Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Guld nanorod-assisteret Optisk Stimulation af neuronal Cells

Published: April 27, 2015 doi: 10.3791/52566
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biotactical Engineering, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology

Introduction

Nylige undersøgelser har vist, at forbigående opvarmning forbundet med absorptionen af infrarødt lys af vand (bølgelængde> 1.400 nm) kan anvendes til at inducere virkningspotentialer i nervevæv 1 og intracellulære calcium transienter i cardiomyocytter 2. Brugen af ​​infrarødt lys har rejst stor interesse til anvendelser i neurale proteser, på grund af den potentielle finere rumlig opløsning, manglende direkte kontakt med vævet, minimering af stimulering artefakter og fjernelse af behovet for at genetisk modificere cellerne før stimulation ( som krævet i optogenetics) 1. På trods af alle disse fordele, nyligt udviklede termiske modeller foreslået, at target væv / celler kan blive påvirket af kumulative opvarmning effekter, når flere stimulus sites og / eller høj repetitionshastigheder anvendes 3,4.

Som svar på disse udfordringer, har forskere erkendt potentialet til at bruge ydre absormer for nerve stimulation til at producere mere lokal opvarmning effekter i vævet. Huang et al. Demonstrerede dette princip ved hjælp af superparamagnetiske ferrit nanopartikler til at aktivere fjernadgang de temperaturfølsomme TRPV1 kanaler i HEK 293 celler med en radio-frekvens magnetfelt 5. Selv om denne teknik kan give mulighed for dybere penetration (magnetfelter interagerer relativt svagt med væv), blev svarene kun registreret over perioder på sekunder i stedet for de millisekund varigheder, der kræves i bioniske enheder 5. Tilsvarende Farah et al. Påvist elektrisk stimulation af rotte corticale neuroner med sorte mikropartikler in vitro. De viste celle-niveau præcision i stimulation ved hjælp af impulser i størrelsesordenen flere hundrede mikrosekunder og energier i intervallet μJ, potentielt giver mulighed for hurtigere repetitionshastigheder 6.

Anvendelsen af ​​ydre absorbere er også blevet anvendt til at induceremorfologiske ændringer i vitro. Ciofani et al. Viste en stigning i neuronal celleudvækst ~ 40% ved anvendelse af piezoelektriske bornitrid nanorør exciteres ved ultralyd 7. Tilsvarende har endocytoserede jernoxid nanopartikler i PC12-celler blevet rapporteret at forbedre neurit differentiering på en dosis-afhængig måde, som følge af aktivering af celleadhæsionsmolekyler med jernoxid 8.

For nylig har interessen for ydre absorbere at hjælpe neural stimulation også fokuseret på anvendelsen af ​​guld nanopartikler (AU NP'er). Au NP'er har evnen til effektivt at absorbere laserlyset på plasmoniske top og til at sprede den ind i det omgivende miljø i form af varme 9. Blandt alle de tilgængelige partikelformer den optiske absorption af guld nanorods (Au NR'er) bekvemt passer det terapeutiske vindue af biologiske væv (nærinfrarød - NIR, bølgelængde mellem 750-1,400 nm) 10. Desuden i context af neural stimulation, anvendelse af Au NR'er giver relativt gunstig biokompatibilitet og en bred vifte af overfladefunktionalisering muligheder 11. Nylige undersøgelser har vist, at en stimulerende virkning på differentiering kan induceres efter kontinuerlig laser engagementer Au NR'er i NG108-15 neuronale celler 12. Ligeledes blev intracellulære calcium transienter optaget i neuronale celler dyrket med Au NR'er efter laser bestråling moduleret med variable frekvenser og pulslængder 13. Cellemembranen depolarisering blev også registreret efter NIR laser belysning af Au NR'er i primære kulturer af spiral ganglieneuroner 14. Den første in vivo ansøgning med bestrålede Au NR'er er påvist for nylig. EOM og medarbejdere udsat Au NR'er på deres plasmoniske top og indspillede en seks-dobling i amplituden af ​​forbindelse nerve aktionspotentialer (CNAPs) og en tre-fold fald i tærsklen stimulation i rotte ischiadicus nerver. Den entierne svar blev tilskrevet lokale opvarmning virkninger som følge af excitation af NR plasmoniske top 15.

