Protocol
NOTA: Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Experimentación Animal y Ética francés y validados por el "Servicio de Protección et Santé Animales, Environnement" con el número A-75 hasta 2065. Los tamaños de muestra se eligen para asegurar la reproducibilidad de los experimentos, y de acuerdo con el 3R de la regulación ética animal.
1. Preparación del ratón
- Anestesia
- Para corto período de formación de imágenes (menos de 1 hr), anestesiar el ratón con una inyección intraperitoneal de 200 l de una solución salina que contiene ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg).
- Alternativamente, para el período de formación de imágenes más largo (hasta 4 horas), anestesiar el ratón con una inhalación de isoflurano 2,5% vaporizado en una mezcla 70/30 de O 2 / N 2 O, a través de una máscara adaptada.
- NOTA: Este modo proporciona la inconsciencia más estable y evita la inyección intraperitoneal en serie de fármacos. Una vez que el ratón está anestesiado, comprobar la inconsciencia a través de la estimulación de la pata con pinzas.
- Tinción Vascular / tinción adicional
- Para la tinción vascular: Inyectar por vía intravenosa en la vena de la cola, 200 l de rodamina-dextrano (2 MDA, 10 mg / ml en tampón de solución salina).
- Para la tinción de neutrófilos: inyecte 2 g de Ly6G-PE (clon 1A8) en 100 l de solución salina por vía intravenosa en la vena de la cola.
- Inmovilización
- Para la inmovilización, utilizar un soporte estereotáctica por encargo adaptado al microscopio y al inhalador de gas anestésico.
NOTA: El titular estereotáctica es un soporte de metal con dos soportes de placa de metal, que se está fijo y la otra extraíbles y adaptables, para apretar la cabeza del animal. - Instale la cabeza del ratón entre las placas de retención para asegurar el aislamiento de los movimientos respiratorios. Apriete los oídos entre placas de retención y la cabeza para estirar el sk. El registro para la estabilidad y la respiración bienestar del animal.
- Para la inmovilización, utilizar un soporte estereotáctica por encargo adaptado al microscopio y al inhalador de gas anestésico.
- Retire el cuero cabelludo
- Utilizar con cuidado etanol al 70% para mojar el cabello del cuero cabelludo con un aplicador estéril, evitando el contacto con los ojos.
- Cortar la piel con las tijeras y alicates estériles para eliminar completamente el cuero cabelludo del retroceso del hueso parietal en el hueso frontal. Mantener alejado de hasta 3 mm de ojos y oídos para prevenir sangrado abundante. Retire el tejido conectivo laxo que cubre el cráneo (periostio). Lavar el cabello restante con una cálida toalla de papel empapada en PBS.
- Sistema de inmersión configurado
- Pegue un anillo de goma de 18 mm de diámetro con pegamento quirúrgico directamente en el cráneo usando una aguja de pequeño calibre para controlar la distribución. Pegamento de toda la periferia del anillo de goma para evitar fugas (30 l deberían ser suficientes).
- Limpie el cráneo debajo del ring por última vez con una toalla de papel empapada en PBS y luego añadir 37 ° C PBS para la inmersión completa de lacráneo. Añadir una gota de NaCl 0.9% solución o ungüento oftálmico específico en cada ojo del ratón para evitar la sequedad de los ojos. Arrastre el titular estereotáctica con arreglo al objetivo.
- Aproximadamente colocar el campo utilizando el ocular del microscopio a través de la transmisión directa.
2. Dos fotones Imaging Acquisition
- Utilice un microscopio multifotónica junto con un láser de Ti: Cristal de zafiro, que proporciona 140fs pulsos de luz NIR, sintonizable selectivamente de 680 a 1080 nm, y un modulador acústico-óptico para el control de la potencia del láser. Utilice una configuración que incluye 3 detectores externos no descanned (NDD) (que permiten la grabación simultánea de 3 canales fluorescentes) con una combinación de 2 espejos dicroicos (565 nm y 690 nm), 565/610 y 500/550 filtros de paso de banda, y un filtro de paso corto 485, con un plan de apochromat × 20 (NA = 1) objetivo de inmersión en agua.
