Summary
Graviditet leder till betydande förändringar av sammansättningen av fettsyror i moderns vävnader. Lipidprofiler kan erhållas via gaskromatografi för att möjliggöra identifiering och kvantifiering av fettsyror i enskilda lipidklasser bland råttor matade olika hög och fettsnål kost under graviditeten.
Abstract
Gaskromatografi (GC) är en mycket känslig metod som används för att identifiera och kvantifiera halten av lipider fettsyran från vävnader, celler och plasma / serum, vilket gav resultat med hög noggrannhet och hög reproducerbarhet. I metabola och näring studier tillåter GC bedömning av förändringar i fettsyrakoncentrationer följande insatser eller under förändringar i fysiologiska tillstånd som graviditet. Fast fas extraktion (SPE) med aminopropyl kiseldioxid kassetter möjliggör separation av de stora lipidklasser inklusive triacylglyceroler, olika fosfolipider och kolesterylestrar (CE). GC i kombination med SPE användes för att analysera förändringar i fettsyrasammansättningen av CE-fraktionen i levern hos jungfru och dräktiga råttor som matats olika höga och fettsnål kost. Det finns betydande kost / graviditet interaktionseffekter vid halt av lever CE yran omega-3 och omega-6 fettsyror, vilket tyder på att gravida kvinnor har en annan reaktion på kost manipulatjon än ses bland jungfru honor.
Introduction
Gaskromatografi (GC) är en väletablerad teknik som används för att identifiera och kvantifiera inkorporeringen av fettsyror i fett pooler och cellmembran 1,2 under tillskott eller fysiologiska tillstånd som fetma (och relaterade sjukdomar som diabetes) eller graviditet 3 - 5. Den är också lämplig för att analysera vilka typer och mängder av fett i livsmedel. Detta är användbart när karakterisera experimentella dieter, samt att se till att livsmedelsindustrin är förenligt med reglerna. Till exempel, kan GC användas för att bekräfta identiteten och mängden av fettsyror i en produkt som ett kosttillskott för att se till att märkningen är korrekt och bestämmelser efterlevs 6,7. Analys av fettsyror kan ge värdefulla insikter i lipidmetabolismen i hälsa och sjukdom, inverkan av kostomläggningen, och effekten av förändringar i fysiologiska tillstånd 8. Användning av GC för att studera prover under graviditeten har gett viktigainformation om förändringar i fettsyror och komplexa lipidhomeostas 3.
I god tid före den kromatografiska separationen, är lipider vanligen extraheras från provet med användning av lösligheten av lipider i lösningsmedels blandningar av kloroform och metanol. Natriumklorid tillsättes för att underlätta separation av blandningen i vattenhaltig och organisk lipid som innehåller faser 9,10. Komplexa lipidklasser av intresse kan separeras från det totala lipidextraktet genom fastfas-extraktion (SPE). Denna separationsteknik eluerar lipid klasser baserat på deras polaritet eller affinitet. Triacyglycerols (TAG) och kolesterylestrar (CE) eluerades först som en kombinerad fraktion, ytterligare klasser, fosfatidylkolin (PC), är fosfatidyletanolamin (PE), och icke-förestrade fettsyror (NEFA) elueras genom ökning av polariteten av elueringsmedlet . Separationen av TAG från CE utnyttjar bindning av TAG till endast en färsk SPE cartriDGE, vilket gör CE som elueras. TAG kan därefter elueras genom att öka polariteten av elueringslösningsmedel 9,10. Denna metod gör det möjligt för flera prov som skall separeras samtidigt med ett högre utbyte än vad som uppnås med tunnskiktskromatografi, vilket betyder att relativt små och medelstora prover (t ex <100 | il plasma eller serum, <100 mg vävnad) kan analyseras 11,12.
GC är en väletablerad teknik som först beskrevs på 1950-talet, det föreslogs att den mobila fasen i den då vätske-vätske system skulle kunna ersättas med ånga. Den användes ursprungligen för olja analys men snabbt expanderat till andra områden såsom aminosyraanalys och lipid biokemi, som fortfarande är av stort intresse. Framsteg inom GC utrustning och teknik som utveckling av kapillärkolonner från de tidigare använda packade kolonner har lett till att våra nuvarande tekniker i vilka fettsyror har möjlighet att varasepareras mer effektivt vid lägre temperaturer resulterar i GC som rutinmässigt används för att identifiera och kvantifiera-fettsyror i en mängd olika undersökningar 13.