I det foreliggende papir, er protokoller for at undersøge virkningerne af laser stimulation i NG108-15 neuronale celler dyrket med Au NR'er angivet. Disse metoder giver en enkel, men kraftfuld, måde at bestråle cellepopulationer in vitro ved hjælp af standard biologiske teknikker og materialer. Protokollen er baseret på et fiber-koblet laser diode (LD), der tillader sikker drift og gentagelig tilpasning. AU NR forberedelse og laser prøve bestråling metoder kan yderligere udvides til andre partikel former og neuronale cellekulturer, forudsat at de specifikke syntese og kultur protokoller er kendte, hhv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Au NR'er Forberedelse

Bemærk: Au NR'er kan syntetiseres ved en række opskrifter 16, eller købt fra kommercielle leverandører.

  1. Mål den indledende optisk densitet (OD) af Au NR opløsning via UV-Vis-spektroskopi, ved registrering af absorptions- værdier fra 300 nm til 1000 nm med en opløsning på 0,5-2 nm. Variere volumen af ​​opløsning, der skal anvendes med de tilgængelige kuvette.
  2. Vurdere den indledende NP molære koncentration med en egnet teknik 17 (f.eks UV-Vis spektroskopi, enkelt partikel induktivt koblet plasma massespektrometri, transmission elektronmikroskopi) eller bruge koncentrationsværdier fastsat af sælgeren.
  3. Forbered en 5 ml stamopløsning ved fortynding af oprindelige Au NR prøve at nå frem til en OD = 1. For den bedste repeterbarhed, holde OD konstant for alle de undersøgte prøver. Følg kommerciel leverandør protokol for sammensætningen af ​​det fortyndende opløsningsmiddel. Hvis du er usikkerBrug demineraliseret vand.
  4. Centrifuge 1 ml af Au NR opløsning to gange i 15 minutter ved 7.800 xg for at fjerne enhver kemisk overskud fra opløsningen. Centrifugeringsbetingelserne cyklusser kan variere i kraft og tid (fx 20 min ved 5.600 × g) 18.
  5. Fjern supernatanterne og re-suspendere NR'er i deioniseret vand. Som resuspenderede partikler kan danne aggregater i opløsning, forberede dem dagligt for at få de bedste resultater. Alternativt butik i et køleskab i længere tid end 1 uge. Må ikke nedfryses.
  6. Før brug under celledyrkningsbetingelser, sonikeres Au NR opløsningen i 5 minutter og derefter sterilisere med UV-lys i 30 minutter (UV-stråling intensitet ikke er mindre end 400 mW ∙ m -2 ved 254 nm).

2. NG108-15 neuroncellelinje Kultur og differentiering

  1. For celledyrkningsmediet, forberede 500 ml sterilt Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) indeholdende 10% (w / v) føtalt kalveserum (FCS), 1% (w / v) L-glutamin, 1%(W / v) penicillin / streptomycin og 0,5% (w / v) amphotericin B.
    Bemærk: Kosttilskud kan alikvoteret, opbevaret ved -20 ° C og tilsat til mediet på dag kræves. Celledyrkningsmedium kan nedkølet i steril tilstand i maksimalt 1 måned.
  2. For celledifferentiering medium, forberede 50 ml sterilt DMEM indeholdende 1% (w / v) L-glutamin, 1% (w / v) penicillin / streptomycin og 0,5% (w / v) amphotericin B.
  3. Grow NG108-15 neuronale celler i 10 ml cellekulturmedium i T75 kolber fremstillet af polystyren i en inkubator med fugtig atmosfære (5% CO2 ved 37 ° C). Normalt frø 1,5-2 × 10 5 celler i hver kolbe at være klar i 3-4 dage. Skift celledyrkningsmedium hver to dage.
    Bemærk: For at undgå genetiske driver eller variation, brug ikke celler ældre end passage 21 for eksperimenter.
  4. Når 70-80% sammenflydende i kultur, ændre mediet med varm frisk celledyrkningsmedium. Mekanisk løsne cellerne ved forsigtigt knocking bunden af ​​sammenflydende kolbe. Brug ikke trypsin.
  5. Centrifugeres cellesuspensionen i 5 minutter ved 600 xg og re-suspendere cellepelleten i 2 ml varmt celledifferentiering medium.
  6. Seed 2 × 10 4 celler / cm2 i en vævskultur polystyren 96-brønds plade med 200 pi celledifferentiering medium. Inkubér eksperimentet i 1 dag ved 5% CO 2/37 ° C.
  7. Tilføj mellem 3,2 × 10 9 -4.2 × 1 0 10 partikler / ml Au NR løsning på dag 2 og inkuber det i yderligere 24 timer. Tilsæt ikke partiklerne for kontrolforsøg.
    Bemærk: Som alternativ kontrol, kan Au nationale parlamenter med en veldifferentieret peak absorption bølgelængde bruges til sammenligning 14. For en mere konsekvent celle adfærd holde celledensiteten konstant og ikke ændrer brøndens overflade før cellepodning.

