Introduction
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, su (dalga boyu> 1400 nm) kızılötesi ışık emme ile bağlantılı geçici ısıtma sinir dokusu 1 kardiyomiyositlerde 2 hücre içi kalsiyum geçişlerdeki aksiyon potansiyelleri uyarılması için kullanılabileceğini göstermişlerdir. kızılötesi ışığın kullanımı nedeniyle potansiyel alansal çözünürlük, nöral protez uygulamaları için büyük ilgisini çekmiştir, genetik doğrudan doku ile temas, uyarım eserler minimize, ve ihtiyaç çıkarılması eksikliği (uyarılması öncesi hücreleri değiştirmek ) Optogenetik gerekli olduğu şekilde 1. Tüm bu avantajlar rağmen, son zamanlarda geliştirilen termal modeller hedef doku / hücre birden fazla uyaran siteleri ve / veya yüksek tekrarlama oranları 3,4 kullanılan kümülatif ısıtma etkileri, etkilenebilir önerdi.
Bu sorunlara cevap olarak, araştırmacılar dışsal Akustik kullanma potansiyeli tanıdısinir uyarımı için mektir dokuda daha lokalize ısıtma etkiler üretmek için. Huang ve ark., Uzaktan bir radyo frekansı manyetik alanı 5, HEK 293 hücrelerinde sıcaklığa duyarlı TRPV1 kanalları etkinleştirmek için süperparamanyetik ferrit nanopartiküller kullanarak bu prensip gösterdi. Bu teknik, (manyetik alan doku ile nispeten zayıf etkileşim) daha derin bir penetrasyon için izin vermesine rağmen, tepkiler sadece oldukça biyonik cihazlar 5 ihtiyaç milisaniye süreleri daha saniye süre boyunca kaydedildi. In vitro siyah mikro-parçacıklar ile sıçan kortikal nöronların Benzer şekilde, Farah ark. Gösterdi elektriksel stimülasyon. Onlar potansiyel hızlı tekrarlama oranları 6 için izin μJ aralığında us ve enerjilerin yüzlerce sipariş üzerine darbe süreleri kullanılarak uyarılması hücre düzeyinde hassasiyet gösterdi.
dış emicilerin kullanılması da uyarılması için tatbik edilmiştirin vitro morfolojik değişimler. Ciofani ark. Ultrason 7 heyecan piezoelektrik bor nitrür nanotüpler kullanılarak nöronal hücre akıbet bir ~% 40 artış gösterdi. Benzer şekilde, PC12 hücrelerinde endocytosed demir oksit nanopartiküller nedeniyle demir oksit 8 hücre yapışma moleküllerinin aktivasyonuna, doza bağımlı bir şekilde nörit farklılaşmasını arttırmak için rapor edilmiştir.
Son zamanlarda, sinir uyarımı yardımcı olmak için dışsal emiciler ilgi de altın nanopartiküllerin kullanımı (Au NPS) odaklanmıştır. Au NPler etkili bir plasmonik tepe lazer ışığı absorbe ettiği ve ısı 9 şeklinde çevreleyen ortam içine dağıtmak yeteneğine sahiptir. 10 - partikül şekilleri tüm arasında, altın nanoçubuklar optik soğurma (Au NR'ler) elverişli (NUR, 750-1,400 nm arasında dalga boyu yakın kızılötesi) Biyolojik dokuların terapötik pencere eşleşir. Ayrıca, cont içindesinir stimülasyon ext, Au NR'lerin kullanımı nispeten olumlu biyouyumluluk ve yüzey fonksiyonlandırmalar seçenekleri 11 geniş bir yelpazede sunmaktadır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar farklılaşması üzerinde bir uyarıcı etkisi NG108-15 nöronal hücrelerin 12 Au NR'lerin sürekli lazer maruz sonra indüklenebilir göstermiştir. Benzer şekilde, hücre içi kalsiyum geçici değişken frekansı ve darbe ile modüle edilmiş lazer ışını 13 uzunlukları sonra Au NR'lerin ile kültürlenmiştir nöronal hücrelerde kaydedildi. Hücre membran depolarizasyon aynı zamanda, spiral gangliyon nöronları 14 primer kültürlerinde Au NR'lerin NIR lazer aydınlatma sonra kaydedildi. ışınlanmış Au NR'lerin ile in vivo uygulamada ilk sadece son zamanlarda kanıtlanmıştır. Eom ve arkadaşları onların plasmonik zirvesinde Au NRS maruz kalan ve bileşik sinir aksiyon potansiyellerinin (CNaPS) genliği bir altı kat artış ve sıçan siyatik sinir stimülasyon eşiği üç kat azalma kaydedildi. trzenginleştirilebilir yanıtı NR plasmonik tepe 15 uyarılması kaynaklanan lokal ısıtma etkilerine bağlandı.