GC kräver fettsyror som derivatiseras så att de kan bli tillräckligt flyktig för att elueras vid rimliga temperaturer utan termisk nedbrytning. Detta innebär vanligtvis substitutionen av en funktionell grupp, som innehåller väte för att bilda estrar, tioestrar eller amider för analys. Metylestrar är allmänt studerade derivat, som produceras genom metylering. I denna metod esterbindningarna i komplexa lipiderna hydrolyseras för att frigöra de fria fettsyrorna, vilka transmethylated att bilda fettsyrametylestrar (FAME). Den resulterande profilen för FAME, bestämd med GC, benämnes fettsyrakompositionen och kan lätt jämföras mellan olika försöksgrupper 9,10. Tekniken tillåter både proportionerna av individella fettsyror och deras koncentrationer som skall mätas.
Förutom användning av GC för att analysera fettsyror i näringsstudier och inom livsmedelsindustrin, kan tekniken användas inom ett brett spektrum av analytiska områden. Till exempel innefattar miljöanalyser som använder GC mäter vattenförorening av insekts-och jordanalyser mäter klorhalt. I toxikologi, har GC också använts för att identifiera illegala substanser i urin-och blodprov av individer, en sådan sport prestationshöjande medel 12 och förmågan att separera komplexa blandningar av kolväten gör denna teknik populär inom oljeindustrin för petrokemisk analys 12.
Graviditet är förknippad med betydande förändringar av fettsyresammansättningen av moderns vävnader, särskilt i innehållet av omega-3 (n-3) och omega-6 (n-6) fleromättade fettsyror ACIds (PUFA) 3. I den aktuella studien, exemplifierar vi användning av GC i mätningen av fettsyror genom att beskriva dess användning vid analys av fettsyrasammansättningen i levervävnad tas från jungfrulig och dräktiga råttor som utfodrats med låg-och fettrik kost med olika oljekällor. De experimentella dieter som här var en låg fetthalt sojaolja baserad kost, en fettrik sojaolja baserad kost (130,9 g totalt fett / kg totalt fett) eller en fettrik linolja baserad kost (130,9 g totalt fett / kg diet), anges 20 dagar. Den fullständiga näringsämne och fettsyrasammansättningen av dessa dieter har beskrivits tidigare 14. Sojabönoljan dieter är rika på linolsyra (18:2 n-6) och innehåller en del α-linolensyra (18:3 n-3), medan linolja diet är rik på α-linolensyra. Dessa fettrik kost representerar olika ransoner av linolsyra till α-linolensyra (ransoner av 08:01 och 01:01, respektive). Metoden för isolering av enskilda lipid klasser och analys med GC är vill etablerade och validerade, och har tidigare 10 men utan detaljerad teknisk beskrivning hittas här publiceras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Djurförsök
- Alla djur arbete bör utföras i enlighet med de Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986).
- Mate Wistar-råttor i åldern 10 veckor gamla genom monogamt uppfödning, och bekräfta graviditeten genom uppkomsten av en vaginalplugg. Spela detta som dag 1 i dräktigheten, och börja experimentell diet. För jungfru honor, hysa varje råtta för sig, och börja experimentell diet.
- Efter att mata de experimentella dieter för 20 dagar avliva råttorna genom kvävning med CO2 följt av halsdislokation.
- Använd dissektion pincett och sax för att exponera bukhålan och skära levern genom att skära av ligament, som ansluter levern till membranet, främre väggen i buken, magen och tolvfingertarmen. Tvätta levern i PBS och frysa i flytande kväve före lagring vid -80 ° C.
2. Beredning av ett totalt lipidextrakt 9
- Lägg molecular siktar (för att fylla 1/10 av container lösningsmedel) till alla lösningsmedel för att skapa "torra" lösningsmedel. Utför allt lösningsmedel arbete i ett dragskåp.
- Skär ca 100 mg fryst lever och väger. Placera vävnaden i ett rör i en ishink och tillsätt 0,8 ml iskall 0,9% NaCl. Homogenisera vävnad.