3. neuritudvækst Enhancement

  1. Parlaseren med en single-mode optisk fiber (numerisk åbning = 0,13), og afslutte den med en fiber-stik (FC stik er praktisk og almindeligt tilgængelige). Måle output laser magt med en standard power meter. For at opnå de mest effektive resultater, der svarer til top laserens bølgelængde til plasmonresonans top af NR'er.
  2. På dag 3 efter NR inkubation fastsætte FC stik til brønden. Bestråle prøver og kontroller ved stuetemperatur i 1 min i kontinuerlig bølge, for forskellige laser beføjelser. Tillad kulturen at fortsætte i yderligere 3 dage ved 5% CO 2/37 ° C. Gentag laser bestråling i mindst 3 uafhængige målinger.
    Bemærk: Forskellige bestrålingstider og kan vælges impulsfrekvenser, afhængigt af anvendelsen.
  3. Karakterisere laseren i form af stråle diameter og laser irradians (W ∙ cm -2).
    1. For en standard single-mode fiber, bruge NA = n ∙ sin θ,hvor n er brydningsindekset for mediet i brug, og θ er den halve vinkel af lyskeglen forlader fiberen (se figur 1A). Fra trigonometri, R = tan θ ∙ d, hvor r er strålen radius og d er afstanden mellem fiberen og prøven. FC stikket passer til diameteren af brønden, derfor belysning af prøven i en afstand d = 2,70 ± 0,20 mm. Lys forlader fiberen i vand (n = 1,33), hvilket giver R = tan (SIN-1 (NA / n)) ∙ d.
    2. Ved hjælp af sidstnævnte ligning, beregne laserstrålen radius, den tilsvarende stråle område og den gennemsnitlige laser bestråling (laser power divideret med stråle område) på målet (se eksempel grafen i figur 1B). Disse værdier repræsenterer den gennemsnitlige bestrålingsstyrke i det belyste område.
    3. Vurdere fejlene for målinger med den generelle teori for fejl formering.
      Bemærk: Afstanden Between kan måles FC stik og prøven ved fotografier af forsøgsopstillingen og efterbehandling af billedet ved hjælp af passende software (f.eks ImageJ).
  4. På dag 5 fjernes celledifferentiering medium fra forsøgene og fastgør prøverne med 3,7% (v / v) formaldehydopløsning i 10 minutter, derefter permeabilisere cellerne med 0,1% (v / v) Triton X-100 for 20 min.
  5. Tilsæt 3% (w / v) bovint serumalbumin (BSA) til prøverne for 60 min at blokere uomsatte proteinbindingssteder. Mærk prøverne for anti-βIII-tubulin natten over (5 ug / ml i PBS suppleret med 1% BSA) ved 4 ° C.
  6. Inkubér cellerne i 90 min i mørke med et passende sekundært antistof (f.eks TRITC-konjugeret anti-muse-IgG-antistof) under anvendelse af en koncentration på 0,4-2 ug / ml i 1% BSA i PBS. Mærk cellekernerne med DAPI (0,1 ug / ml i deioniseret vand) i 10 minutter.
    Bemærk: antistofkonjugation og koncentration MIGht variere ifølge virksomheden protokollen. Vask prøver med PBS to gange i 5 minutter efter hver farvning etape.
    Figur 1
  7. Billede prøver ved epifluorescens eller konfokal mikroskopi under anvendelse af mindst 20 × mål. Vælg mikroskopet filtrerer følgelig til det sekundære antistof. Vælg en DAPI filter (λ EX = 358 nm; λ EM = 488 nm) for at visualisere cellekerner.
  8. Analyser billederne ved at vurdere: i) den maksimale neurit længde (record længden fra spidsen af ​​neurit til begyndelsen af ​​cellen kroppen), ii) antallet af neuritter pr neuronal celle (opsummere alle neuritter per celle) og iii) den procentdel af celler med neuritter (dividere det samlede antal celler, der udtrykker βIII-tubulin med det samlede antal af celler med en positivt farvet kerne) 19.