Bu yazıda, Au NR'lerin ile kültüre NG108-15 nöronal hücrelerin lazer stimülasyon etkilerini araştırmak için protokoller belirtilir. Bu yöntemler, standart biyolojik teknikler ve malzemeler kullanılarak in vitro hücre popülasyonlarının saçmak için basit, ama güçlü, bir yol sağlar. Protokol güvenli bir şekilde çalışmasını ve tekrarlanabilir dengelenmesini sağlayan fiber lazer diyot (LD) dayanmaktadır. Au NR örnek hazırlama ve lazer ışınlama yöntemi daha spesifik sentez ve kültür protokolleri sırasıyla bilinen şartıyla, farklı parçacık şekil ve nöronal hücre kültürlerine uzatılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Au NR'ler Hazırlık
Not: Au NR'ler tarifleri 16 bir dizi ile sentezlenebilir, ya ticari satıcılardan satın alınabilir.
- UV-Vis spektroskopisi yoluyla, 0.5-2 nm çözünürlüğe sahip 300 nm 1.000 ila emilim değerleri kaydederek Au NR çözeltisinin ilk optik yoğunluk (OD) ölçün. Çözeltinin hacmi mevcut küvet ile kullanılmak üzere değişir.
- Uygun bir teknik 17 ile ilk NP molar konsantrasyonu (örneğin UV-Vis spektroskopisi, tek parçacık indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometresi, transmisyon elektron mikroskobu) değerlendirmek veya satıcı tarafından sağlanan konsantrasyon değerleri kullanın.
- En iyi tekrarlanabilirlik için, 1. = OD ulaşmak test edilen örneklerin tüm OD sabit tutmak için ilk Au NR örnek seyreltilmesi ile 5 ml stok çözelti hazırlayın. Seyreltme çözücü bileşimi için ticari satıcının protokolünü izleyin. Emin değilsenizDeiyonize su kullanın.
- Iki kez 15 dakika süreyle, Au NR solüsyonun 1 ml'lik 7,800 x g'de santrifüjleyin çözeltiden herhangi bir kimyasal fazlasının ayrılması için. Santrifüj çevrimi kuvvet ve zaman (örneğin 20 dk 5.600 × g) 18 değişebilir.
- Süpernatantlar çıkarın ve deiyonize su içinde NRs yeniden askıya. Yeniden partikülleri çözelti içinde agrega oluşturacak edebileceğiniz gibi, en iyi sonuçlara sahip günlük onları hazırlamak. Alternatif olarak, 1 hafta daha uzun süre buzdolabında saklayın. Donma yok.
- Hücre kültürü koşulları altında kullanmadan önce, 5 dakika boyunca, Au NR çözeltisi sonikasyon ve sonra, (mW m ∙ en az 400 daha -2 254 nm'de UV radyasyon şiddeti), 30 dakika boyunca UV ışığı ile sterilize edilir.
2. NG108-15 Nöronal Hücre Hattı Kültür ve Farklılaşma
- Hücre kültür ortamı için, steril Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) cenin dana serumu (w / v) (FCS) ihtiva eden% 10,% 1 (ağırlık / hacim), L-glutamin,% 1, 500 ml hazırlamak(Ağırlık / hacim) penisilin / streptomisin ve% 0.5 (ağırlık / hacim) amfoterisin B
Not: Takviyeler, -20 ° C'de saklandı, bölünmüş ve gereken gün ortama ilave edilebilir. Hücre kültür ortamı, 1 aylık bir süre için steril bir durumda frigorifik edilebilir. - Hücre farklılaşması ortamı için% 1 ihtiva eden steril DMEM 50 ml hazırlamak L-glutamin,% 1 (ağ / h), penisilin / streptomisin ve% 0.5 (ağırlık / hacim) amfoterisin B (a / h)
- (37 ° C'de% 5 CO2), nemli bir atmosfere sahip bir kuluçka makinesi içinde polistiren T75 şişeleri içinde hücre kültür ortamı, 10 ml NG108-15 nöronal hücreler büyür. Normalde, 3-4 gün içinde hazır olmak için her şişede 1.5-2 × 10 5 hücre tohum. Her iki günde hücre kültürü ortamı değiştirin.