- Lägg interna standarder upplösta i 1 ml / mg torr kloroform: metanol (02:01, v / v) innehållande butylerad hydroxitoluen (BHT, 50 mg / l) som anti-oxidant. För 100 mg råttlever lägga 100 mikrogram av CE-standard (Kolesteryl heptadecanoate 17:00) OBS:. Kloroform och BHT är farliga.
- Lägg till 5,0 ml torr kloroform: metanol (2:1, volym / volym) innehållande BHT (50 mg / L).
- Lägg till 1,0 ml 1 M NaCl, blanda väl genom skakning tills blandningen ser jämn. Prover kan slöts och förvarades vid -20 ° C vid detta skede i upp till en vecka.
- Centrifugera vid 1000 x g under 10 min, låg broms vid rumstemperatur.
- Samla lägrefas med användning av glas pasteurpipett, överföring till nya skruvkork glasrör och torka under kväve vid 40 ° C. Prover kan slöts och förvarades vid -20 ° C vid detta skede i upp till en vecka.
3. Separation av lipidklasser från Solid Phase Extraction (SPE) 10
- Anslut SPE tank till en vakuumpump och placera aminopropyl silika SPE-patron på tanken.
- Placera ny skruvkork glasrör märkta TAG och CE i tanken rack i kolumnen för att samla första fraktionen.
- Lös den totala lipidextraktet i 1,0 ml torr kloroform och skaka.
- Applicera provet på kolonnen med användning av en glas pasteurpipett och låt rinna igenom in i skruvkapsylröret under gravitation. När inga fler droppar falla, ta bort den återstående vätskan genom vakuum.
- Eluera TAG-och CE-fraktionen under vakuum, tvätta kolonnen med 2 x 1,0 ml tvättar torr kloroform.
- När all vätska avlägsnas, torka det TAG och CE fraktionen under kväve vid 40 ° C. Prover kan slöts och förvarades vid -20 ° C vid detta skede i upp till en vecka.
- Placera ny skruvkork glasrör märkta PC i tanken fack under kolumnen.
- Eluera PC fraktionen under vakuum med tillsats av 2 x 1,0 ml torr kloroform: metanol (60:40, v / v) till dess att all vätska avlägsnas från kolonnen.
- Ta bort och torka PC fraktion under kväve vid 40 ° C. Prover kan slöts och förvarades vid -20 ° C vid detta skede i upp till en vecka.
- Placera en ny skruvkork glasrör märkt PE i tanken brickan och eluera PE-fraktion med tillsats av 1,0 ml torr metanol under vakuum.
- Ta bort och torka PE fraktion under kväve vid 40 ° C. Prover kan slöts och förvarades vid -20 ° C vid detta skede i upp till en vecka.
- Placera en ny skruvkork glasrör märkta NEFA i tanken facket och eluera NEFA fraktionen under vakuum genom tillsats av 2 x 1,0 ml tvättningar med torr kloroform: metanol: isättika. (100:2:2, v / v / v) Varning: Isättika är farligt.
- Avlägsna insamlad NEFA fraktion och torka under kväve vid 40 ° C. Prover kan slöts och förvarades vid -20 ° C vid detta skede i upp till en vecka.
- Placera en ny aminopropyl kisel SPE patron på SPE-tanken och placera en skruvkork glasrör i tanken fack under kassetten för att samla in avfall.
- Tvätta kolonnen med 3 tvättar torr hexan under vakuum och därefter en slutlig 1,0 ml tvätt under gravitation. Låt inte kassetten för att bli torr (vända patron kolumnkanalerna till ett stängt läge när hexan nivån nära patronmatrisen) Varning:. Hexan är farligt.
- Byt ut avfallsröret med nya skruvkork glasrör märkt CE.
- Upplös det torkade TAG och CE fraktion (framställd i steg 3.6) i 1,0 ml torr hexan och skaka. Applicera detta till kolonnen med hjälp av ett glas Pasteur pipett och låt droppa igenom under gravity.
- När inga fler droppar faller bort kvarvarande vätska under vakuum.