4. Laser-induceret intracellulær Ca2 + Imaging

Der fremstilles en 20% (w / v) stamopløsning af Pluronic F-127 ved at opløse 2 g af opløst stof i 10 ml vandfrit dimethylsulfoxid (DMSO). Opvarm opløsning af Pluronic F-127 ved 40 ° C i ca. 20 min for at øge opløselighed. Forbered det på forhånd, hvis de opbevares ved stuetemperatur.
  • På dag 3 efter NR inkubation udarbejde en balanceret saltopløsning (BSS; 135 mM NaCl, 4,5 mM KCI, 1,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 5,6 mM glucose og 10 mM HEPES, pH 7,4) og suppleret med 5 uM Fluo-4 AM DMSO og 0,1% (w / v) Pluronic F-127-opløsning.
    Bemærk: BSS løsning kan være forberedt på forhånd og nedkølet i højst 1 måned. Tilføj kosttilskud (Fluo-4 AM og Pluronic F-127) på dagen for forsøget.
  • Fjern celledifferentiering medium og erstatte det med den suppleret BSS løsning. For at opnå de bedste resultater med et omvendt konfokal mikroskop, inkuberes cellerne i en mikro-slide godt.
  • Load NG108-15 celler med Fluo-04:00i 30 minutter i mørke ved 5% CO 2/37 ° C. Efter inkubationstiden vaskes prøverne to gange med BSS at fjerne eventuelle ekstracellulære ubelastet fluorofor.
  • Par laseren med en single-mode optisk fiber og spalte spidsen anvendelse af standardteknikker. Overhold den resulterende spidsen under et optisk mikroskop, for at sikre en høj kvalitet overflade (dvs. spidsen skal være vinkelret på fiberaksen og flad ved mikroskopi inspektion).
    1. Måle output laser magt med en standard power meter. Sæt lys levering fiber i en optisk fiber holder og anbring den på en micropositioner. Se Brown et al. 20 for flere detaljer om optisk forberedelse og positionering fiber.
      Forsigtig: Følg de generelle regler for laser sikkerhed under målingen af laser magt (f.eks ikke se direkte ind i laserstrålen, slid laser sikkerhedsbriller ved håndtering, forhindre falsk lys eksponering for andre lab-brugere) <./ Li>
  • Tilslut et oscilloskop til den bærbare laser til at overvåge den optiske modulation. Brug et binært signal med variable frekvenser (0,5-2 Hz) og pulslængder (20-100 ms). Tilslut laser ved hjælp af graduering signal som transistor-transistor logiske (TTL) input til mikroskopet, efter opsætningen vist i Paviolo et al. 13.
    1. Placer cellerne under et omvendt konfokal mikroskop og placere lyset levering fiber 250 ± 50 um væk fra målet celle i transmission belysning mode. På denne afstand, skal du bruge ligninger præsenteres i 3.3.1 at beregne strålen radius på målet.
  • Brug et argon-ion-laser (488 nm) for at ophidse den internaliserede Fluo-04:00 farvestof (λ EX = 494 nm; λ EM = 516 nm) og synkroniseret LD for excitation af de endocytoserede NR'er. Udfør billeddannelse ved stuetemperatur af prøver og kontrol ved hjælp af mindst 40 × målsætning ved at indsamle tid-serie scanningermed 256 × 256 pixels / ramme opløsning i tur mode med en frekvens på mindst 4 Hz. Udfør en optagelse uden nogen LD excitation at identificere eventuelle argon-ion laser interferens (baseline støj).
  • Fjern baggrund fra data ved hjælp adaptivt vægtede straffet mindste kvadraters algoritmer 21. Plot de inducerede Ca2 + variationer som en funktion af tiden. Analyser forbigående toppe i fluorescensintensitet ved anvendelse billede efterbehandling software ved tærskelværdiansættelse på et niveau tre gange standardafvigelsen af ​​den basislinje støj (3σ).

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Ved anvendelse af protokol 1, 2 og 3 er beskrevet her, blev en stimulerende virkning på differentiering observeret i NG108-15 neuronale celler dyrket med Au NP'er (Au NR'er, poly (styrensulfonat) belagte Au NR'er og siliciumdioxidovertrukket Au NR'er) efter laser engagementer mellem 1,25 og 7,5 W · cm -2. Konfokale billeder af rhodamineB-mærket Au NR'er viste, at partiklerne blev internaliseret fra dag 1 af inkubation 12. Lokaliseringen blev overvejende observeret i cellecytoplasmaet, hvilket indikerer, at den foretrukne mekanisme optagelse var via cellen organ membranen 12. De vigtigste morfologiske ændringer opdages efter at inducere differentiering i NG108-15 nerveceller var anholdelsen af spredning, ekspressionen af βIII-tubulin proteinet og udvækst af neuritter, som blev analyseret i form af maksimal længde og nummer 22.

