Protocol
참고 : 모든 실험 프로토콜 프랑스 동물 실험 윤리위원회의 승인 번호 A-75-2065에 "서비스 보호 등 상테 짐승 같은, ENVIRONNEMENT"에 의해 검증되었다. 샘플 크기는 실험의 재현성을 보장하기 위해 선택, 동물 윤리 규정의 3R에 따라 있습니다.
마우스 1. 준비
- 마취
- 촬상의 짧은 기간 (1 시간 미만)를 들면, 케타민 (100 ㎎ / kg) 및 크 실라 진 (10 ㎎ / kg)을 함유하는 식염수 용액 200 μL의 복강 내 주사하여 마우스를 마취시키다.
- 또한, 영상의 긴 기간 동안 (4 시간까지), 적응 마스크를 통해 O 2 / N 2 O의 70/30 혼합물에서 기화 이소 플루 란 2.5 %의 흡입으로 마우스를 마취시키다.
- 참고 :이 방법은보다 안정적인 무의식을 제공하고 약물의 시리얼 복강 내 주입을 방지 할 수 있습니다. 마우스가 마취되면, 니퍼와 발바닥의 자극을 통해 무의식을 확인하십시오.
- 혈관 염색 / 추가 염색
- 혈관의 얼룩 : 꼬리 정맥에 정맥 내 Rhodamin-200 μL의 덱스 트란 (2 MDA 식염수 완충액 중 10 ㎎ / ㎖)을 주입한다.
- 호중구 염색의 경우 : 정맥 꼬리 정맥에 생리 식염수 100 ㎕에 (클론 1A8) Ly6G-PE의 2 μg의 주입.
- 고정화
- 고정의 경우, 현미경 및 마취 가스 흡입기에 맞게 맞춤 제작 한 정위 홀더를 사용합니다.
참고 : sterotactic 소유자는 동물의 머리를 체결 할 수있는 기타 이동식 및 적응 두 개의 금속 플레이트 브래킷, 하나는 고정되어와 함께 금속 지원입니다. - 호흡 운동으로부터 격리를 보장하기 위해 고정 플레이트 사이의 마우스의 머리를 설치합니다. 고정 플레이트와 SK를 스트레칭 머리 사이에 귀를 조인치 안정성과 동물의 호흡 복지를 확인합니다.
- 고정의 경우, 현미경 및 마취 가스 흡입기에 맞게 맞춤 제작 한 정위 홀더를 사용합니다.
- 두피를 제거
- 조심스럽게 눈과의 접촉을 피하고, 멸균 주걱으로 두피의 젖은 머리 에탄올을 70 %를 사용합니다.
- 완전히 정면 뼈 정수리 뼈의 후방에서 두피를 제거하기 위해 멸균 가위와 집게로 피부를 잘라. 광범위한 출혈을 방지하기 위해 눈과 귀에서 3mm까지 멀리 할 것. 두개골 (골막)을 덮고있는 느슨한 결합 조직을 제거합니다. 따뜻한 PBS 적신 종이 타월로 남아있는 머리카락을 세척 할 것.
- 집중 시스템 설정
- 직접 분포를 제어하기 위해 작은 게이지 바늘을 이용하여 두개골에 수술 글루 18mm 직경의 고무 링을 붙여. (30 μL가 충분해야한다) 누출을 방지하기 위해 고무 링의 전체 둘레를 붙인다.
- PBS 적신 종이 타월로 링에서 마지막으로 한 번 두개골을 청소 한 다음의 완전한 침수 37 ° C PBS를 추가두개골. 안구 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈은 0.9 % 염화나트륨 용액 또는 특정 안연고 방울을 추가한다. 목적에 따라 정위 홀더를 드래그합니다.
- 약 직접 전송 현미경을 통해 안구를 사용하여 필드를 놓습니다.
2. 두 광자 이미징 취득
- 선택적으로 680에서 1080 nm의 동조, NIR 광의 140fs 펄스를 제공 사파이어 레이저, 레이저 전력 제어를위한 음향 광학 변조기 : 티타늄과 결합 다 광자 현미경을 사용한다. 2 다이크로 익 미러 (565 nm에서 690 nm의), 610분의 565 및 550분의 500 대역 통과 필터의 조합 (3 형광 채널의 동시 녹음 가능) 3 외부 비 descanned 감지기 (NDD)를 포함하는 구성을 사용하고, 20 (NA = 1) 침수 목적 × 계획 아포 크로 매트 485 짧은 패스 필터.