Not: deneyler için geçit 21 daha eski hücreleri kullanmayın, genetik sürüklenir veya varyasyonunu önlemek için. - Zaman% 70-80 konfluent kültüründe, sıcak taze hücre kültür ortamı ile orta değiştirmek. Mekanik hafifçe Knoc hücreleri ayırmakKral birleşen Şişenin alt. Tripsin kullanmayın.
- Santrifüj 600 x g'de ve 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu yeniden askıya sıcak hücre farklılaştırma ortamının 2 ml hücre pelletini.
- Hücre farklılaştırma ortamının 200 ul doku kültürü polistiren 96 oyuklu bir plaka içerisinde tohum 2 x 10 4 hücre / cm2. % 5 CO 2/37 ° C'de 1 gün boyunca deney inkübe edin.
- 2 gün Au NR çözeltisi 10 0 1 x -4,2 9 10 x 3.2 arasında parçacık / ml ilave edilir ve ek 24 saat için inkübe edilir. Kontrol deneyleri için parçacıkları katmayın.
Not: Alternatif bir kontrol olarak, bir iyi farklılaşmış zirve absorpsiyon dalga boyuna sahip Au NPler, karşılaştırma amacıyla 14 için kullanılabilir. Bir daha tutarlı hücre davranışı için, sabit hücre yoğunluğu tutmak ve hücre ekimi öncesinde kuyu yüzeyi değişiklik yok.
3. akson akıbet Geliştirme
- ÇiftBir tek modlu fiber optik lazer (sayısal açıklık = 0.13) ve (YP konnektörleri uygun ve yaygın mevcuttur) fiber konnektörü ile sona erdirebilir. Standart bir elektrik metre ile çıkış lazer gücünü ölçün. En etkili sonuçlar elde etmek için, NR'lerin plazmon rezonans zirvesine lazer dalga boyu tepe maç.
- Günde 3 Aşağıdaki NR kuluçka üzerinde, iyi FC konnektörünü düzeltmek. Farklı lazer güçler için, sürekli bir dalga 1 dakika için oda sıcaklığında örnekleri ve kontrol ışın tedavisi. Kültür% 5 CO 2/37 ° C'de 3 gün daha devam izin verin. 3 bağımsız ölçümün en az bir lazer ışınlama tekrarlayın.
Not: Farklı ışınlama süresi ve darbe frekansları, uygulamaya bağlı olarak, seçilebilmektedir. - Işın çapı ve lazer ışınım açısından lazer karakterize (W ∙ cm -2).
- Standart tek modlu fiber için, NA = n ∙ sin θ kullanınN Kullanılan ortamın kırılma endeksi ve θ elyaf çıkan ışık konisinin yarım açı olduğu (Şekil 1A bakınız). R ışın yarıçapı trigonometri, r = tan θ ∙ d ve d lif ve numune arasındaki mesafedir. FC bağlayıcı bu nedenle, bir d mesafesinde örnek = 2.70 ± 0.20 mm aydınlatıcı, iyi çapı ile eşleşir. Işık, r = tan (sin-1 (NA / n)) veren d ∙ (n = 1.33), su içinde lif çıkar.
- İkinci denklemi kullanarak, lazer ışını yarıçapı, ilgili ışın alanı ve hedef ortalama lazer ışınlama (ışın alanına bölünmesiyle lazer güç) hesaplamak (Şekil 1B örnek grafiğe bakınız). Bu değerler ışıklı alana ortalama parlama temsil eder.
- Hata yayılma genel teorisi ile ölçümler için hataları değerlendirin.
Not: mesafe between FC konektörü ve örnek uygun yazılım (örn ImageJ) kullanarak görüntünün deneysel düzenleme ve post-processing fotoğrafları ile ölçülebilir.
- 5. günde, deneylerden elde edilen hücre farklılaşması orta kaldırmak ve% 3.7 10 dakika süre ile (h / h) formaldehid çözeltisi ile örnekleri saptamak, daha sonra% 0.1 20 dakika boyunca (h / h) Triton X-100 ile hücrelerin geçirgen.
- (W / v), 60 dakika süre ile numuneler, büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) bağlayıcı siteleri girmemiş protein bloke etmek için% 3 ekleyin. 4 ° C'de anti-βIII-tübülin gece boyunca (PBS / ml 5 ug BSA% 1 ile takviye edilmiş) için numuneler etiketlenir.
- PBS içinde% 1 BSA içinde 0,4-2 mg / ml 'lik bir konsantrasyon ile (örneğin, TRITC-konjuge edilmiş anti-fare IgG antikoru) uygun bir ikincil antikor ile karanlıkta 90 dakika süreyle inkübe hücreleri. 10 dakika boyunca DAPI (0.1 ug / ml de-iyonize edilmiş su), hücre, çekirdeklerini etiketleyin.
Not: Antikor çekimi ve konsantrasyon MIGht şirket protokolüne göre değişir. Iki kez boyama safhasından sonra 5 dakika boyunca PBS ile yıkayın örnekler.
- En az bir 20 × objektif kullanarak Epifloresans veya konfokal mikroskobu ile görüntü örnekleri. Mikroskop sekonder antikor buna göre filtreleri seçin. Bir DAPI filtre seçin (λ EX = 358 nm; λ EM 488 nm =) hücre çekirdekleri görselleştirmek için.
- Değerlendirerek fotoğrafları analiz: i) maksimum nörit uzunluğu (kayıt hücre gövdesi başlangıcına akson ucundan uzunluğu), ii) nöronal hücre başına nöritlerin sayısı () hücre başına nöritlerin tüm Özetle iii) nöritleri olan hücrelerin yüzdesi (pozitif lekeli çekirdeğe sahip olan hücrelerin toplam sayısı) 19 ile βIII-tubulin sentezleyen hücrelerin toplam sayısına bölün.
4. Hücre içi Ca 2+ Görüntüleme Lazer kaynaklı
Not: BSS çözümü önceden hazırlanmış ve 1 aylık bir süre için buzdolabında olabilir. Deney gününde takviyesi (Fluo-4:00 ve Pluronic ™ F-127) ilave edin.
- Standart bir elektrik metre ile çıkış lazer gücünü ölçün. Bir fiber optik tutucu içine ışık teslimat lif yerleştirin ve bir micropositioner takınız. Brown ve ark bakın. 20 fiber optik hazırlama ve konumlandırma hakkında daha fazla bilgi için.
Dikkat: (örn lazer ışınına doğrudan bakmayın taşıma sırasında lazer güvenlik gözlük, diğer laboratuvar kullanıcılara kaçak ışık maruziyeti önlemek) lazer gücünün ölçümü sırasında lazer güvenliği için genel kurallara uyun <./ Li>
- Bir ters konfokal mikroskop altında hücrelerin yerleştirin ve uzak iletim aydınlatma modunda hedef hücrenin ışık teslimat fiber 250 ± 50 mikron yerleştirin. Bu mesafede, hedefe ışın yarıçapını hesaplamak için 3.3.1 sunulan denklemleri kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada tarif edilen Protokolleri 1, 2 ve 3 kullanılarak, farklılaşması üzerinde bir uyarıcı etkisi Au NP ile kültüre NG108-15 nöronal hücrelerde gözlenmiştir laser (Au NR'ler, poli (sitiren) Au NRS ve silis kaplı Au NR'ler -kaplı) 1.25 ve 7.5 W arasındaki poz · cm -2. RhodamineB etiketli Au NR'lerin Konfokal görüntüler partiküller inkübasyonun 12 1. gününden itibaren içsel olduğunu göstermiştir. lokalizasyonları alım tercih mekanizması hücre gövdesi membran 12 aracılığı ile olduğunu göstermektedir, hücre sitoplazması gözlendi. NG108-15 nöronal hücrelerde farklılaşma teşvik sonra tespit ana morfolojik değişiklikler çoğalması tutuklanması, βIII-tübülin proteinin ifadesi ve maksimum uzunluğu ve sayısı 22 bakımından analiz edilmiştir nöritlerin akıbet idi.
NR'lerin ile kültürlenen numuneleri lazer irradi bir nörit uzunluğu artışı gösterdiBurada ölçülen ance seviyeleri (1.25 ve 7.5 W arasında • cm-2). Kontrol numuneleri (NPlerin olmadan kültürlenen ve aynı lazer gücü ile ışınlanmış hücreleri) uzunluğunda önemli bir farklılık göstermemiştir. 7,5 W • cm -2 Au NR'lerin ile kültüre NG108-15 nihai nörit uzunluğunda bir ışınlama dozu kullanılarak olmayan lazer ışınlanmış örnekler göre yaklaşık% 36 daha yüksek (p <0.01). Bu davranış, özellikle NR'lerin yüzey kimyasına bağlı değildi. Bu değerler tek başına -15 NG108 tarafından geliştirilen ve lazer maruz (p <0.05) 12 aynı değere maruz nöritlere göre neredeyse% 20 daha fazlaydı. Bu sonuçlar ultrason radyasyon 7 ile piezoelektrik nanotüpler ile kültür ve ışınlanmış PC12 nöronal hücreleri üzerinde önceden yayınlanmış çalışmalarla uyumludur.
Au NR'lerin olmadan kontrol deneyi de KD nöritlerin ve sayısı olan nöronların yüzdesi cinsinden 780 nm ışık bir uyarıcı etkiler gösterdinöron başına urites. Bu uyarım alt lazer güçler (1.25 W ∙ cm -2) yüksek lazer enerjisi bir sonraki azalma ile (7,5 W ∙ cm -2) 12 daha etkili oldu. Herhangi bir lazer ışınlaması NP neden olduğu bir orta stimülasyonu (poli (sitiren) -kaplı ve silis kaplı için) nöritlerin 12 olan nöronların yüzdesi tespit edildi. Bu sonuçlar, altın nanopartikülleri vitro 23,24 nöronal aktiviteyi artırabilir son yayınlanan gözlemlerle uyum içindedir. Şekil 2, tek başına kültürlenen farklılaşmış NG108-15 nöronal hücreleri (Şekil 2A) Au NR'lerin birlikte epifloresans görüntülerin bir örnek (Şekil 2B ) ve resimde gösterilen farklı lazer güçleri () ile ışınlanmış.
foto-jenere hücre içi Ca2 + serbest bırakılması için potansiyel Protokolleri 1, 2 uygun olarak pulse NIR ışık kullanılarak tayin edildi ve4. Kalsiyum iyonları, örneğin mitoz, kas kasılması ve nörit uzantısı 25,26 gibi farklı hücresel aktiviteler, önemli bir rol oynamaktadır. Bir uyarıcıya cevaben, Ca 2 + artar, belirli bir hücre fonksiyonunun aktivasyonu, modülasyonu veya sona neden salınan azalır. Son zamanlarda, Ca 2 + geçici de kardiyomiyositlerde İR lazer maruz kalmanın bir sonucu olarak tespit edilmiştir. IR maruz düşük genlik ve spontan Ca 2+ geçici 2 daha hızlı iyileşme kez sergilendi bundan sonra çalışmada, Ca 2+ yanıtları uyarılmış. 3 ile Fluo-4:00 ile yüklenen ve görüntülü NG108-15 nöronal hücrelerin bir örnek göstermektedir konfokal mikroskop. Fluo-04:00 hücre sitoplazması boyunca göstergesi genellikle üniform bir dağılımı ile sonuçlanan, yıkıcı olmayan bir şekilde, hücre zarını girmek için gözlenmiştir. Sadece küçük bir nükleer ve sitoplazmik organelin renklenmesi tespit edilmedi. Daha önce belirtildiği gibi, NR'ler hücre 12 yer bekleniyordu. J cm ∙ 0.07 arasında NG108-15 tek başına nöronal hücreler, Au NR'lerin ve poli (stirensülfonat) ile kültürlenmiş -kaplı Au NR'ler lazer ışık şiddetlerinin bundan sonra maruz kalan -2 ve 370 J aralığında modüle lazer frekansı ile, cm -2 ∙ 0.5-2 Hz'lik.
Şekil 4, tepkilerinin büyüklüğü, zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiştir kadar temsili örneklerini göstermektedir. Işın yayma (Şekil 4A - C) değişik Ca2 + cevabının büyüklüğü olup gözlenmiştir sürekli lazer darbeleri (Şekil 4C) 13 tarafından tetiklenebilir. büyük olasılıkla açıklamalar eksik Ca 2 + yükleme 2 veya nöronal hücrelerde NR içselleştirme farklı verimlilik atfedilen hücre içi Ca 2 + mağaza geçici tükenmesi vardı. NR'ler Kültür kullanılmamıştır zamane (kontrol deneyleri, Şekil 4D), 780 nm ışık uyarıcı bir etki de gözlenmiştir. Bununla birlikte, bu daha düşük floresan amplitüd zirveleri ve (analiz edilen örneklerin sadece% 16 de tespit edilebilir) aktivasyon azalacaktır üretti. Genel olarak, NR lazer kaynaklı hücre aktivasyonunun% 48 olasılık elde edilmiştir nedeniyle 780 nm ışık arka plan etkinlikleri rağmen, NR ile muamele edilmiş hücrelerin maruz düşük lazer enerjisi ve tepki 13 daha yüksek tepe daha yüksek uyarım verimi gösterdi. Aslında, kalsiyum tepki 0.33 J ∙ cm -2 da NR ile muamele edilmiş hücrelerde bulunan en tepe bulunmuştur. Bu termal inhibisyonu 13 atfedilmiştir. Deneyler sırasında, kabarmasıyla veya hücre membran bozulması herhangi bir başka biçimdeki herhangi bir kanıt 19 B ∙ cm, nispeten yüksek bir enerji yoğunluğuna sahip hücresel photodestruction rapor Huang ve ark. Sonuçlarla uyumlu biçimde, tespit -2 4 uygulanan dk 27. ND ile muamele edilmiş hücrelerde hiçbir spontane aktivite lazer maruz kalmadan kaydedildi.
Şekil 1: alanın bir lazer ışını için, lazer gücünün bir fonksiyonu olarak optik lif deney düzeneği (A) ve ortalama lazer ışık şiddetlerinin 0,4 mm 2 (B) 'ye eşittir. Kiriş parametrelerinin, (A): fiber (θ), ışın çapı (r) ve optik fiber ve örneğin (d) arasındaki mesafeyi çıkan ışığın maksimum koni yarı açısı.
Şekil 2: (a) tek kültürlenmiştir farklılaşmış NG108-15 nöronal hücrelerin Au NR'lerin (B) epifloresans görüntü örnekleri ve (şekilde gösterilmiştir), farklı lazer güçleri ile ışınlanmıştır. Örnekler i vardılazer ışınları bir gün önce ncubated. Hücreler, sabit ve üç gün lazer ışınlama sonra anti-β-III tubulin (kırmızı) ve DAPI (mavi) için işaretlendi. Ölçek çubukları 100 um bulunmaktadır.
Şekil 3: Fluo4-AM Ca 2 + göstergesi yüklü farklılaşmış NG108-15 nöronal hücrelerin Örnek görüntüsü 40X yağ daldırma amacı ile bir ters konfokal mikroskop kullanılarak alınmıştır..
Şekil 4: Üç gün boyunca serumsuz şartlarda kültürü NG108-15 nöronal hücrelerde, zamanın bir fonksiyonu olarak, lazer kaynaklı Ca2 + varyasyonlar tipik örnekleri arasında, (A), poli (sitiren) -Au NRs, (B, C) Au NR'ler ve NR'ler (kontrol numunesi) olmadan (D). Bu sonuçlar edildi100 ms (A, C, D) ve 50 ms (B) lazer darbeleri ile elde edilmiştir. ve 0,5 Hz (D) - deneyde (kesik dikey çizgiler) için kullanılan frekansları 1 Hz (C A) idi. hesaplanan ışıma maruz cm-2 (A), 34.7 J ∙ J ∙ 69,4 idi cm-2 (B), 0.37 J ∙ cm-2 (C) ve 138,87 J ∙ cm-2 (D). F max / F 0 ionomisin ile kalibrasyon gelen NG108 -15 nöronal hücrelerde tespit maksimum floresan artışı, (izni 13 ile çoğaltılamaz) gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu sunumda belirtilen protokoller kültüre, farklılaştırmak ve optik dışsal emici kullanarak nöronal hücreleri uyarmak nasıl açıklar. NR özellikleri (örneğin boyutlar, şekil, plazmon rezonans dalga boyu ve yüzey kimyası) ve (vb dalga boyu, darbe uzunluğu, tekrarlama oranı, gibi) lazer stimülasyon parametreleri farklı deneysel ihtiyaçlarına uygun değiştirilebilir. Hücre davranışı üzerindeki etkisi standart biyolojik tahliller ve malzemeler kullanılarak izlenebilir. Genel yaklaşım, in vitro hücre popülasyonlarının saçmak için basit, ama güçlü, yol sağlar ve birincil hücreler, doku örnekleri ve in vivo çalışmalarda uzatılabilir.
Au NR'ler biyolojik uygulamalarda kullanılmak üzere karşılamak için gereken temel şartlar stabilite (kimyasal ve fiziksel her ikisi) ve biyolojik uyumluluk bulunmaktadır. İkincisi (nedeniyle, bir katyonik yüzey aktif madde varlığına bağlı olarak, ortak özellikle kritiktirAu yüzeyinde ly CTAB). CTAB, in vitro 28 in vivo ve in 29 hem de, sitotoksisiteye yol bilinmektedir ve genel olarak da NR-şekilli oluşumu 30 sürmek için sentez işlemi sırasında kullanılır. Stabilite ve biyolojik uyumluluk genellikle Au NR yüzeyinde ek bir kaplama (örneğin, polietilen glikol, silika) 31 biriktirilmesi ile geliştirilir. Histolojik analiz genellikle doku deneyleri 7,8,12,15 sırasında gerçekleştirilir ise biyo-uyumluluk değerlendirmek için, farklı deneyler, in vitro (örneğin, ölü / canlı MTS, MTT, vs.) kullanılabilir.
Nanomateryaller ile çalışan doğru molar konsantrasyonunun saptanması zorluk olduğunda diğer zorluk yüz. şekil, boyut, ve kimyasal özellikleri açısından NPlerin çok çeşitli parçacıkların sadece belirli sınıfları için uygun teknikler, mevcut hale getirir. Örneğin, standart dinamik ışık Scattyöntemi ering NPler küresel bir şekil ve dağılım ışık izotropik 17 olduğunu varsayar. Bu nedenle, ölçülen konsantrasyon ve gerçek arasındaki farklılıklara Au NR'ler sonuçları bu yöntemin uygulanması. uygulanan konsantrasyonu tam olarak (ilaç verme uygulamaları için, örneğin) işlemin etkinliğini en üst düzeye çıkarmak ve nanomateryallerin 17 toksisitesini en aza indirmek amacıyla, kontrol edilmesi gereken nanotıp alanı ile ilişkili ise NP konsantrasyonunun konu, özellikle sorunludur. Burada rapor edilen çalışmalarda kullanılan optik yoğunluk, hücre canlılığı ve parçacık sayısı açısından iyi sonuçlar elde edilmiştir.
Dolayı iç emme özelliklerine Au NPler genellikle bir lazer kaynağı ile bir arada kullanılmaktadır. Maruz kalma sırasında, emme ve dağıtma NP yüzeyinde meydana gelebilecek iki işlemlerdir. Genellikle lazer dalga boyu plazmon rezonans dalga boyu eşleşirse, emilimNP yüzeyde heyecan verici iletim elektronları, saçılma üzerinde hakim. Bunlar denge pozisyonundan uzaklaştığı ve bir rezonans tutarlı salınım lokalize yüzey plazmon rezonans (LSPR) adlı yaratan bir elektron gazı oluştururlar. enerji, daha sonra çevredeki 32 içine hızlı bir şekilde dağılmış bir ısı NP kristal kafesinde, aktarılır. Isı NR LSPR uyarılmasının ardından görülen başlıca etkisi olduğu için, bu lazer maruz kaldıktan sonra, hücre yaşamı sürdürme kabiliyetini izlemek için tavsiye edilir.
Bu neurit ve hücre içi Ca 2+ yolunda gözlenen etkileri LSPR uyarılması kaynaklanan geçici ısıtma nedeniyle olduğu öne sürülmüştür. Bu hipotez, ferrit NP 5 manyetik maruz kaldıktan sonra, ısıya duyarlı TRPV1 kanalı aktivasyonu ile uyumludur. Bu süreç aynı zamanda gözlem termal duyarlı TRPV4 kanalları pla ile tutarlıdıry kızılötesi sinir stimülasyonu 33 önemli bir rol. Moleküler düzeyde, son zamanlarda TRPV4 sadece kanal 34 ile fosfoinositid -4,5 -biphosphate etkileşimi (PIP 2) sonra ısıya duyarlı olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, bu da NR uyarma sonrasında ortaya çıkan geçici ısıtma hızlandırmak için hizmet ve / veya TRPV4 kanallarının açılmasına neden olması mümkündür. Bu hipotez Ca 2+ kullanarak gelecekteki Ca 2 + deneylerle teyit edilebilir - PIP 2 tükenmesi üzerinden ücretsiz orta ve / veya moleküler kontroller.
Farklı gruplar aynı zamanda fizyolojik sıcaklık aralığında küçük sıcaklık gradyanları gibi nöronal büyüme konisi 25 kılavuz veya insan embriyonik böbrek hücrelerinden 35 akımlar depolarize edici gibi diğer bir yanıt, uyarılması için kullanılabileceğini göstermişlerdir. Yong ve arkadaşları primer işitsel nöronlar kült elektrik sinyali aktivitesinde önemli bir artış kaydedildiLSPR de NR'lerin lazer ışınlama sonrası silika kaplı Au NR'lerin ile edili-. lazer ışınlanmış parçacıklar tarafından üretilen ısı patch-clamp tekniği 14 kullanılarak ölçülmüştür. Sürekli bir şekilde fare siyatik sinirinin 15 sinir demetinin kılıfın çevresinde perfüze Daha yakın zamanda, Eom ve ark. 3.4 x 10 9 Au NR'lerin lazer maruz kaldıktan sonra CNaPS amplitüdünde bir artış göstermiştir.