    Prøver dyrket med NR'er viste en neurit længde stigning på laser irradistandsprogrammer niveauer målt her (mellem 1,25 og 7,5 W · cm -2). Kontrolprøver (celler dyrket uden NPs og bestrålet med den samme laser power) viste ingen signifikant ændring i længden. Ved anvendelse af en strålingsdosis på 7,5 W · cm -2 den endelige neurit længde NG108-15 dyrket med Au NR'er var omtrent 36% højere (p <0,01) end de ikke-laser-bestrålede prøver. Denne adfærd er ikke specifikt knyttet til overfladen kemi på NRS. Disse værdier var næsten 20% større end neuritter udviklet af NG108 -15 alene og udsat for den samme værdi af laser eksponering (p <0,05) 12. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere publicerede undersøgelser af PC12 neuronale celler dyrket med piezoelektriske nanorør og bestråles med ultralyd stråling 7.

    Kontrolforsøg uden Au NR'er også viste nogle stimulerende virkninger af 780 nm lys i procent af neuroner med neuritter og antal neurites pr neuron. Denne stimulering var mere effektivt ved lavere laser beføjelser (1,25 W ∙ cm -2) med et efterfølgende fald på højeste laser energi (7,5 W ∙ cm -2) 12. En moderat stimulering forårsaget af NPS uden laserbestråling (poly (styrensulfonat) -behandlet og silica-overtrukket kun) blev påvist i procentdelen af neuroner med neuritter 12. Disse resultater er i overensstemmelse med nyligt offentliggjorte iagttagelser, at guld nanopartikler kan øge neuronal aktivitet in vitro 23,24. Figur 2 viser et eksempel på epifluorescens billeder af differentierede NG108-15 neuronale celler dyrket alene (figur 2A) eller med Au NR'er (figur 2B ) og bestrålet med forskellige laser kræfter (angivet på figuren).

    Potentialet for foto-genererede intracellulær Ca2 + frigivelse blev vurderet ved anvendelse af pulserende NIR lys i overensstemmelse med protokol 1, 2, og4. Calciumioner spiller en vigtig rolle i forskellige cellulære aktiviteter, såsom mitose, muskelsammentrækning og neuritforlængelse 25,26. Som svar på en stimulus, Ca 2 + stiger, svinger og falder, hvilket fører til aktiveringen, modulation eller ophør af en bestemt celle funktion. For nylig har Ca2 + transienter også blevet observeret som en konsekvens af IR laser eksponering i cardiomyocytter. I dette arbejde, Ca2 + reaktioner fremkaldt efter IR eksponering udviste lavere amplituder og hurtigere helbredelse gange end de spontane Ca 2 + transienter 2. Figur 3 viser et eksempel på NG108-15 nerveceller fyldt med Fluo-4 AM og afbildet med en konfokalt mikroskop. Fluo-4:00 blev observeret at komme cellemembranen i en ikke-forstyrrende måde, hvilket resulterer i en generelt ensartet fordeling af indikatoren over cellens cytoplasma. Kun mindre nukleare eller cytoplasmatisk organel farvning blev opdaget. Som tidligere anført, NR'er forventedes at være placeret intracellulært 12. NG108-15 neuronale celler alene, kulturperler med Au NR'er og poly (styrensulfonat) -behandlet-Au NR'er blev derefter udsat for laser bølgelængder mellem 0,07 J ∙ cm -2 og 370 J ∙ cm -2, med laser frekvens moduleret i området på 0,5-2 Hz.

    Figur 4 viser repræsentative eksempler på, hvordan amplituden af reaktionerne blev kortlagt som en funktion af tiden. Amplituden af Ca2 + respons varierede med strålingseksponering (figur 4A - C) og blev observeret ikke at være konsekvent udløst af laserpulser (figur 4C) 13. De mest sandsynlige forklaringer var forbigående udtømning af intracellulær Ca2 + butikker tilskrives ufuldstændig Ca 2+ loading 2 eller forskellige effektivitet NR internalisering i neuronale celler. Når NR'er ikke blev anvendt i culture (kontrolforsøg, figur 4D), blev en stimulerende virkning af 780 nm lys også observeret. Men denne producerede lavere fluorescens amplitude toppe og lavere sandsynlighed for aktivering (detekteret i kun 16% af de analyserede prøver). Samlet set blev der en sandsynlighed på 48% af NR laserinduceret celleaktivering nået, og på trods af de baggrundsbegivenheder følge af 780 nm lys, eksponering af NR-behandlede celler demonstrerede højere stimulation effektivitet med lavere laser energi og højere toppe af svar 13. Faktisk blev calciumreaktionen sig at toppe på 0,33 J ∙ cm -2 i NR-behandlede celler. Dette blev tilskrevet termisk hæmning 13. Under forsøgene blev detekteret nogen tegn på blæredannelse eller enhver anden form for cellemembranen forstyrrelser, hvilket er konsistent med resultaterne af Huang et al., Som rapporteret cellulær fotodestruktion med en relativ høj effekttæthed på 19 W ∙ cm -2 ansøgte 4 min 27.. Ingen spontane aktivitet i NR-behandlede celler blev optaget uden laser eksponering.