- anaes 좋은 homeothermy 있도록 가열 챔버를 설정thetized 마우스.,
참고 : 온도는 더 나은 안정성을 위해 세션을 이미징 전에 1 시간을 설정할 수 있습니다. 우리의 경우, 32 ° C는 마취 마우스의 최적의 체온 (36 ~ 37 ° C)를 얻기 위해 선택되었으며, 4 시간까지 유지된다. 이 온도는 사용하는 (디지털 프로브가이 점을 확인하는 데 사용할 수있는) 시스템에 적응 될 수있다. 또한, 사용 된 가열 챔버는 블랙 / 어둡고 외광 오염을 방지 시스템 (목적 및 전동 플레이트)의 일부를 커버한다. - 시스템을 켭니다
- 사파이어 레이저, 다음 전체 현미경 시스템 : 티를 켭니다. 수집 소프트웨어를 시작합니다. 870 nm의 레이저 파장 범위를 설정. 녹음에 적합한 NDD을 선택합니다.
참고 : 우리의 경우, 두 번째 고조파 발생 (SHG) (19)과 시안 형광 단백질 (ECFP)가 485 짧은 패스 필터 후 NDD에 의해 감지됩니다. 550분의 500 대역 통과 필터 및 rhodamin 덱스 트란이 t에 의해 검출 된 후 ECFP도 NDD 의해 검출그는 NDD 610분의 565 대역 통과 필터 후.
- 사파이어 레이저, 다음 전체 현미경 시스템 : 티를 켭니다. 수집 소프트웨어를 시작합니다. 870 nm의 레이저 파장 범위를 설정. 녹음에 적합한 NDD을 선택합니다.
- 인수 설정을 조정합니다
- 소프트웨어의 "라이브 취득"촬상 명령을 사용하여 현미경 방향 제어를 사용하여, 로다 민계 ECFP 신호 영역에 초점을 조정한다. 최소한의 광 손상 최상의 신호 대 잡음비를 구하는 최소 레이저 파워를 설정한다.
주 : 사용 된 전력 설정은 관심 영역의 깊이에 따라 달라집니다. 일반적 AOM 설정은 15 mW의 주위를 넘어 대물 레이저 파워를 나타내는 약 20 %로 설정된다. 그것은 각각의 NDD이 사진 표백 및 사진 손상을 감소하는 PMT가에 이득 전력을 증가하는 것이 좋습니다. 전형적인 획득 설정 1.58 μS 하나의 화소 지속 시간과 스캔 및 배율 1.5 512 X 512 픽셀의 해상도이다.
- 소프트웨어의 "라이브 취득"촬상 명령을 사용하여 현미경 방향 제어를 사용하여, 로다 민계 ECFP 신호 영역에 초점을 조정한다. 최소한의 광 손상 최상의 신호 대 잡음비를 구하는 최소 레이저 파워를 설정한다.
- 관심의 선택 영역
- 기록 파라미터가 설정되면, 다시 "라이브"취득 커맨드를 사용실시간으로 모니터링 할 목적 (X, Y, Z)를 선택하는 필드 조직을 조사.
참고 : 일반적으로, 우리는 혈관 및 실질 영역 모두를 포함하는 필드를 선택했다. - "위치"소프트웨어 명령을 사용하여 필드를 등록합니다.
참고 :이 명령은 X, Y, 다른 먼 필드의 Z 좌표를 기억합니다. - 선택과 같은 절차를 사용하여 (3까지) 관심의 추가 필드를 등록합니다.
- 선택 배율 필요한 볼륨에 따른 제 기억 위치에 "Z-스택"소프트웨어 명령으로 3D의 Z-스택을 설정합니다. 제 깊은 위치하고 높은 위치를 외운다. 깊이 레이저 파워 정규화.