- Establezca la cámara de calentamiento para permitir una buena homeotermia de los ANAESratón anestesiados.,
NOTA: La temperatura puede ajustarse de 1 hora antes de la formación de imágenes de sesión para una mejor estabilidad. En nuestro caso, 32 ° C ha sido elegido para obtener la temperatura corporal óptima del ratón anestesiado (36-37 ° C) y se mantiene hasta 4 horas. Esta temperatura puede ser adaptado para el sistema utilizado (sonda digital puede ser utilizado para comprobar este punto). Además, la cámara de calentamiento utilizado es oscuro / negro y cubre una parte del sistema (objetivos y la placa motorizada) para evitar la contaminación de luz externa. - Encienda el sistema
- Encienda el láser de Ti: Zafiro, entonces todo el sistema de microscopio. Inicie el software de adquisición. Ajuste el rango de longitud de onda del láser de 870 nm. Seleccione NDD apropiado para la grabación.
NOTA: En nuestro caso, generación de segundo armónico (SHG) 19 y la proteína fluorescente cian (ECFP) son detectados por el DDN después del filtro de pase corto 485. ECFP también es detectado por el NDD después del filtro de paso de banda 500/550 y rodamina-dextrano es detectado por tél NDD después del filtro de paso de banda 565/610.
- Encienda el láser de Ti: Zafiro, entonces todo el sistema de microscopio. Inicie el software de adquisición. Ajuste el rango de longitud de onda del láser de 870 nm. Seleccione NDD apropiado para la grabación.
- Ajustar la configuración de adquisición
- Utilice el comando de imágenes "adquisición en vivo" del software y utilizar el control direccional microscopio, ajustar el enfoque en una región con ECFP y Rodamina señal. Ajustar la potencia del láser al mínimo para obtener la mejor relación señal a ruido con un mínimo de foto-daño.
NOTA: El ajuste de la potencia que se utiliza varía según la profundidad de la zona de interés. Normalmente la configuración de OMA están distribuidas alrededor de un 20%, lo que representa una potencia de láser más allá del objetivo alrededor de 15 mW. Es mejor para aumentar el poder de ganancia en los PMT para cada NDD para reducir foto-blanqueo y foto-daño. Ajustes de adquisición típicos son la exploración individual con un tiempo de permanencia de píxel de 1,58 mS, y una resolución de 512 x 512 píxeles con un aumento de 1,5.
- Utilice el comando de imágenes "adquisición en vivo" del software y utilizar el control direccional microscopio, ajustar el enfoque en una región con ECFP y Rodamina señal. Ajustar la potencia del láser al mínimo para obtener la mejor relación señal a ruido con un mínimo de foto-daño.
- Seleccione las regiones de interés
- Una vez que los parámetros de grabación se establecen, utilice de nuevo el comando de adquisición "en vivo",y examinar el tejido para elegir un campo deseado (x, y, z) para monitorizar en tiempo real.
NOTA: Por lo general, se optó por un campo que incluye tanto vascular y áreas del parénquima. - Registrar el campo con el comando de software "posición".
NOTA: Este comando memoriza x, y, z las coordenadas de los diferentes campos distantes. - Seleccionar y registrar campos de interés adicionales (hasta 3), utilizando el mismo procedimiento.
- Establecer una pila Z 3D con el comando de software "z-stack" en la primera posición memorizada de acuerdo con el volumen requerido con aumento elegido. Memorizar posición más profunda primero, y luego la posición más alta. Normalizar la potencia del láser con la profundidad.
NOTA: Para imágenes campo concomitante múltiple, adquirimos 5 rebanadas separadas por 3 micras z pasos para cada campo para adquirir un volumen de 12 micras de espesor. Estas configuraciones pueden ser adaptados para el tipo de célula estudiado.