    Figur 1
    Figur 1: Optisk fiber forsøgsopstilling (A) og gennemsnitlige laser bølgelængder som en funktion af lasereffekten for en laserstråle areal er lig med 0,4 mm 2 (B). Beam parametre er (A): den halve vinkel af den maksimale lyskeglen forlader fiberen (θ), strålen radius (R) og afstanden mellem den optiske fiber og prøven (d).

    Figur 2
    Figur 2: Eksempler på epifluorescens billeder af differentierede NG108-15 neuronceller dyrket alene (A) eller med Au NR'er (B) og bestrålet med forskellige laser kræfter (angivet på figuren). Prøver blev jegncubated for én dag før laserbestråling. Celler blev fikseret og mærket for anti-β-tubulin III (rød) og DAPI (blå) tre dage efter laserbestråling. Scale barer er 100 um.

    Figur 3
    Figur 3: Eksempel på differentierede NG108-15 neuronale celler fyldt med Fluo4-AM Ca 2+ indikator Billedet blev taget med et omvendt konfokal mikroskop med en 40X olieimmersionsobjektiv..

    Figur 4
    Figur 4: Repræsentative eksempler på laser-induceret Ca2 + variationer som en funktion af tid i NG108-15 neuronale celler dyrket i serum-fri betingelser i tre dage med (a) poly (styrensulfonat) -Au NR'er, (B, C) Au NR'er og (D) uden NR'er (kontrolprøve). Disse resultater varopnået med laserimpulser på 100 msek (A, C, D) og 50 msek (B). De frekvenser, der anvendes til forsøgene (stiplede vertikale linjer) var 1 Hz (A - C) og 0,5 Hz (D). De beregnede radiant eksponering var 69,4 J ∙ cm -2 (A), 34,7 J ∙ cm -2 (B), 0,37 J ∙ cm -2 (C) og 138,87 J ∙ cm -2 (D). F max / F 0 angiver den maksimale fluorescens stigning påvist i NG108 -15 nerveceller, fra kalibrering med ionomycin (gengivet med tilladelse 13).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De protokoller, der er skitseret i denne præsentation beskriver hvordan kultur, differentiere og optisk stimulere nerveceller ved hjælp ydre absorbere. NR egenskaber (f.eks dimensioner, form, plasmonresonans bølgelængde og overfladekemi) og laser stimuleringsparametre (såsom bølgelængde, pulslængde, impulsfrekvens, etc.) kan varieres for at matche forskellige eksperimentelle behov. Virkningerne på celle adfærd kan overvåges ved anvendelse af standard biologiske assays og materialer. Samlet tilgang giver en enkel, men kraftfuld, måde at bestråle cellepopulationer in vitro og kan udvides til primærelementer, vævsprøver og in vivo studier.

    De vigtigste krav, Au NR'er brug skal opfylde for at blive anvendt til biologiske anvendelser er stabilitet (både kemisk og fysisk) og biokompatibilitet. Sidstnævnte er særligt kritisk, på grund af tilstedeværelsen af ​​et kationisk overfladeaktivt middel (fællesly CTAB) på overfladen af ​​Au. CTAB vides at inducere cytotoksicitet både in vitro 28 og in vivo 29 og det er almindeligt anvendt under syntesen processen at drive dannelse NR-form 30. Stabilitet og biokompatibilitet ofte forbedres ved at deponere yderligere belægninger på Au NR overflade (f.eks polyethylenglycol, silica) 31. For at vurdere biokompatibilitet kan forskellige assays anvendes in vitro (fx levende / døde, MTS, MTT, etc.), mens histologisk analyse ofte udføres under væv eksperimenter 7,8,12,15.

