Introduction
Controllo del movimento è una funzione fondamentale del sistema nervoso centrale (CNS). Motricità è il principale uscita misurabile della funzione CNS e la principale possibilità per gli individui di interagire con il mondo esterno. Comprendere i principi di funzionamento del motore e dei meccanismi che sono alla base l'apprendimento di un compito motorio è attualmente una delle grandi sfide nel campo delle neuroscienze. Cambiamenti morfologici, fisiologici e molecolari sono stati trovati al momento dell'acquisto di un nuovo compito motorio. Ad esempio, la forma e il numero di sinapsi cambiano in risposta alla formazione qualificata motore 1-5, e cambiamenti funzionali della macchina sinaptica sono stati osservati dopo apprendimento motorio. Risposte sinaptiche erano più elevati nei collegamenti della regione forelimb rappresenta della corteccia motoria addestrato rispetto all'emisfero inesperto dello stesso animale o risposte da animali non allenati 6,7. Osservazioni elettrofisiologiche suggeriscono anche che il potenziamento a lungo termine (LTP) e lungadepressione-termine (LTD) come meccanismi si svolgono durante l'apprendimento di una nuova abilità motoria, e che il raggio d'azione sinaptica, che è definito tra i confini limitanti di LTP e LTD saturazione, viene modificato 8. Inoltre, è stato dimostrato che i marker di attività e plasticità che promuovono molecole come c-fos, GAP-43, o BDNF ma anche plasticità molecole inibitrici, come Nogo-A di visualizzazione ruoli normativi per l'apprendimento correlati neuronali plasticità 9-16.
Questi progressi verso una migliore comprensione dei meccanismi alla base dell'apprendimento motorio potrebbe essere raggiunto solo con l'uso di paradigmi comportamentali che permettono un controllo preciso della acquisizione di una nuova capacità motorie, ad esempio, abile zampa anteriore portata. Solo un compito comportamentale ben strutturata permette di monitorare e catturare i cambiamenti che si verificano correlative su apprendimento e l'esecuzione dei rispettivi compiti. Qui mostriamo visivamente una versione modificata del forelimb qualificatisingolo-pellet compito di raggiungere nei ratti adattati da Buitrago et al. 17 Il paradigma presentato consente l'analisi dell'acquisizione movimento all'interno di una sessione di allenamento al giorno (entro sessione) che rappresenta la componente di apprendimento veloce e acquisizione primaria così come l'apprendimento motorio qualificato in diverse sessioni (tra-session) che rappresenta la componente di apprendimento lenta e manutenzione del compito imparato 18. È importante sottolineare che questo paradigma comportamentale aumenta il grado di difficoltà e la complessità del compito abilità motoria a causa di due caratteristiche: in primo luogo, i ratti sono addestrati a girare intorno al proprio asse dopo ogni comprensione e quindi di riallineare il proprio corpo prima del prossimo pellet portata e rinnovare l'orientamento del corpo, impedendo l'esecuzione costante movimento dalla stessa angolazione. In secondo luogo, pellets vengono recuperati da un palo verticale posto davanti alla gabbia. A causa del piccolo diametro del palo, pellet possono essere facilmente dato il via richiede una comprensione precisa per il recupero di successo e preventing semplice trazione del pellet verso l'animale.
Tale test comportamentali complesso permette una maggiore comprensione dei meccanismi alla base dell'apprendimento motorio. Rispetto ai topi, ratti sono superiori nella loro esecuzione dei compiti comportamentali complessi e quindi più adatto per paradigmi complessi come presentato in questo studio. Considerando le crescenti possibilità genetici disponibili per i ratti 19,20, la combinazione di metodi di analisi comportamentale precisi e ben controllati con manipolazioni genetiche, l'imaging e tecniche fisiologiche rappresenta una potente cassetta degli attrezzi per capire meglio le basi neurobiologiche di apprendimento motorio e della memoria.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del veterinario del Cantone di Zurigo, Svizzera.
1. Manipolazione di animali e assuefazione
- Manipolazione di animali
Nota: 5 giorni prima dell'inizio dell'esperimento, eseguire il passaggio 1.1.1 giornaliera.- Per gli esperimenti comportamentali, abituare gli animali allo sperimentatore. Hanno quotidiana gestione sessioni della durata di 10-15 minuti per ogni animale. Pulire la scatola dopo la sessione di ogni animale.
- Inizialmente, mettere la mano dello sperimentatore in una gabbia che permette all'animale di esplorare e sentire l'odore di diventare familiarizzato con lo sperimentatore.