- Una vez que los parámetros de grabación se establecen, utilice de nuevo el comando de adquisición "en vivo",y examinar el tejido para elegir un campo deseado (x, y, z) para monitorizar en tiempo real.
- Adquisición de Lanzamiento
- Seleccione el220, el tiempo de la serie de comandos de software "y seleccione la duración de intervalo de tiempo y el número de ciclos. Comience time-lapse de acuerdo con el lapso de tiempo y la duración requerida seleccionando el comando de software "iniciar el experimento".
NOTA: En nuestro caso, vamos adquiriendo un volumen cada 30 segundos durante 60 ciclos que representan a 30 min en tiempo real. Más pequeño lapso de tiempo se puede realizar para pista de rodadura celular rápido en el vaso sanguíneo. En este caso más delgado z-pila y no más de 2 campos diferentes se pueden grabar al mismo tiempo. - El control regular de la puesta en marcha.
- Siempre controlar al animal para asegurarse de que está inconsciente.
NOTA: Sacudida de bigotes o las piernas del animal son indicadores de avivamiento. En el caso de la respiración del animal es carne seca, la cantidad de isoflurano se puede reducir ligeramente. La deriva de tejido fuerte durante la adquisición es un indicador del renacimiento del ratón. - Asegúrese de que el objetivo se sumerge correctamente. Renovar 37 ° C PBS between dos adquisiciones (30 min).
NOTA: la desaparición progresiva de la señal durante la adquisición es indicador de PBS fugas.
- Siempre controlar al animal para asegurarse de que está inconsciente.
- Seleccione el220, el tiempo de la serie de comandos de software "y seleccione la duración de intervalo de tiempo y el número de ciclos. Comience time-lapse de acuerdo con el lapso de tiempo y la duración requerida seleccionando el comando de software "iniciar el experimento".
- Fin del procedimiento
- Una vez que se registran los videos requeridos, la eutanasia a los animales por dislocación cervical rápidamente antes de la reanimación.
NOTA: la curación de heridas conduce a la formación de una costra en 24 a 48 horas lo que limita la posibilidad de realizar las imágenes longitudinal.
- Una vez que se registran los videos requeridos, la eutanasia a los animales por dislocación cervical rápidamente antes de la reanimación.
Análisis 3. Datos
- Corrección de la deriva
- Utilice software Imaris Bitplane para el seguimiento automático 3D.
- Abra la secuencia de imágenes 3D en Imaris. Seleccione "spot" de comandos, y generar el seguimiento manual (clic del ratón + shift) para todos los puntos de tiempo por un mínimo de 4 puntos de anclaje diferentes, si es posible distribuida homogéneamente en el campo.
- Aplicar la corrección de la deriva con el comando "deriva correcta" en la pestaña "editar pista".
- Compruebe tque la calidad de la corrección en x, y y z en particular para evitar la vacilación artefactual.
NOTA: Si la corrección no es satisfactoria, pruebe otros puntos de anclaje o excluir el video del análisis.
- Seguimiento de la célula
- Utilice "añadir nuevos puntos" del sistema y seleccione "puntos de la pista con el tiempo" ajuste algoritmo. Vaya al paso siguiente.
- Aplicar el procedimiento de seguimiento automático de células, ya sea en todo el canal de interés con el comando "canal de origen". Objetos Set (es decir, las células) de diámetro a 10 micras. Vaya al paso siguiente.
NOTA: La elección dependerá de la distinción entre los objetos y la especificidad de la señal medida. En resumen, el seguimiento automático de todo el canal es posible sólo si la señal detectada es específica para el objeto de interés. Debido a que tanto SHG y ECFP son detectados por el NDD después del filtro 485 pase corto, de seguimiento será más específica y eficiente utilizando la señal de ECFP registrada por el NDD después de la 500/550 filtros de paso de banda. Agrupados o objetos embalados densas requieren selección manual de objetos individuales similares al paso 3.1.2. - Seleccione el tipo de filtro "de calidad", ajustar el umbral para excluir el seguimiento de objetos inespecíficos. Vaya al paso siguiente.