- Under vakuum, tvätta kolonnen med 2 x 1,0 ml tvättningar med torr hexan för att eluera CE och torr uppsamlade fraktionen under kväve vid 40 ° C. Prover kan slöts och förvarades vid -20 ° C vid detta skede i upp till en vecka.
- Placera en ny skruvkork glasrör märkta TAG i tanken facket och eluera TAG med tillsats av 2 x 1,0 ml tvättningar med torr hexan: metanol: etylacetat (100:5:5) under vakuum.
- Torr uppsamlade fraktionen under kväve vid 40 ° C. Prover kan slöts och förvarades vid -20 ° C vid detta skede i upp till en vecka. Observera: Etylacetat är farligt.
4. Beredning av FAME från CE 10
- Tillsätt 0,5 ml torr toluen till den separerade CE fraktionen (samlas i steg 3.19) och skaka Varning:. Toluen är farligt.
- Förbered metyleringsreagens (torr metanol med 2% (v/ V) H 2 SO 4), varav 1,0 ml krävs per prov. Fördela volym torr metanol i glas eller lämplig plast behållare med lock och tillsätt önskad mängd H 2 SO 4 droppvis blanda sedan genom att vända Varning:. Svavelsyra är farligt.
- Lägg till 1,0 ml av metyleringsreagens till proverna lösta i torr toluen, mössa rören ordentligt, och blanda försiktigt.
- Värm proverna för 2 timmar vid 50 ° C.
- Efter 2 timmar avlägsna rör från värme. När cool lägga 1,0 ml neutraliserande lösning (0,25 M KHCO3 0.5MK 2 CO 3) Varning:. Kaliumbikarbonat och kaliumkarbonat är farliga.
- Lägg till 1,0 ml torr hexan och virvel.
- Centrifugera vid 250 x g under 2 min, låg broms vid rumstemperatur.
- Samla övre fasen, som innehåller FAME, och överför till en ny icke skruvkork disponibel glasrör.
- Torka insamlade FAME ikväve vid 40 ° C. Prover kan slöts och förvarades vid -20 ° C vid detta skede i upp till en vecka.
5. Borttagning av Free Kolesterol Föroreningar från CE FAME 14
(Fri kolesterol kan förorena provet; se figur 1 till exempel kromatografiska spår med och utan fritt kolesterol avlägsnande).
- Placera en avfallsröret i SPE tanken och placera en kiselgel SPE patron på tanken.
- Tvätta kolonnen med 3 x 1 ml tvättningar med torr hexan under vakuum och 1 x 1 ml under gravitation.
- Ta bort avfalls tvättar och lägger till ny avfallsröret i tanken.
- Lös CE FAME i 1 ml torr hexan, virvel.
- Applicera på kolonn med användning av en glas pasteurpipett och låt rinna igenom under gravitation.
- Tvätta kolonnen med 3 x 1 ml tvättningar med hexan under vakuum.
- Ta bort avfalls tvättar och placera nya icke skruvlock röret i tanken märkt CE FAME.
- ElueraCE FAME med 2 x 1 ml torr hexan: dietyleter (95:5 vol / vol) tvättar.
- Torka under kväve vid 40 ° C. Prover kan slöts och förvarades vid -20 ° C vid detta skede i upp till en vecka. Observera: Dietyleter är farligt.
6. Överföring av FAME i GC Auto Sampler Vial
- Lägg till 75 l torr hexan till prov, virvel, och överför till en GC-auto provflaska.
- Lägg till ytterligare 75 l torr hexan till prov, virvel och överföra till samma GC automatiska provflaska. Prover kan slöts och förvarades vid -20 ° C vid detta skede i upp till en månad.
7. Analys med hjälp av gaskromatograf 14
- Analysera FAME på en gaskromatograf. Exempel inrättas: 30 mx 0,25 ìm x 0,25 mm BPX-70 kapillärkolonn av kvarts med temperaturprotokoll:
Utgångstemperatur 115 ° C, håll 2 min, ramp 10 ° C / min till 200 ° C, håll 18,5 min, ramp 60 ° C / min till 245 ° C, hgammal 4 min.
Kolumn: Helium gas, flöde 1.0, tryck 14,6 och hastighet 29.
Injektor: Temperatur = 300 ° C.