- Successivamente, sollevare delicatamente l'animale con la mano dello sperimentatore in modo sicuro afferrando il corpo del topo tra le zampe anteriori e posteriori che consentano una ulteriore familiarizzazione.
- Pesare ogni animale al giorno per ottenere un peso corporeo di base prima di privazione di cibo.
- Apparato assuefazione e familiarizzazione alimentare
- Pesare ogni animale al giorno per ottenere un peso corporeo di base prima di privazione di cibo.
- Inizia cibo privando ratti 3 giorni prima l'inizio del pre-allenamento su una dieta standard di laboratorio. Dare ratti 0,05 g di alimento per 1 g di peso corporeo al giorno (per esempio, un ratto peso 200 g, iniziare con 10 g di cibo). Assicurarsi peso corporeo di non diminuire di più del 10% al giorno monitorando peso corporeo al giorno.
- Se più animali vengono tenuti in una gabbia, i ratti dominanti possono mangiare più di quelli meno dominanti. Nel caso in cui il peso di un animale diminuisce, nutrire l'animale separatamente invece di gruppo di alimentazione. Dare acqua ad libitum.
- Per conoscere il topo con l'apparato di presa, collocare l'animale nella scatola di formazione (Figura 1). Avere pellets zucchero immessi nella casella di formazione in prossimità dell'apertura della fessura per conoscere l'animale con i pellet cibo. Eseguire questo step 10-15 minuti al giorno per 3 giorni.
2. Pre-allenamento e abilità di apprendimento Motor
- Pre-training
- Un giorno dopo familiarizzazione, posizionare l'animale nella scatola formazione e posizionare il pellet strettamente per l'apertura a fessura in modo che possa essere raggiunto dalla linguetta dell'animale. Escludere gli animali che recuperano pellet con loro arti anteriori durante la pre-formazione
Nota: In questa fase, il recupero pellet con la lingua è cruciale e solito metodo dell'animale di scelta. Pellet devono essere in nessun caso colto con la zampa anteriore fino al primo giorno di apprendimento delle capacità motorie per consentire un adeguato monitoraggio del compito di raggiungere imparato. Recupero pellet con la zampa anteriore durante la pre-formazione è un criterio di esclusione e in molti casi non osservate. - Insegna il ratto o correre sul retro della gabbia e tornare alla apertura a fessura o passo indietro e girare attorno al proprio asse per ricevere il cibo successiva pellet conla lingua. Attendere che l'animale per esplorare la gabbia, eseguire verso la parte posteriore e tornare alla apertura a fessura. Se l'animale non esegue correttamente il compito, utilizzare una pinza a picchiettare delicatamente sul retro fine della gabbia e catturare l'attenzione dell'animale. Una volta che l'animale è sul retro, toccare delicatamente nella parte anteriore della gabbia per guidare l'animale per l'apertura a fessura.
Nota: Una volta che l'animale raggiunge un valore standard (ad esempio, 50 recuperi pellet di successo con la lingua in meno di 15 minuti), l'animale si qualifica per la fase di apprendimento delle capacità motorie. Il giorno 1 e 2 di pre-formazione, gli studenti possono già essere distinti da non discenti. Non gli studenti possono essere esclusi dallo studio in questa fase. Questo diminuisce la probabilità di avere un alto numero di non studenti durante la fase di apprendimento del motore (2.2). - Durante la pre-formazione, cibo privare i ratti su una dieta standard di laboratorio. Dare acqua ad libitum. Monitorare peso corporeo al giorno nel corso dello studio. FareNon usare lo stesso spazio per allenarsi ratti maschi e femmine. Garantire un ambiente tranquillo e privo di rumore per l'animale.
- Un giorno dopo familiarizzazione, posizionare l'animale nella scatola formazione e posizionare il pellet strettamente per l'apertura a fessura in modo che possa essere raggiunto dalla linguetta dell'animale. Escludere gli animali che recuperano pellet con loro arti anteriori durante la pre-formazione
- Determinazione del Preference Paw e Skill Learning Motor
- Durante la prima sessione di apprendimento delle capacità motorie, sostituire la diapositiva davanti alla finestra con un post. Posizionare il pellet zucchero circa 1,5 cm di distanza dalla finestra sul montante in modo che l'animale non può raggiungere il pellet con la lingua ma solo recuperare da un forelimb preciso di raggiungere e afferrare il movimento.
- Per applicare il recupero pellet dalla zampa anteriore, utilizzare una pinza per portare delicatamente il pellet vicino alla bocca dell'animale e ritirare il pellet mentre l'animale tenta consumo con la lingua. Effettuare questa operazione ripetutamente fino a quando l'animale si allunga la zampa anteriore e afferra un pellet.