- Elija "browniano algoritmo Motion" con parámetros precisos de "distancia Max" y "tamaño Gap" entre dos puntos. Validar generación pista.
- Una vez que las pistas se calculan automáticamente, seleccione "Duración pista" tipo de filtro, ajustar el umbral para eliminar pistas más cortas que 120 segundos (lo que representa 4 puntos de tiempo).
- Obligatorio: Después de seguimiento automático, comprobar la calidad de las pistas.
- Desenrolle la barra de tiempo para comprobar que los objetos siguen los caminos de pista. Si no, utilice las opciones de corrección de punto de seguimiento disponibles en la pestaña "editar": Eliminar pistas falsas o incorrectas con "borrar" de comandos (borrar cualquier pista point individualmente con el comando "desconexión"). Si pista de atletismo es discontinua, añadir puntos de tiempo que faltan (clic con el ratón + shift), seleccione todos los puntos en una pista dada, y el uso de "conectar" de comandos en la pestaña "editar pista".
- Parámetros de cuantificación
- Seleccione la pestaña "Estadísticas" al mando "Preferencias", seleccione los parámetros dinámicos de interés de la lista. Seleccione "Exportar todas las estadísticas para presentar" comando y guardar el archivo de Excel generado.
NOTA: Varios parámetros dinámicos se obtienen directamente desde el software como longitudes de pista, velocidad instantánea, velocidad media, y un seguimiento de la rectitud. Coeficiente de Motilidad 6, 20 puede determinarse, pero no está directamente proporcionada por el software. - Para cada celda, calcular la media de los desplazamientos para cada período de tiempo (dt) (para una película de lapso de tiempo de 30 seg, dt será de 30, 60, 90 seg, etc).Trazar la media del desplazamiento cuadrado como una función del intervalo de tiempo. Obtener coeficiente de la motilidad mediante el cálculo de la pendiente de la parte lineal de la curva.
- Seleccione la pestaña "Estadísticas" al mando "Preferencias", seleccione los parámetros dinámicos de interés de la lista. Seleccione "Exportar todas las estadísticas para presentar" comando y guardar el archivo de Excel generado.
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Representative Results
La estructura del cráneo del ratón ofrece una buena oportunidad para estudiar la fisiología de la médula ósea por intravital de imágenes. El hueso ser delgado alrededor de la zona frontal parietal, es posible obtener acceso a nichos medulares sin abrasión del hueso. La figura 1 representa un amplio campo 2D del cráneo de un ratón transgénico MacBlue. La matriz ósea está compuesta principalmente de colágeno I fácilmente detectable por SHG 19. La inyección de rodamina-dextrano tiñe la red vascular de la médula ósea y permite la identificación de nichos del parénquima de la médula ósea entre la matriz ósea y los vasos 14. ECFP células se distribuyen en los dos compartimentos de la médula ósea, pero están ausentes de la matriz ósea. Los monocitos se clasifican manualmente de acuerdo a su ubicación dentro del tejido. Monocitos Vascular se define cuando toda la célula se encuentra dentro de la vasculatura, sin tener en cuenta el tamaño de la embarcación. Sólo grandes vénulas colectores están excluidos de nuestra unnálisis. Monocitos parénquima se define cuando la célula se encuentra entre la vasculatura y la matriz ósea.
Time-lapse de las zonas de interés (video complementario 1 y 2) permite el cálculo de la trayectoria de células individuales en el tiempo, ya sea vascular (Figura 2 A) o del parénquima (Figura 2B) monocitos. La longitud de la pista que muestra la pantalla monocitos parenquimatosas reduce el desplazamiento en comparación con los monocitos vasculares. Análisis del desplazamiento en el tiempo se compara la velocidad media de los monocitos en ambos compartimentos (Figura 2C). El desplazamiento cuadrático medio como una función del tiempo es una medida de la extensión espacial de movimiento aleatorio. Coeficiente de la motilidad se determina por la pendiente de la parte lineal de la curva y proporciona una mejor idea del desplazamiento celular (ver sección de discusión). El coeficiente de la motilidad de los monocitos vasculares (MC = 71μm² / s) es mayor que el coefficie motilidadnt de los monocitos del parénquima (MC = 4.4μm² / s).