주 : 여러 부수적 필드 촬상을 위해, 우리는 12 μm의 두께의 체적을 확보하기 위해 각 필드의 3 μm 인 Z-5 단계로 구분하여 슬라이스를 획득. 이러한 설정은 연구 셀의 타입에 적응 될 수있다.
- 기록 파라미터가 설정되면, 다시 "라이브"취득 커맨드를 사용실시간으로 모니터링 할 목적 (X, Y, Z)를 선택하는 필드 조직을 조사.
- 시작 획득
- 선택220; 시계열 "소프트웨어 명령 및 시간 간격의 지속 기간과 사이클의 수를 선택한다. "실험을 시작"소프트웨어 명령을 선택하여 필요한 시간의 경과와 기간에 따라 시간 경과 영상을 시작합니다.
주 : 우리의 경우는 30 분 실시간을 나타내는 60 사이클 동안 하나의 볼륨 각각 30 초를 획득. 작은 시간 경과는 혈관에서 고속 셀 압연을 추적하기 위해 수행 될 수있다. 이 경우, Z 얇게 스택 및 2 개 이하의 상이한 필드에 동시에 기록 될 수있다. - 셋업의 정기적 인 모니터링.
- 항상 의식이 있는지 확인하기 위해 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
참고 : 수염 또는 동물의 다리의 동요는 부흥의 지표입니다. 동물의 호흡이 불규칙적 인 경우에, 이소 플루 란의 양이 다소 감소 될 수있다. 인수시 강한 조직 드리프트는 마우스 부흥의 지표입니다. - 목표를 확인하는 것은 제대로 담근다. 37 ° C PBS의 betwee 갱신N 개의 인수 (30 분).
참고 : 인수시 신호의 프로그레시브 실종 PBS 누설의 지표입니다.
- 항상 의식이 있는지 확인하기 위해 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
- 선택220; 시계열 "소프트웨어 명령 및 시간 간격의 지속 기간과 사이클의 수를 선택한다. "실험을 시작"소프트웨어 명령을 선택하여 필요한 시간의 경과와 기간에 따라 시간 경과 영상을 시작합니다.
- 절차의 끝
- 필요한 동영상이 기록되면, 신속하게 심폐 소생술 전에 자궁 전위에 의해 동물을 안락사.
주 : 상처 치유는 길이 촬상을 수행 할 수있는 가능성을 제한하는 24 ~ 48 시간에 딱지의 형성을 유도.
- 필요한 동영상이 기록되면, 신속하게 심폐 소생술 전에 자궁 전위에 의해 동물을 안락사.
3. 데이터 분석
- 드리프트 보정
- 3D 자동 추적 Imaris 비트 평면의 소프트웨어를 사용합니다.
- Imaris에 3D 이미지 시퀀스를 엽니 다. 선택 명령을 "발견", 균일 분야에서 배포 가능하면, 4 개의 앵커 포인트의 최소 모든 시점 수동 추적 (마우스 클릭 + 이동)을 생성합니다.
- "편집 트랙"탭에서 "올바른 드리프트"명령을 사용하여 드리프트 보정을 적용합니다.
- t에 대한 확인그는 X에있는 보정, Y, 특히 Z에서의 품질은 artefactual 흔들림을 방지 할 수 있습니다.
참고 : 보정이없는 만족스러운 경우, 다른 고정 점을 시도하거나 분석에서 비디오를 제외합니다.
- 셀 추적
- 명령 "새로운 관광 명소를 추가"를 사용 및 알고리즘 설정 "시간이 지남에 트랙 명소"를 선택합니다. 다음 단계로 이동합니다.
- "소스 채널"명령을 사용하여 관심있는 전체 채널 중 하나를 자동 세포 추적 절차를 적용합니다. 10 μm의 개체를 설정합니다 (즉, 세포) 직경. 다음 단계로 이동합니다.
참고 : 선택은 측정 된 신호의 객체와 특이도의 차이에 따라 달라집니다. 즉, 전체 채널에 자동 추적은 검출 된 신호가 관심 대상에 특정한 경우에만 가능하다. SHG 및 ECFP 모두 485 짧은 패스 필터 후의 NDD 의해 검출되기 때문에,보다 구체적으로는 트래킹 및 오 후 NDD ECFP 의해 기록 신호를 이용하여 효율적인 것00/550 대역 통과 필터. 클러스터 또는 조밀 한 포장 객체는 3.1.2 단계와 유사 개별 개체의 수동 선택이 필요합니다. - "품질"필터 유형을 선택 불특정 객체의 추적을 제외 할 임계 값을 설정합니다. 다음 단계로 이동합니다.