- Posizionare il montante centrale per l'apertura della finestra. Per determinare la zampa preferenza, osservare con attenzione le prime 10 prove in giornata di formazione 1. Più del 70% del REACtentativi hing (cioè 7 su 10) devono essere eseguiti con la stessa arti anteriori. Se ciò non viene raggiunto, proseguire con un altro ciclo di 10 prove fino al raggiungimento della soglia del 70%.
- Dopo la determinazione della zampa preferenza, spostare la posta verso la zampa anteriore preferito e allineare centrale al confine con l'apertura della finestra. Allineamento paw preferita significa il post viene spostato contrario alla rispettiva zampa per consentire un angolo ottimale per raggiungere (Figura 1B, C).
- Classificare un processo, definito come un nuovo pellet presentato all'animale, come successo (raggiungere, afferrare, recuperare e mangiare il pellet), goccia (raggiungere, afferrare e perdere pellet durante il recupero) o non (battere pellet il palo). Annota ogni prova nel foglio e analizzare i dati dopo l'esperimento.
- Effettuare una sessione giornaliera costituito da un numero definito di prove (ad esempio, 150) o un tempo massimo (ad esempio, 1 ora) per ciascun animale.
- Indagare precisione e messa a puntodel movimento utilizzando prima analisi tentativo. Un primo tentativo è definita afferrando il precipitato in un unico movimento monolitico senza interruzioni, esitazione o ripetizione di singoli componenti del movimento. Osservare attentamente ogni presa dal topo.
- Se il ratto esita o si ritrae durante una portata o tenta diverse prove di cogliere correttamente la pallina, annotare il relativo processo come il successo, ma non è il primo tentativo. Se l'animale afferra con successo il pellet in un'unica portata monolitico, annotare il relativo processo come successo il primo tentativo in una colonna separata nel foglio.
- Durante l'apprendimento delle capacità motorie, cibo privare i ratti su una dieta standard di laboratorio. Dare acqua ad libitum. Monitorare peso corporeo al giorno nel corso dello studio.
- Durante la prima sessione di apprendimento delle capacità motorie, sostituire la diapositiva davanti alla finestra con un post. Posizionare il pellet zucchero circa 1,5 cm di distanza dalla finestra sul montante in modo che l'animale non può raggiungere il pellet con la lingua ma solo recuperare da un forelimb preciso di raggiungere e afferrare il movimento.
- Per gli esperimenti comportamentali, abituare gli animali allo sperimentatore. Hanno quotidiana gestione sessioni della durata di 10-15 minuti per ogni animale. Pulire la scatola dopo la sessione di ogni animale.
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Representative Results
Acquisizione di abilità motoria di successo si ottiene solo attraverso la pratica costante. Nonostante un attento esame di tutti gli aspetti, alcuni ratti riescono a imparare il compito (Figura 2). Questi "non discenti o mancanza di motivazione conseguente pochi o assenti tentativi di recupero pellet dall'inizio dell'esperimento o in generale perdono interesse nel raggiungere per il pellet che portano alla riuscita continuamente tentativi. Al contrario, alcuni animali mostrano un comportamento aggressivo e più motivato con conseguente precipitosa e corsero cogliere i tentativi che portano a fallimenti. Un terzo gruppo di studenti falliti sono quegli animali che iniziano con alte percentuali di successo e non fanno un miglioramento significativo che porta a stagnare o addirittura diminuito curve di apprendimento.
Il successo di apprendimento delle capacità motorie si compone di due fasi: una componente di apprendimento veloce che rappresenta acquisizione primaria di solito osservate entro il primo giorno di allenamento a motore (in-session;
Per analizzare le prestazioni nel corso di ogni (analisi all'interno sessione) che quotidiano sessione, dividere il numero totale di prove in 25 contenitori di prova (ad esempio, 6 bidoni per 150 prove). Dopo l'esperimento, calcolare la percentuale di pellets afferrati successo per ciascun bin dividendo il numero di successi nel rispettivo scomparto per il numero totale di prove sul rispettivo giorno.
Va considerato che l'acquisizione delle capacità motorie può variare tra i singoli animali. Diversi i ratti hanno bisogno di un diverso numero di giorni per raggiungere il livello di plateau. Pertanto, i singoli curve di apprendimento sono usualily non liscia come la curva media di apprendimento.
Un'altra espressione di apprendimento motorio di successo è l'analisi di multa apprendimento motorio sintonizzati. Per valutare questo aspetto, abbiamo misurato il numero di pellet afferrato al primo tentativo durante un movimento monolitico senza esitazioni o interruzioni rispetto a tutte pellets misurati con successo (Figura 5).