    En anden udfordring til ansigt, når du arbejder med nanomaterialer er vanskeligheden ved korrekt bestemme deres molære koncentration. Det enorme udvalg af nationale parlamenter med hensyn til form, størrelse og kemiske egenskaber gør de teknikker øjeblikket er til rådighed egnet til kun visse klasser af partikler. For eksempel standard dynamisk lys scattering metode forudsætter, at nationale parlamenter har en sfærisk form og spreder lys isotropisk 17. Derfor anvendelse af denne metode til Au NRS resultater i uoverensstemmelser mellem den målte koncentration og den eneste ene. Spørgsmålet om NP koncentration er særligt problematisk, hvis relateret til nanomedicin område, hvor koncentrationen administreres skal styres præcist for at maksimere effektiviteten af processen (f.eks for drug delivery applikationer) og minimere giftigheden af nanomaterialer 17. I undersøgelserne rapporteret her, den optiske densitet anvendt gav gode resultater med hensyn til cellelevedygtighed og partikelantal.

    På grund af deres iboende absorptionsegenskaber er Au NP'er ofte anvendes i kombination med en laserkilde. Under eksponeringen, absorption og spredning er de to vigtigste processer, der kan opstå på overfladen af ​​NPS. Hvis laserbølgelængden matcher plasmonresonans bølgelængde, absorption ofteforrang frem spredning, spændende ledning elektroner på NP overflade. Disse udgør en elektron gas, der bevæger sig væk fra sin ligevægtsstilling og skaber en resonant sammenhængende oscillation kaldes lokaliseret overfladeplasmonresonans (LSPR). Energien overføres derefter til NP krystalgitter som varme, som derefter spredes hurtigt i det omgivende miljø 32. Da varmen er den vigtigste virkning observeret efter excitation af NR LSPR, er det tilrådeligt at overvåge cellelevedygtighed efter laser eksponering.

    Det er blevet antaget, at de observerede effekter på neuritudvækst og intracellulær Ca2 + pathway skyldtes forbigående opvarmning skyldes excitation af LSPR. Denne hypotese er i overensstemmelse med aktiveringen af temperaturfølsomme TRPV1 kanal efter magnetisk eksponering af ferrit NP'er 5. Denne proces er også i overensstemmelse med observationer, varmefølsomme TRPV4 kanaler PLAy en vigtig rolle i infrarød nervestimulation 33. På molekylært niveau er det for nylig blevet vist, at TRPV4 er varmefølsomt efter interaktionen af phosphoinositid -4,5 -biphosphate (PIP 2) med kanalen 34. Derfor er det muligt, at forbigående opvarmning opstår efter NR excitation kunne tjene til at accelerere og / eller inducere åbningen af ​​TRPV4 kanaler. Denne hypotese kan bekræftes ved fremtidige Ca 2 + eksperimenter ved hjælp af Ca2 + - medium og / eller molekylære kontrol over PIP 2 udtynding.

    Forskellige grupper har også vist, at små temperaturgradienter over fysiologiske temperaturområde kan anvendes til at inducere andre reaktioner, såsom neuronal vækst kegle vejledende 25 eller depolariserende strømme i humane embryonale nyreceller 35. Yong og medarbejdere registreret en betydelig stigning i elektrisk signal aktivitet i primær auditive neuroner kultmåles med siliciumdioxidovertrukket Au NR'er efter laser bestråling på NRS på LSPR. Den produceres af laser-bestrålede partikler opvarmning blev målt ved anvendelse af patch-clamp-teknikker 14. Mere for nylig, Eom et al. Konstateret en stigning i amplituden af CNAPs efter laser eksponering på 3,4 × 10 9 Au NR'er når den kontinuerligt perfunderet i nærheden af kappen af nerven bundt af en rotte iskiasnerven 15.

    Den stimulerende virkning af de 780 nm laserdiode observeret under forsøgene var ikke forbundet med varme genereret af vandabsorption, da dette er kendt for at være ubetydelig ved 780 nm 36. Tidligere offentliggjorte resultater har også rapporteret stimulerende virkninger af 780 nm lys på neuronal væv in vivo 37,38. In vitro studier har vist, at inddragelsen af reaktive ilt arter i processen 39. Men de detaljerede mekanismer, som NIR stimulation påvirker gen transcription og andre cellulære aktiviteter er for tiden uløste. Nuværende data tyder samspillet mellem forskellige effekter i stimulering, herunder foton absorption inden kromoforer i mitokondrierne (næsten 50% af energien ved 780 nm kan blive absorberet af cytochrom c oxidase) 37,39-41, ændringer i membranpermeabilitet calcium 37 og inhibering af inflammatorisk aktivitet i cellerne 37.