- 두 지점 사이의 "최대 거리"와 "갭의 크기"의 정확한 매개 변수와 함께 "브라운 알고리즘 모션"을 선택합니다. 트랙 생성을 확인합니다.
- 트랙이 자동으로 계산되면, "트랙 기간"필터 유형을 선택 인 트랙 (4 시점을 나타내는)보다 짧은 120 초를 제거하기 위해 임계 값을 설정합니다.
- 필수 : 자동 추적 한 결과, 트랙의 품질을 확인.
- 객체가 트랙 경로를 따라 확인하는 시간 줄을 풀다. , "편집"탭에서 사용할 수 트랙 포인트 보정의 옵션을 사용하지 않는 경우 : "삭제"명령 (모든 트랙 페이지를 삭제하여 허위 또는 부적절한 트랙을 삭제OINT 개별적으로) "연결 해제"명령을 사용하여. 트랙 경로가 불연속 인 경우, 누락 된 시점 (마우스 클릭 + 이동)를 추가 주어진 트랙에서 모든 지점을 선택하고 사용하는 "편집 트랙"탭에서 명령을 "연결".
- 정량 매개 변수
- , "환경 설정"명령에서 "통계"탭을 선택 목록에서 관심있는 동적 매개 변수를 선택합니다. 선택 명령 및 생성 된 엑셀 파일을 저장 "파일을 모든 통계를 내 보냅니다."
참고 : 여러 동적 매개 변수가 직접적 트랙 길이, 순간 속도, 평균 속도로 소프트웨어에서 얻은, 그리고 직진을 추적하고 있습니다. 운동성 계수 6은, (20)을 결정할 수 있지만, 소프트웨어에 의해 직접 제공되지 않는다. - 각 셀의 경우, 시간 (ΔT)의 각 기간에 대한 변위의 평균 계산 (30 초 시간 경과 영화를, ΔT는 30, 60, 90 초, 등이 될 것이다).시간 간격의 함수로서 사각형의 평균 변위를 플롯. 곡선의 직선 부분의 기울기를 계산함으로써 운동성 계수를 구하는.
- , "환경 설정"명령에서 "통계"탭을 선택 목록에서 관심있는 동적 매개 변수를 선택합니다. 선택 명령 및 생성 된 엑셀 파일을 저장 "파일을 모든 통계를 내 보냅니다."
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Representative Results
마우스 두개골 구조는 생체 내에 영상에 의해 골수 생리학을 연구 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다. 프런트 정수리 주변 얇게 뼈, 그것은 뼈의 마모없이 medullar 틈새에 접근 할 수있다. 1 MacBlue 트랜스 제닉 마우스의 두개골 넓은 2D 필드를 나타내는 도표. 뼈 매트릭스는 주로 SHG (19)에 의해 쉽게 검출 I 콜라겐으로 구성되어있다. rhodamin - 덱스 트란의 주입은 골수의 혈관 네트워크 얼룩과 뼈 매트릭스와 선박 (14) 사이의 실질 골수 틈새 시장의 식별이 가능합니다. ECFP 세포는 골수의 두 구획으로 분포되지만 골 기질로부터 결석된다. 단구 수동 조직 내에서의 위치에 따라 분류된다. 혈관 단핵구는 전체 셀 용기의 크기를 무시하고, 맥관계 내에있을 때 정의된다. 만 큰 수집 세정맥 우리에서 제외됩니다nalysis. 세포가 혈관 및 골 기질 사이에 위치 할 때 실질 단구 정의된다.
관심 (보충 비디오 1과 2)의 특정 영역의 시간 경과 영상 중 하나 혈관 (그림 2A) 또는 실질 (그림 2B) 단핵구 시간이 지남에 따라 개별 셀 궤도의 계산이 가능합니다. 트랙 길이는 실질 단핵구 디스플레이 혈관 단핵 세포에 비해 변위를 감소 있음을 보여줍니다. 시간에 따른 변위의 분석은 두 구획 (도 2C)의 단핵구의 평균 속도를 비교한다. 시간의 함수로서 평균 제곱 변위 랜덤 모션의 공간적 정도의 척도이다. 운동성 계수 (토론 섹션 참조) 곡선의 직선 부분의 기울기에 의해 결정되며, 셀의 변위 좋은 아이디어를 제공한다. 혈관 단핵구 (MC = 71μm² / S)의 운동성 계수는 운동성 coefficie보다 높은실질 단핵구의 NT (MC = 4.4μm² / s) 등이 있습니다.
취득 시간 해상도는 평균 셀 속도에 적응되어야한다. 롤링 혈관 단핵구 짧은 시간 지연 내에 중요한 변위를 만들 수있다. 보다 정확한 추적을위한 세포, 취득 시간 간격을 줄이는 것이 바람직하다.도 3은 두 개의 서로 다른 시간 해상도 단핵구 추적의 예시를 도시한다. 30 초의 시간 간격은 10 초 시간 간격에 비해 정확도뿐만 아니라 (녹색 파선)의 경로 길이를 감소시킨다.
마지막으로,도 4는 단핵구에 부수적으로 다른 세포 서브 세트를 분석 할 수있는 가능성을 나타낸다. Ly6G 성숙 마우스 호중구의 특정 마커입니다. (이 경우에 Phyco-erythrin) 형광 색소와 결합 된 항 - Ly6G의 주입 직접 생체 내 이미징 시퀀스 얼룩 호중구 전에 5 분. 이 접근법은 추가 희미 제공분석 및 가능성 ension는 다른 세포 서브 세트의 동작을 비교한다. 이러한 접근법은 단핵구 구획 서브 세트를 정의하는 데 사용될 수있다.
두개골 골수 조직의 그림 1. 넓은 시야. MacBlue 마우스에서 두개골 정상 상태 골수의 생체 내 두 광자 레이저 스캐닝 현미경 이미지. (빨간색) 혈관 이미징 세션 전에 2MDa Rhodamin 덱스 트란 5 분의 꼬리 헛된 주입으로 얼룩진됩니다. 뼈는 두 번째 고조파 발생 (파란색)에 의해 가시화된다. ECFP + 단핵 세포 (시안)은 실질 틈새 시장 (혈관과 뼈 사이의 어두운 부분) 내에 위치하며, 혈관 내.되는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2. 실시간 추적 셀. (A)과 혈관 (B) 내의 실질 단핵구의 시간에 따른 주제 트랙 경로. 각 셀에 대한 트랙 (녹색 선) 소프트웨어에 의해 자동으로 생성됩니다. 붉은 반점 추적 세포의 질량 중심을 나타낸다. 혈관 및 간 실질 단핵구 (C)의 평균 속도를 비교. 맨 - 휘트니 통계 분석은 *** 혈관과 실질 단핵구 표현되는 시간의 함수로서 p <0.001. (D) 평균 제곱 변위 (MSD)를 나타내고, 수행되었다. 선형 곡선이 비 - 제한된 환경에서 임의의 거리를 나타내는 반면, 점근 곡선은 시간에 따른 세포의 제한된 변위를 나타낸다. 운동성 계수는 셀의 변위의 정도를 나타내고, (C)의 기울기에 의해 결정된다 선형 회귀에 의해 계산 urve. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
롤링 단핵 세포의 연구 그림 3. 시간 간격 해상도를 제공합니다. 대표 이미지 시퀀스가 증가 된 시간 해상도는 롤링 세포 궤도의 정밀도를 향상을 보여준다. 10 초 시간 간격 (최대) 이미지 시퀀스. 30 초 시간 간격 (아래) 이미지 시퀀스. 트랙 경로의 품질이 향상되고, 동일하거나 반대를위한 두 개의 서로 다른 세포를 고려의 위험이 감소한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
medullar 호중구와 단핵구의 생체 공동 현지화 그림 4..이 그림은 형광 색소와 결합 된 단클론 항체를 주입하여, 병용 단핵 세포와 생체 내에서 다른 세포 하위 집합을 감지 할 수있는 가능성을 보여줍니다. Ly6G-PE 항체의 2 μg의 5 분 MacBlue 마우스의 두개골 골수 이미징 전에 정맥 주사하고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
실질 단핵구의 보충 비디오 1. 철새 행동. MacBlue 마우스의 두개골 골수 실질에서 단핵 세포의 정상 상태 철새 활동의 생체 내 3D 이미징. ECFP + 신호는 시안입니다. 각 셀 (빨간 점)에 대한 철새 경로는 녹색으로 표시됩니다.