Detektor: Väte flöde 40.0, luftflöde 184,0, make up gas Helium, flöde 45,0, temperatur = 300 ° C. - Ställ delningsfaktorn som är lämpligt (t.ex. 25:1 för CE FAME-analys).
- Bestäm arean under varje topp genom att använda lämplig programvara och identifiera FAME genom jämförelse med standarder. Se figur 2 för exempel kromatogram.
- Använd området under data topp för att beräkna bidraget från enskilda fettsyror i procent av totalt fettsyrainnehåll.
- Beräkna absoluta koncentrationer av fettsyror genom att dela upp området för intern standard med det belopp som läggs. Dividera arean av varje fettsyra av detta resultat för att erhålla absoluta koncentrationer av varje fettsyra i den mängd vävnad som används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgången för denna metod är beroende av att följa protokollet exakt och på att använda rena lösningsmedel och reagens för att reducera "brus" och föroreningar som kan finnas på ett kromatogram. Förorenade prov är svårare att analysera, sänka riktigheten av området under kurvan beräkningarna. Om protokollet är framgångsrikt följt ett kromatogram med tydliga symmetriska, väldefinierade toppar och med minimalt bakgrundsljud ska erhållas som illustreras i figur 3. Om kontaminering skett kromatogrammet visar ytterligare toppar och uppvisar icke-symmetriska (skeva) toppar såsom visas i fig 4. Kontamination av fritt kolesterol kommer att inträffa när de kör FAME härledd från CE (se figur 1, om inte kolesterol avlägsnas (såsom beskrivs i protokoll 5).
Användandet av en förberedd kalibreringsblandning möjliggör identifiering av FAME i the prov. Kalibrerings mix drivs med användning av samma instrumentinställningar som proven så att kromatogrammet kan jämföras med provet och toppar korrekt identifieras baserat på deras retentionstider såsom visas i fig 2.
Topparea används för att beräkna den procentuella specifika fettsyror inom den totala. När uppgifterna har samlats in, är det lämpligt att inspektera dem för extremvärden som visas i figur 5. Outlier prover kan sedan undersökas vidare och utvinning och / eller analys upprepas vid behov.
Lägga till en intern standard på prov (såsom beskrivs i protokoll steg 2,3) medger kvantifiering av fettsyror i provet genom beräkningar med hjälp av området för känd mängd av den interna standardtoppen relativt till området för den topp av intresse, och justerat för ursprungliga prov volym eller vikt. I tabell 1, är FAME inom råttlever CE beskrivs som enprocent av totala fettsyror (g/100 g total fettsyra) i levern CE. Dessa uppgifter beskriver CE fettsyror i levern nyproducerade eller dräktiga råttor som matats i 20 dagar på en av tre olika dieter. Statistisk analys med hjälp av två-faktor ANOVA (faktorer: kost, gravida vs virgin) visar signifikanta effekter av kost och graviditet vid andelen flera fettsyror, liksom betydande kost x graviditet interaktioner (tabell 1). Som en illustration, Figur 6 visar att arakidonsyra (AA, 20:4 n-6) halt av lever CE dräktiga råttor är mer influerad av diet än för jungfru honor.