La resolución momento de la adquisición debe adaptarse a la velocidad de celda promedio. Monocitos vasculares enrollables pueden hacer desplazamiento importante dentro de un lapso de tiempo corto. Para un seguimiento más preciso de células, reduciendo el intervalo de tiempo de adquisición es preferible. La Figura 3 muestra una ilustración de seguimiento de monocitos con dos tiempos para resoluciones diferentes. Un intervalo de tiempo 30 seg reduce la precisión, así como la longitud de las vías (en línea discontinua verde) en comparación con el intervalo de tiempo 10 seg.
Finalmente, la Figura 4 ilustra la posibilidad de analizar otro subconjunto de células de forma concomitante a los monocitos. Ly6G es un marcador específico de los neutrófilos de ratón maduros. La inyección de anti-Ly6G combinado con un fluorocromo (en este caso Fico-eritrina) 5 min antes de que los neutrófilos de la mancha de secuencias de imágenes directamente in vivo. Este enfoque proporciona una tenue adicionalensión de análisis y la posibilidad de comparar el comportamiento de los diferentes subconjuntos de células. Tal enfoque podría utilizarse para definir subconjuntos en los compartimentos de monocitos.
Figura 1. En vivo de dos fotones de imágenes de microscopía de escaneo láser de estado estacionario cráneo de médula ósea de ratón MacBlue Amplio campo de la organización de la médula ósea del cráneo.. Vasculatura (en rojo) está manchada por la inyección de cola vano de 2MDa rodamina-dextrano 5 min antes de la sesión de imágenes. El hueso se visualiza por segunda generación armónica (azul). ECFP + monocitos (Cian) se encuentran dentro de los nichos del parénquima (zonas oscuras entre vasculatura y hueso) y dentro de los vasos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. celular de seguimiento en tiempo real. Caminos representativos de la pista a lo largo de tiempo de los monocitos dentro de (A) la vasculatura y (B) el parénquima. Canciones (línea verde) para cada celda son generados automáticamente por el software. Manchas rojas representan el centro de masa de las células de orugas. (C) comparación de medias de velocidad entre vasculares y parenquimatosos monocitos. Análisis estadístico de Mann-Whitney se ha realizado, *** representa p <0,001. (D) Media desplazamiento cuadrado (MSD) como una función de tiempo está representado por vasculares y parenquimatosos monocitos. Curva asintótica indica el desplazamiento restringido de las células con el tiempo, mientras que la curva lineal indica paseo aleatorio en un entorno no-restringida. Coeficiente de la motilidad indica el grado de desplazamiento de células y se determina por la pendiente de la c Urve calculado por regresión lineal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Resolución Intervalo de tiempo en el estudio de los monocitos rodantes. Secuencias de imágenes representativos muestran que el aumento de resolución de tiempo mejora la precisión de la trayectoria de células de laminación. (Arriba) Secuencia de imágenes con intervalos de tiempo de 10 seg. (Abajo) Secuencia de imágenes con intervalos de tiempo de 30 seg. La calidad de la pista de atletismo se ha mejorado y el riesgo de considerar dos células diferentes para el mismo o lo contrario se reduce. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 4. En vivo co-localización de los neutrófilos y los monocitos medulares. Esta figura ilustra la posibilidad de detectar otro subconjunto de células in vivo de forma concomitante con monocitos, mediante la inyección de anticuerpo monoclonal específico combinado con un fluorocromo. 2 mg de anticuerpo Ly6G-PE ha sido inyectado por vía intravenosa 5 minutos antes de exponer la médula ósea del cráneo del ratón MacBlue. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
De vídeo suplementario 1. comportamiento migratorio de monocitos parenquimatosas. In vivo 3D de imágenes de la actividad migratoria de estado estacionario de los monocitos en el parénquima de la médula ósea del cráneo de un ratón MacBlue. La señal ECFP + se encuentra en cian. Trayectorias migratorias de cada célula (punto rojo) aparecen en verde.
complementario de vídeo 2. comportamiento migratorio de monocitos vasculares. In vivo 3D de imágenes de la actividad migratoria de estado estacionario de los monocitos en la vasculatura de la médula ósea del cráneo de un ratón MacBlue. La señal ECFP + se encuentra en cian. (2M Da) rodamina-dextrano se inyecta antes de la sesión de formación de imágenes para distinguir la vasculatura de la médula ósea (rojo). Trayectorias migratorias de cada célula (punto rojo) aparecen en verde.
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Discussion
Los puntos críticos de la metodología de formación de imágenes en vivo son para asegurar la estabilidad del foco a fin de maximizar la duración de la formación de imágenes y para reducir al mínimo el riesgo de contaminación bacteriana y la inflamación, lo que podría afectar la dinámica de las células inflamatorias. Imaging del hueso del cráneo ósea sigue estos objetivos como la cirugía realizada para obtener acceso a la médula ósea es mínima. El uso de material estéril y antisépticos es esencial para limitar el riesgo de infección que podría inducir perturbaciones en la homeostasis celular.
El desarrollo del titular estereotáctica puede ser difícil y requiere personalización específica para cada sistema (distancia entre el objetivo y la etapa motorizada del microscopio, el uso de inhalador de gas para la anestesia). Es importante conseguir la cabeza del ratón lo más horizontal posible para un acceso a la superficie de imagen más amplia. Una vez que el animal se coloca, es probable que varios minutos pueden ser required para obtener una buena estabilidad del plano focal. Por lo tanto, se recomienda comprobar la deriva tejidos antes de iniciar la grabación de adquisición. Debido a este proceso, junto con la selección de las regiones de interés puede durar un tiempo, también se recomienda comprobar regularmente que el animal está inconsciente si ketamina / xilazina se han utilizado, y para verificar la inmersión adecuada del objetivo como fugas y evaporación puede ocurrir.
El buen posicionamiento del anillo de goma en el cráneo representa otro paso crítico en el proceso. Pegamento de cianoacrilato ofrece buenos resultados en términos de estabilidad y de sellado, pero uno necesita para evitar la carga excesiva de cola, lo que podría cubrir el cráneo y bloquear el acceso a la región de interés del tejido. La ventaja de la inmersión directa del cráneo sin un cubreobjetos de vidrio es conseguir el acceso a las regiones más profundas de la médula. Además, dado que el cráneo no es una superficie plana, esto no limita el área de imagen a la contrasuperficie de contacto entre el cráneo y el cubreobjetos, lo que permite un campo de la imagen de ancho, como se muestra en la Figura 1.
Para todas las tecnologías de la imagen, la elección entre la velocidad de adquisición y calidad de resolución es un compromiso. Así, el número y la calidad de imágenes por unidad de tiempo son limitados, y la elección depende de la pregunta científica dirigida. Típicamente, los monocitos son células vasculares rodando rápido, mientras que los monocitos parenquimatosas son móviles lenta o sésiles. Un seguimiento preciso de las células de laminación requiere mayor resolución momento de la adquisición, como se muestra en la Figura 2. Alta tasa de formación de imágenes para células sésiles es x inútiles y altos, y, z resolución puede ser preferible para analizar la actividad de protrusión de las dendritas por ejemplo. Células Fast requerirían volumen más grueso para conseguir un seguimiento más largo de su desplazamiento en z.