혈관 단핵구의 보충 비디오 2. 철새 행동. MacBlue 마우스의 두개골 골수 혈관에서 단핵 세포의 정상 상태 철새 활동의 생체 내 3D 이미징. ECFP + 신호는 시안입니다. (2M 다) 로다 덱스 트란은 골수 혈관계 (적색)을 구별하는 촬상 세션 전에 주입 하였다. 각 셀 (빨간 점)에 대한 철새 경로는 녹색으로 표시됩니다.
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Discussion
생체 내 영상화 방법의 중요한 점은 영상의 지속 시간을 최대화하고 염증 세포의 역학에 영향을 줄 수있는 세균 오염 및 염증의 위험을 최소화하기 위해 초점 안정성을 보장한다. 수술은 골수에 접근하는 것은 최소한의 수행으로 두개골 골수의 영상은 이러한 목표를 다음과 같습니다. 멸균 물질 및 방부제의 사용은 세포 항상성 교란을 유발할 수있는 감염의 위험을 제한하기 위해 필수적이다.
정위 홀더의 개발은 도전하고 (목적 및 전동 현미경의 무대, 마취 가스 흡입기의 사용 사이의 거리) 특정 각 시스템에 대한 사용자 정의를 필요로 할 수도 있습니다. 이는 넓은 촬상면 액세스 가능한 수평으로 마우스의 머리를 얻는 것이 중요하다. 동물이 배치되면, 몇 분의 requir 수 있다는 가능성ED는 초점면의 양호한 안정성을 얻었다. 따라서, 취득 녹음을 시작하기 전에 조직 드리프트를 확인하는 것이 좋습니다. 관심 지역의 선택과 함께이 과정 동안 지속될 수 있기 때문에, 그것은 또한 정기적으로 Ketamin / 자일 라진이 사용 된 경우 동물이 의식이 있는지 확인하고, 누수 및 증발 할 수있는 목표의 적절한 침수를 확인하는 것이 좋습니다 발생합니다.
두개골에 고무 링의 좋은 위치는 과정에서 또 다른 중요한 단계를 나타냅니다. 시아 노 아크릴 레이트 접착제 및 밀봉 안정성면에서 좋은 결과를 제공하지만, 한 조직의 관심 영역과 두개골 블록 액세스를 커버 할 수 접착제의 과도한 하중을 방지 할 필요가있다. 유리 커버 슬립이없이 직접 침지 두개골의 장점은 뼈의 깊은 영역에 대한 액세스를 얻을 것이다. 두개골이 편면가 없기 때문에, 이것은 콘에 이미징 영역을 제한하지 않을 것이다그림 1에 표시되는 넓은 이미지 필드를 허용 두개골과 커버 슬립 사이의 재치 표면,,.
모든 영상 기술의 경우, 수집 속도와 해상도 품질 사이의 선택은 타협이다. 따라서, 숫자 및 단위 시간당 화상의 품질이 한정되고, 선택은 어드레싱 과학적 문제에 의존한다. 실질 단핵구가 느린 운동성 또는 고착는 반면 일반적으로 혈관 단핵구 빠르고 세포를 압연하고 있습니다. 롤링 세포의 정확한 추적이도 2에 도시 된 바와 같이 획득 높은 시간 해상도를 요구한다. 고착 세포에 대한 높은 촬상 레이트 쓸모 높은 X, Y이며, Z 분해능은, 예를 들어 덴 드라이트의 돌출 활성을 분석하는 것이 바람직 할 수있다. 고속 셀들은 그들의 변위 Z의 긴 트래킹을 얻을 두꺼운 부피를 필요로한다.
시간의 함수로서 평균 제곱 변위 Imaris 소프트웨어가 제공되지 않는다. 프린이 사실에 기초하여 표기 르 어떤 구조가 발생하거나 수축없이 탄도 이동 객체에 대해,이 이동 거리가 시간 간격 (도 2D)에 비례 할 것이라고. 따라서, 슬로프의 선형성은 비 제한된 환경에서 랜덤 워크를 나타낸다. 반대로, 곡선의 형상은 점근 세포 집단의 시간에 따른 변위 제한을 반영한다. 이 계산의 두 번째 장점은 속도 때때로 질량 중심의 변위 artefactual 과대 평가된다는 점이다. 이 볼록 활동 느린 운동성 세포에 특히 중요하다. 따라서, 선형 회귀에 의해 계산 된 곡선의 기울기 운동 계수 계산 cellover 시간 (21)의 실제 변위를 나타낸다.
생체 내 Ly6G 얼룩이 촬상 과정의 분석의 새로운 매개 변수를 추가하는 가능성을 예시한다 (도 3 등의 알을) 제안하지 이동성의 결함을 관찰 없다. 혈관 호중구의 98 % 이상이 제대로 분류되지만, 골수 호중구의 염색이 덜 효율적이며, 평균 형광 강도가 강하게 골수 실질 향해 항체의 감소 된 액세스를 시사 감소 (데이타 미기재). 세포 기능에 대한 Rhodamin 덱스 트란, 양자점 또는 DAPI, 요오드화 프로피 듐 등의 사멸 또는 괴사 성 세포의 다른 특정 염료, SYTOX 22, 형광 리포터는 반응성 산소 종 (23)의 생산과 같은, 촬상 동안 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 추가 될 수있다 과정과는 세포 죽음, 식균 작용 및 호중구 세포 트랩 등의 기능적 특성을 정량화 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다. Mazo 등은 12 멋지게 두 개의 서로 다른 혈관 염료를 사용더 나은 대비 실질과 혈관에 높고 낮은 분자량. 형광 염료의 선택은 다른 형광 기자의 수반으로 얻을 수 있도록하는 것이 중요합니다. 사실, 여기 파장은 모든 사용 형광 염료 사이의 최고의 타협을 얻기 위해 따라 선택됩니다.
본원에 사용되는 프로토콜은 생체 내에서 지금까지 어려웠다 연구 그중 셀 구획의 생물학적 활성을 분석하는 것을 가능하게한다. 골수 조직의 조직 학적 분석은 대개 얇은 섹션을 허용 탈회 골의 긴 준비가 필요하고, 단지 정적 조직 뷰를 제공한다. 동적 뷰 실질 및 골수 세포 정현파 사이의 환율을 강조한다. 이 프로세스는 빠른 염증성 신호 또는 5 myeloaplasive 화학 요법 전처리시 세포 동원기구의 더 나은 이해를 위해 해독하는 중요한 단계이다6 요법. 우리는 세포 intravasation 6의 이벤트를보고했지만이 과정으로 인해 정상 상태에서 낮은 주파수에 거의 감지 할 수 있습니다. 그러나, 염증성 신호 전달시의 향상이 예상된다. 이러한 CCR2, CX3CR1 또는 CXCR4 같은 케모카인 수용체는 매우, intravasation의 과정에서 세포 이동의 경로에 새로운 근본적인 통찰력을 제공한다 이들 수용체의 유전자 무효화 따라서 사용을 내포하고 있습니다
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Acknowledgments
저자는 편집 지원 앤 다론 (Daron)과 피에르 루이 Loyher을 감사드립니다, 두 광자 현미경 및 지원을 사육 쥐에 대한 동물 시설 "NAC"와 카밀 Baudesson에 대한 지원은 Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS). 부여 계약에 따라 이러한 결과로 이어지는 연구는 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램에서 자금 지원을받은 (FP7 / 2007-2013) N 304810 ° - 공습을, n은 대학 학자 피에르 등의 마리 퀴리에서 INSERM에서 241,440 - Endostem을, ° "등장 "라에서" "에서,"리그 contre 르 암 협회는 라 공들인 쉬르 르 암을 부어 "과에서"직원은 국립 드 라 공들인 "프로그램의 출현 2012 (ANR-EMMA-050). PH는 라 "리그 contre 르 암"에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
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