Bu 780 mil 36 ihmal edilebilir olduğu bilindiği gibi, deney sırasında gözlenen 780 nm lazer diyot uyarıcı etkisi, su emme tarafından oluşturulan ısı ile bağlantılı değildi. Daha önce yayınlanan sonuçlar, in vivo 37,38 nöronal doku üzerinde 780 nm ışık uyarıcı etkileri olduğu bildirilmiştir. In vitro çalışmalar, süreç 39, reaktif oksijen türlerinin rolünü göstermiştir. Ancak, detaylı mekanizmaları tarafından NUR stimülasyon gen transcriptio etkilern ve diğer hücresel faaliyetleri halen çözülmemiş bulunmaktadır. Mevcut veriler mitokondri içinde kromoforlara içinde foton emilimi de dahil olmak üzere uyarılması farklı etkileri, etkileşimi göstermektedir, 37,39-41 (780 nm enerjinin neredeyse 50% sitokrom-c oksidaz tarafından absorbe olabilir) kalsiyum membran geçirgenliğinde değişiklikler hücreler 37 inflamatuar aktivite 37 inhibisyon.
Bu yazıda sunulan sonuçlar nanoparçacık emiciler nöronal hücrelerin optik uyarılması gelecekteki uygulamalar için büyük ümit olduğunu göstermektedir. Ana avantajı dokulara (terapötik pencere) derin nüfuz NIR ışık yeteneği yatıyor. Bu sonuçlar ayrıca, nano partiküler emici arttırmak ve / veya su emme göre kızılötesi sinir stimülasyonu işlemi yerine göstermektedir. Nöral protez gelecek uygulamalar için, farklı yüzey functionalizat araştırmak için ilgi olacaktırBirçok optik stimülasyon uygulamaları için temel hedefleridir nöronal aksonlar, kimyasal afinite ile iyonlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar kısmen çekimler sırasında ona yardım için Sheffield ve Bayan Jaimee Mayne Üniversitesi bu araştırmaları misafirini ağırlayan seyahat finansman desteği için NanoVentures Avustralya ve Prof. John Haycock kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-βIII-tubulin | Promega | G7121 | |
| TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| UV-Vis spectrometer | Varian Medical Systems Inc. | Cary 50 Bio | |
| Mini centrifuge | Eppendorf | Mini Spin | |
| Sonic bath | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Cell culture incubator | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Cell culture centrifuge | Hettich | Rotofix 32A | |
| Laser diode | Optotech | 780 nm single mode fibre - coupled LD | |
| Optical fiber | Thorlabs | 780 HP | |
| Power meter | Coherent | Laser Check | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Epifluorescent microscope | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide well | Ibidi | 80826 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy Ltd. | LSM 510 meta-confocal microscope | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS210 |
References
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004 (2013).
- Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles. Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).
- Farah, N., et al. Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation. J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).
- Ciofani, G., et al. Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation. ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).
- Kim, J. A., et al. Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).
- Myroshnychenko, V., et al. Modelling the optical response of gold nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).
- Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods. Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).
- Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging. Nanotechnology. 21 (5), 055704 (2010).
- Paviolo, C., et al. Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth. Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).
- Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients. J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).
- Yong, J., et al. Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons. Adv. Healthcare Mater. , (2014).
- Eom, K., et al. Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods. Small. , (2014).
- Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L. M., Mulvaney, P. Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications. Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).
- Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration. Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).
- Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. Shape separation of gold nanorods using centrifugation. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).
- Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function. Glia. 59 (5), 734-749 (2011).
- Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation. JoVE. (77), (2013).
- Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra. J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).
- Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
- Jung, S., et al. Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain. PLoS ONE. 9 (3), e91360 (2014).
- Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity. J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31 (2014).
- Ebbesen, C. L., Bruus, H. Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance. J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).
- Iwanaga, S., et al. Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells. Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).
- Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles. Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat. Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).
- Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L., Mulvaney, P. Gold nanorods: synthesis, characterization and applications. Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).
- Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).
- Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).
- Garcia-Elias, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), (2012).
- Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A., Müller, G. Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm. J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).
- Wu, X., et al. 810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord. Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).
- Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. 780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species. Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).
- Wong-Riley, M. T. T., et al. Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase. J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).
- Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach. Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).