Figur 1. Jämförande gas kromatogram av identiska prover illustrerar vikten av fri kolesterol avlägsnas i råttlevervävnad. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Exempel på den metod som används för att identifiera prov CE FAME från råttlevervävnad med hjälp av en förberedd kalibrering mix. En prepared kalibrering mix drivs med samma instrumentinställningar som proverna så att de kromatogram som kan jämföras för att identifiera fettsyror i provet. Den medföljande kromatogrammet för kalibreringen mixen låter FAME i blandningen som ska märkas. Detta märkta spår kan sedan jämföras med kromatogrammet från provet var lätt identifierbara stora toppar kan jämföras med deras retentionstider med dem på kalibreringsblandning sedan märks på lämpligt sätt. Till exempel markeras på kurvan. är 16:00 för att illustrera jämförelsen av uppehållstider från kalibreringsblandning ovan för att fettsyrorna i provet spår nedanför tillåta korrekt märkning av fettsyror. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Exempel på en förorenad NEFA gaskromatogram erhållits från humanplasma. Det finns många oväntade toppar, som cirklade i början av provet, vilket kan påverka integrationen av äkta toppar. Topparna är avbrutna och odefinierade sedd towar ds slutet av provet och har blivit sluttande som inringat. Detta kommer att påverka noggrannheten av området under kurvan beräkningar och kvantifiering av dessa fettsyror. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 5. Identifiering av utanförliggande data mellan fettsyrasammansättning av lever CE i jungfru råttor som utfodrats en fettrik sojaolja kost (n = 6). Detta visar hur procentdata för analyserade fettsyror kan användas för att bestämma tvetydiga resultat. Dessa data indikerar att provet 125 kan vara en avvikare, och kräver ytterligare utredning. De fem viktigaste fettsyrorna i CE (16:00, 18:00, 18:01 n-9, 18:02 n-6, 20:4 n-6) inte visas.Jpg "target =". _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 6. Halt Arakidonsyra av lever CE bland jungfru och dräktiga råttor matades experimentella dieter. Värdena är medel ± SD, n = 6. Betyder utan en gemensam bokstav skiljer sig, P <0,05. * Skiljer sig från jungfruliga honor inom matchad dietgruppen, p <0,05. Detta är en visuell representation av resultaten från Tabell 1 visar skillnaderna i levern CE innehåll av jungfru råttor som matats olika dieter jämfört med dräktiga råttor matade samma kost. Skillnader kan ses i varje kostgrupp mellan de jungfru och dräktiga råttor. Klicka här för att visa en större bild.
Tabell 1. Fettsyrasammansättning av råttlever kolesterylestrar av nyproducerade och dräktiga råttor matades experimentella dieter. Värdena är medel (SD), n = 6. ND indikerar inte upptäcks (medelvärde <0,1%). Medel utan ett gemensamt brev inom jungfru eller dräktiga honor skiljer sig, P <0,05. * Skiljer sig från jungfruliga honor inom matchad dietgruppen, p <0,05. Denna tabell visar medelvärdena för n-3 och n-6-fettsyror som finns i levervävnad av jungfru och dräktiga råttor som utfodrats med låg och varierande fettrik kost. Resultaten analyserades statistiskt med variansanalys (ANOVA) med en signifikansnivå på P <0,05 för skillnader mellan jungfru och dräktiga råttor, vilken typ av kost och diet x graviditet interaktion. ANOVA resultat tyder på att det finns betydande skillnader i nivåerna av arakidonsyra (20:4 n-6) mellan oskuld och dräktiga råttor inom matched kostgrupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gaskromatografi är en exakt teknik att använda för fettsyraanalys, och dess höga reproducerbarhet anser denna teknik är lämplig för kliniska analyser. Lämpliga GC kolonner måste användas för att möjliggöra identifiering av fettsyror av intresse, med tillgängliga kolumner som har variationer i polariteten av den stationära fasen, kolumn längd och innerdiameter. Användningen av en kapillärkolonn av kvarts i denna analysmetod ger god termisk stabilitet och hög reproducerbarhet av retentionstiderna på grund av sitt höga yta inerthet och bra upplösning 8.
Kritiska steg i detta protokoll omfattar nedre och övre fas insamlingssteg (protokoll steg 2.7 och 4.8). Det är viktigt att så mycket av den korrekta fasen uppsamlas som möjligt utan kontaminering med någon av den oönskade fasen. Närvaron av kontaminanter i ett prov kommer att resultera i en icke önskvärd kromatografisk utsignal, Såsom visas i fig 2. Vid insamling CE under SPE är det absolut nödvändigt att patronkolonner hålls mättad med lösningsmedel (steg 3,15) efter tvättar med hexan för att säkerställa att provet tränger igenom kolonnen för att möjliggöra framgångsrik separering av CE från TAG. Efterföljande separation av CE för att avlägsna fri kolesterol är viktigt att undvika kontaminering som förekommer på kromatografiska spår såsom illustreras i fig. 1. Det är också viktigt att se till att åtgärder som kräver avlägsnande av vätska under vakuum följs noggrant så att all vätska är helt bort från pelaren för att säkerställa en god avkastning.