El desplazamiento cuadrático medio como una función del tiempo no es proporcionada por el software Imaris. El principLe de esta representación basada en el hecho de que, para un objeto que viaja balísticamente sin cualquier encuentro o constricción estructural, la distancia que viajó sería proporcional al intervalo de tiempo (Figura 2D). Así linealidad de la pendiente indica un paseo aleatorio en un entorno no-restringido. En contraste, la forma asintótica de la curva de reflejaría un desplazamiento limitado en el tiempo de la población celular. La segunda ventaja de este cálculo es que la velocidad es a veces sobreestimada por el desplazamiento artefactual de centro de masa. Esto es particularmente importante para la célula móvil lento con la actividad de protrusión. Por lo tanto, el cálculo del coeficiente de la motilidad por la pendiente de la curva calculada por regresión lineal indica un desplazamiento real del tiempo cellover 21.
Tinción Ly6G in vivo ilustra la posibilidad de añadir un nuevo parámetro de análisis durante el proceso de formación de imágenes (Figura 3 et al, en prensa). Aunque más de 98% de neutrófilos vasculares se etiquetan, la tinción de neutrófilos de médula ósea es menos eficiente, y la intensidad media de fluorescencia se reduce considerablemente, lo que sugiere la reducción del acceso del anticuerpo hacia el parénquima de la médula ósea (datos no mostrados). Dextrano rodamina, puntos cuánticos, u otros colorantes específicos de células apoptóticas o necróticas tales como Dapi, yoduro de propidio, Sytox 22, o reportero fluorescente para las funciones celulares tales como la producción de especies reactivas de oxígeno 23, se pueden añadir por vía intravenosa a través de la vena de la cola durante la exploración proceso y ofrecen una buena oportunidad para cuantificar las propiedades funcionales, tales como la muerte celular, la fagocitosis y la trampa extracelular neutrófilos. Mazo et al 12 bien utiliza dos colorantes diferentes vascularescon un peso molecular bajo y alto a un mejor contraste parénquima y vasculatura. La elección del colorante fluorescente es crítico para permitir la adquisición simultánea de los diferentes reporteros fluorescentes. De hecho, la longitud de onda de excitación será elegido en consecuencia para obtener el mejor compromiso entre todos los tintes fluorescentes utilizados.
El protocolo utilizado en este documento hace que sea posible analizar in vivo la actividad biológica de un compartimento celular, estudio de que era difícil hasta ahora. El análisis histológico del tejido de la médula ósea por lo general requiere una larga preparación de descalcificación ósea para permitir sección delgada, y sólo proporciona una visión estática del tejido. La visión dinámica resalta el tipo de cambio entre las células del parénquima y los sinusoides de la médula ósea. Este rápido proceso es un paso crucial para descifrar el fin de tener una mejor comprensión del mecanismo de movilización de células en señal inflamatoria 5 o acondicionamiento previo de quimioterapia myeloaplasiveRégimen 6. Nos han informado de casos de intravasación celda 6, pero este proceso es apenas detectable debido a la baja frecuencia en estado estable. Sin embargo, es probable que se mejoradas a partir de la señalización inflamatoria. Los receptores de quimiocinas tales como CCR2, CX3CR1 o CXCR4 están muy implicados en el proceso de intravasación, de ahí el uso de invalidación genética de estos receptores deberían proporcionar nuevos conocimientos fundamentales en las vías de migración celular
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Anne Daron y Pierre Louis Loyher para asistencia editorial, la Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) para obtener ayuda con el microscopio de dos fotones y el Fondo para el animal "NAC" y Camille Baudesson para los ratones que se reproducen asistencia. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7 / 2007-2013) en virtud del acuerdo de subvención n ° 304810 - RAID, y n ° 241440-Endostem, del Inserm, de la Université Pierre et Marie Curie "Emergence ", de la" Ligue contre le cancer ", de" Asociación para la Investigación sobre el Cáncer le "y de la" Agence Nationale de la Recherche "Aparición Programa 2012 (ANR-EMMA-050). PH recibió el apoyo de la "Ligue contre le cancer".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
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