    Resultaterne præsenteres i dette manuskript viser, at nanopartikler absorbere lover godt for fremtidige anvendelser i optisk stimulering af nerveceller. Den største fordel ligger i evnen NIR lys at trænge dybt ind i væv (terapeutisk vindue). Disse resultater viser også, at nanopartikler absorbere kan forbedre og / eller erstatte processen af ​​infrarød neural stimulation baseret på vand absorption. Ved fremtidige applikationer i neurale proteser, ville det være interessant at undersøge forskellige overflade functionalizationer med kemisk affinitet for neuronal axoner, som er de vigtigste mål for mange optiske stimulering applikationer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Forfatterne vil gerne anerkende NanoVentures Australien til rejser finansiering support og Prof. John Haycock for at have delvist vært denne forskning ved University of Sheffield og Ms. Jaimee Mayne for hendes hjælp under optagelserne.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Au NR Sigma Aldrich 716812
    NG108-15 Sigma Aldrich 8811230
    DMEM Sigma Aldrich D6546
    FCS Life Technologies 10100147
    L-glutamine Sigma Aldrich G7513
    Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140122
    Amphotericin B Life Technologies 15290018
    Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
    Triton X-100 BDH T8532
    BSA Sigma Aldrich A2058
    Anti-βIII-tubulin Promega G7121
    TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody Sigma Aldrich T5393
    DAPI Invitrogen D1306
    Fluo-4 AM Invitrogen F14201
    DMSO Sigma Aldrich 472301
    Pluronic F-127 Invitrogen P6867
    UV-Vis spectrometer Varian Medical Systems Inc. Cary 50 Bio
    Mini centrifuge Eppendorf Mini Spin
    Sonic bath Unisonics Australia FPX 10D
    Cell culture incubator Kendro Hera Cell 150
    Cell culture centrifuge Hettich Rotofix 32A
    Laser diode Optotech 780 nm single mode fibre - coupled LD
    Optical fiber Thorlabs 780 HP
    Power meter Coherent Laser Check
    ImageJ http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
    Epifluorescent microscope Axon Instruments ImageX-press 5000A
    μ-slide well Ibidi 80826
    Inverted confocal microscope Carl Zeiss Microscopy Ltd. LSM 510 meta-confocal microscope
    Oscilloscope Tektronix TDS210

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).
    2. Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).
    3. Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).
    4. Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004 (2013).
    5. Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles. Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).
    6. Farah, N., et al. Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation. J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).
    7. Ciofani, G., et al. Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation. ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).
    8. Kim, J. A., et al. Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).
    9. Myroshnychenko, V., et al. Modelling the optical response of gold nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).
    10. Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods. Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).
    11. Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging. Nanotechnology. 21 (5), 055704 (2010).
    12. Paviolo, C., et al. Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth. Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).
    13. Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients. J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).
    14. Yong, J., et al. Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons. Adv. Healthcare Mater. , (2014).
    15. Eom, K., et al. Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods. Small. , (2014).
    16. Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L. M., Mulvaney, P. Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications. Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).
    17. Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration. Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).
    18. Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. Shape separation of gold nanorods using centrifugation. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).
    19. Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function. Glia. 59 (5), 734-749 (2011).
    20. Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation. JoVE. (77), (2013).
    21. Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra. J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).
    22. Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
    23. Jung, S., et al. Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain. PLoS ONE. 9 (3), e91360 (2014).
    24. Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity. J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31 (2014).
    25. Ebbesen, C. L., Bruus, H. Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance. J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).
    26. Iwanaga, S., et al. Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells. Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).
    27. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles. Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).
    28. Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
    29. Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat. Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).
    30. Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L., Mulvaney, P. Gold nanorods: synthesis, characterization and applications. Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).
    31. Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).
    32. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).
    33. Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).
    34. Garcia-Elias, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).
    35. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), (2012).
    36. Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A., Müller, G. Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm. J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).
    37. Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).
    38. Wu, X., et al. 810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord. Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).
    39. Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. 780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species. Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).
    40. Wong-Riley, M. T. T., et al. Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase. J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).
    41. Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach. Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).

    Tags

    Neuroscience guld nanorods ekstern absorber neural stimulation laser excitation optisk stimulation neuronale celler,
    Guld nanorod-assisteret Optisk Stimulation af neuronal Cells
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Paviolo, C., McArthur, S. L.,… More

    Paviolo, C., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (98), e52566, doi:10.3791/52566 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter