peso fresco / h in condizioni normali 9. n = 9.
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.. Figura 2 Presenza di nucleotidi adenina in microslices dal prosencefalo pollo traccia HPLC rappresentativa misura ATP: rapporti di ADP, eseguiti come precedentemente descritto 13. Alta ATP e bassi livelli di ADP si trovano di solito nelle cellule vitali, considerando diminuzione dei livelli di ATP e aumento dei livelli di ADP sono caratteristici per le cellule apoptotiche e necrotiche 14. Tipico ATP: ADP rapporti di microslices variavano 3:01-06:01, e sono stati mantenuti a questi livelli per più di 2 ore.
Figura 3. Tessuto K + contenuto di microslices cerebrali da immaturo prosencefalo pollo. La determinazione di potassio tessuto è una di noimisura eful di vitalità, come molte delle attività fisiologiche chimica e di un tessuto dipendono da potenziale di membrana, che richiede un normale contenuto di potassio intracellulare 9. Quando microslices sono stati lavati in tampone di K +-libero subito dopo il taglio, il tessuto K + è stato impoverito a livelli che erano appena sopra sfondo (tempo 0). Tuttavia, sulla successiva incubazione con tampone Krebs, le microslices rapidamente accumulati K + dal mezzo circostante, ed entro 5 min di aver raggiunto un livello di stato stazionario simile a quello per microslices non trattati (cioè microslices lavate ed incubate in tampone normale). L'aggiunta di ouabaina (0,2 mM) e EGTA (2 mM) dopo 20 min di incubazione causato tessuto K + contenuti a diminuire a 0 entro 8 min. Ciò dimostra che i microslices normalmente pompa attivamente K +, e che i K + livelli tissutali non sono dovuti a K + intrappolati in tessuto morto o spazi interstiziali. n = 4.
Figura 4. Naturalmente il tempo di GluN2B e GluA1 fosforilazione seguente depolarizzazione con KCl. Microslices stati generati dallo striato e corteccia sensoriale dei ratti maschi (n = 8), utilizzando depolarizzata alta K + Krebs Buffer, omogeneizzato, ed esaminata per (A) GluN2B fosforilazione (a Ser1303) e (B) fosforilazione GluA1 (a Ser845) mediante western blotting in vari momenti dopo la stimolazione (0-300 sec). Livelli di fosforilazione sono normalizzati a GluN2B totale e di espressione GluA1 (cioè fosforilazione / espressione totale). * Indica significatività statistica tra le regioni del cervello (p <0,05). Depolarizzazione con KCl provocato fosforilazione dei recettori GluN2B e GluA1 a S1303 eS845, rispettivamente. Il tasso di GluN2B fosforilazione S1303 variava tra la corteccia e striato, mentre il tasso di GluA1 fosforilazione S845 era la stessa nella corteccia e striato. In esperimenti successivi, abbiamo dimostrato che questo è dovuto al differenziale regolamentazione della chinasi multifunzionale, calcio / calmodulina-stimolata proteina chinasi II (CaMKII), che fosforila GluN2B alla S1303, ma non GluA1 a S845 10. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
Qui, una tecnica in vitro per la generazione di microslices che possono essere utilizzati per esaminare i meccanismi molecolari coinvolti nella eccitotossicità e morte cellulare mediata da ischemia in tessuto cerebrale maturo intatto è descritto. Questa tecnica produce tessuti vitali (figure 1-3), che è metabolicamente simile a grandi fette organotipiche 15. Inoltre, questo modello microslice corrisponde strettamente alla risposta osservata dopo eccitotossicità mediata da lesioni cerebrali in vivo 10. A 90 secondo in vitro di stimolo microslices cervello con AMPA, NMDA, o glutammato induce le stesse risposte in una varietà di molecole (ad es CaMKII, GluN2B, e GluA1) come un secondo periodo di occlusione 90 in vivo 10. Ciò fornisce un'ulteriore conferma che il modello microslice qui descritto è un metodo valido che può essere usato per studiare i meccanismi molecolari coinvolti nella ischemia e eccitotossicolità-mediata morte cellulare.
Come con qualsiasi tecnica sperimentale, questa procedura può essere variata, e queste variazioni può o non può influenzare il risultato sperimentale. Sulla base dell'esperienza, il protocollo qui descritto rappresenta le condizioni ottimali per generare la resa massima tessuto e vitalità microslice. Questo protocollo può essere adattato per l'uso in una varietà di specie (microslices di ratti, topi e polli sono stati precedentemente generato con successo), e da qualsiasi regione del cervello (figure 1-3 raffigurano microslices derivati da tutta proencefalo; la figura 4 illustra microslices derivate dalla corteccia e striato). Inoltre, lo spessore microslice può essere alterato 150-350 micron, senza alcuna perdita apprezzabile di vitalità delle fette. Lo spessore ottimale fetta è di 250 micron, in quanto ciò produce il massimo rendimento del tessuto, e campionamento più riproducibile rispetto per le fette più grandi. Il campionamento statistico del tessuto cerebrale prodotto dallale aliquote di microslices deve essere rappresentativo del tessuto da cui sono state preparate le fette. Per fare questo, abbiamo bisogno di usare le fette più piccole dimensioni per aliquota da garantire un campionamento rappresentativo del tessuto. Le condizioni ottimali per questo sono risultati essere 250 um di spessore, e 1 mg di proteina tessuto, che corrisponde a ~ 15-20 fette / aliquota. La temperatura alla quale microslices dovrebbero essere tagliate e lavate stato studiato confrontando i tassi di respirazione di microslices generati con e senza raffreddamento a 4 ° C. Sebbene gli effetti della acidosi e anossia può essere ridotto quando il tessuto è posto a 4 ° C, microtubuli riassemblaggio può essere modificata se il tessuto è raffreddato e poi rewarmed 16. Questa riorganizzazione del citoscheletro può influenzare l'attività funzionale delle cellule per un certo periodo dopo il riscaldamento. Microslices Noncooled hanno una redditività superiore e la frequenza respiratoria rispetto a fette raffreddate. Inoltre, tre lavaggi (passaggi 3,1-3,3) sono sufficiente per rimuovere la maggior parte dei detriti. Il periodo di equilibrio (punto 3.4), con cambiamenti periodici nel buffer consente ai microslices a 'recuperare' da tagliare, e migliora la riproducibilità in vari saggi funzionali (come ad esempio l'accumulo di calcio).
Il metodo è adatto per esaminare gli effetti di una varietà di stimoli, e dopo il trattamento con farmaci / inibitori. Qualsiasi farmaco / inibitore che è membrana permeabile ha il potenziale di essere esaminati tramite questa tecnica, e qualsiasi molecola che può essere rilevato tramite western blot (o simili) può essere studiato.
In sintesi, la manipolazione di cascate di segnalazione implicate nella eccitotossicità e morte cellulare mediata da ischemia offrono un approccio interessante per lo sviluppo di farmaci che limitano morte neuronale dopo ictus. Il metodo microslice descritto è un modello di facile applicazione che permette la ricerca di queste cascate di segnalazione nel cervello maturo intattotessuto. Questa tecnica può essere utilizzato per identificare nuovi trattamenti che limitano morte neuronale dopo ictus.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi per quanto riguarda qualsiasi parte del lavoro svolto all'interno di questo manoscritto.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di ricerca dalla Salute e medicina Consiglio Nazionale delle Ricerche of Australia, Hunter Medical Research Institute, e l'Università di Newcastle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
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