Den största begränsningen av GC är att komplexa lipider, såsom fosfolipider och triacyglycerols måste förtvålas före derivatisering för att bilda FAME före analys, så information om de specifika strukturer i dessa lipider och typiska kombinationer av fettsyror förloras 10. Alla steg idetta protokoll skall utföras i ett dragskåp på grund av användningen av lösningsmedel, vilket begränsar lämpligheten av omgivningen denna metod kan utföras i. Denna metod kan också vara tidskrävande för att analysera ett litet antal prover, vanligtvis tar två arbetsdagar att få från provet av intresse till datautgång, om inte helt automatiserade förfaranden används. Men, när de behandlar ett större antal prover, varje steg kan göras i omgångar för att maximera tiden effektiviteten i denna teknik och tillgången till utrustning till andra användare. Vissa tekniker inom protokollet kräver övning och fingerfärdighet, såsom övre och undre fas extraktioner (steg 2.7 och 4.8), vilket kan vara ett problem för människor med problematiska leder eller som är utsatta för negativa effekter av repetitiva rörelser.
Steg inom detta förfarande kan lätt läggas till eller tas bort för att underlätta insamlingen av olika fraktioner för ett brett spektrum av provetar, till exempel PE samling får inte krävas vid analys plasma, men är av intresse för cell-och vävnadsprover 10. Denna metod kan också modifieras för analys av celler av total lipid extrakt, där SPE steg kan utelämnas om så önskas. En sådan variant är den som beskrivs för röda blodkroppar, vilket utelämnar totala lipidextraktion steg samt SPE Steg 15. I motsats till det nuvarande protokollet, den metod som används i denna studie använder 250 l av en metyleringsreagens (14% bortrifluorid), som tillsätts direkt till röda blodkroppar tillsammans med 250 l av hexan och upphettas i 10 minuter vid 100 ˚ C. Neutraliseringen steg utelämnas och istället vatten och hexan tillsättes; provet centrifugeras därefter och hexanen övre fasen uppsamlades och överfördes direkt in i en GC-autoprovtagare flaskan utan att torka under kväve och åter-upplösning i hexan.
GC är en mångsidig metod och ger reliable resultat med ett utbud av tillgängliga modifieringar 15 och kan användas för att analysera ett stort antal prover. Den har fördelar jämfört med mass-spektrometri (MS) vid analys av n-6 och n-3 fettsyrametabolism, eftersom det är i stånd att skilja mellan strukturellt likartade fettsyror som den använder retentionstid för märkning i motsats till atommassa. MS kan identifiera fettsyror i ett prov, men inte skilja dubbla positioner obligations i stereoisomerer och därför inte kan tala om vissa fettsyror från varandra. Vid behov kan båda metoderna användas i tandem med GC-MS-16. Denna teknik användes vid undersökning av lipidmetabolism och funktion inom området för lipidomics. Användningen av GC i tandem med MS har lett till stora framsteg eftersom det tillåter manipulering av fettsyra identifiering genom användning av olika stationära faser i GC för att särskilja mellan fettsyror som MS ensam inte kan. GC kan även användas i kombination med elektronpåverkan masspektrometri(EI-MS), som tillåter för identifiering av fettsyrorna när de kombineras med andra alternativa kemiska derivat såsom pikolinyl estrar. Detta breddar användningen av tekniken och fortsätter att förbättra lipid profilering som forskningsmetod inom en rad områden såsom fysiologi, klinisk biomarkörer upptäckt, och patologi, samt lipid biokemi 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för bidraget från Meritxell Romeu-Nadal till råttstudien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Chloroform | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| BHT | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns - 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns - 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas - explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6 mm |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 |
References
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
- Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
- Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
- Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
- American oil chemists society. Gas chromatographic analysis of molecular species of lipids. , The Oily Press, Inc. Available from: http://lipidlibrary.aocs.org (2013).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
- Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
- Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. Quantitative chromatographic analysis. , Marcel Dekker. New York, NY. Part. (2000).
- Bartle, K. D., Myers, P.
- Childs, C. E. The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , University of Southampton, School of Medicine. Available from eprints.soton.ac.uk 378 (2008).
- Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
- Rohwedder, W. K. Mass spectrometry of lipids (USDA). Northern Regional Research Laboratory ARS. , Available from: ddr.nal.usda.gov/bitstream/10113/29457/1/CAIN769045540.pdf (2013).
- Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).