Gli esempi della Figura 2 - 5 mostrano le curve di apprendimento di 150 pellets afferrato / giorno nel corso di 6 giorni. Giorno 1 si riferisce al primo giorno di apprendimento motorio.
Figura 1: Progettazione del box della formazione di ratto (A) La scatola di formazione con le rispettive dimensioni.. Per evitare il recupero di pellet che sono stati persi all'interno della scatola, il terreno della camera di formazione è fatta di aste metalliche , Attraverso la quale persero pellet cadono. (B) Chiudi vista dell'apertura fessura e il palo. Notare la posizione del posto centrale allineato all'apertura a fessura. (C) Esempio di un ratto afferrare correttamente un pellet attraverso l'apertura a fessura. Notare la posizione di post spostata e l'angolo risultante verso zampa anteriore dell'animale preferito (in questo caso a destra). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Esempio di un animale che non presentano acquisizione successo dell'abilità del motore nel corso di 6 giorni Il tasso di successo ristagna circa il 20% alcun miglioramento rispetto al perfezionamento.
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Figura 3: Analisi Entro giorni del stesso esempio come mostrato in Figura 4. La percentuale di successo è diviso in 6 contenitori di 25 pellets illustrano il miglioramento nell'apprendimento motore durante una singola sessione giornaliera. Notare il tasso di successo iniziale durante le prime 25 prove dei primi 2 giorni in confronto con il tasso medio di successo dei rispettivi giorni di figura 4, nonché il miglioramento generale entro il giorno 1 e 2 rispetto alla figura 4.
Figura 4:. Esempio di un animale con una tipica curva di apprendimento, di successo nel corso di 6 giorni La percentuale di pellets afferrati successo (percentuale di successo) aumenta durante i primi 3 giorni e raggiunge un plateau durante i restanti giorni.
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Discussion
Il paradigma mostrato in questo studio è adattato da Buitrago et al 18 e differisce dal classico singolo pellet raggiungendo paradigma 17 principalmente in due aspetti.:
In primo luogo, lo studio miglioramento entro sessione permette l'analisi del compito imparato in un solo giorno, che può fornire un diverso livello di informazioni, come ricerca del componente di apprendimento veloce rispetto al componente di apprendimento lenta rappresentati dai valori medi giornalieri (vedi figure 3 e 4). In secondo luogo, il paradigma comportamentale qui presentata aumenta il grado di difficoltà e complessità del compito abilità motoria. L'animale è costretto a riallineare suo orientamento corpo e raggiungere prima di ogni recupero pellet. Questo impedisce semplice esecuzione ripetitiva movimento dalla stessa angolazione e richiede profonda orientamento spaziale. Inoltre, pellets vengono recuperati da un post sottile verticale che è posto di fronte the gabbia e corrisponde al diametro del pellet richiedendo così una comprensione precisa per il recupero di successo e prevenire semplice trazione del pellet verso l'animale.
Un passo importante insegna all'animale di correre verso la parte posteriore della gabbia e tornare alla apertura a fessura durante la pre-formazione. Accennando il topo nella posizione desiderata utilizzando una pinza e delicatamente picchiettando sul pannello posteriore della gabbia aiuta l'animale per comprendere l'attività. Lo sperimentatore dovrebbe usare con attenzione questo strumento come overtapping produce troppo rumore e irrita l'animale. Una volta che il ratto è tornato al fronte della gabbia, posizionare diversi pellets zucchero in apertura a fessura per l'animale per prendere confidenza con il gusto, odore e la posizione del pellet. Un altro passo importante è il recupero pellet con la zampa anteriore, il primo giorno di apprendimento motorio. L'animale continua spesso tentativi di recuperare il pellet con la lingua come appreso durante pre-allenamento. Utilizzando una pinza per portare dolcemente the pellet vicino alla bocca e la scomparsa della pallina dell'animale mentre il consumo tentativi animali con la lingua impone il topo di allungare la zampa anteriore per il recupero del pellet di successo. L'obiettivo è quello di permettere all'animale di cogliere il pellet dal forcipe con la zampa anteriore e recuperare il pellet zucchero fino alla foce. Una volta che questo è stato raggiunto, palline possono essere messi a determinazione preferenza palo e zampa può essere valutato. Questi due passaggi sono le parti più importanti di tutta la sperimentazione e richiedono un approccio attento per l'animale, nonché la pazienza dello sperimentatore.
E 'importante notare che esistono differenze di apprendimento tra i singoli animali e tra genere (maschi imparano più lento rispetto alle femmine 18) e le tensioni (secondo la nostra osservazione, ratti Sprague-Dawley utilizzato in questo studio e Long-Evans ratti mostrano apprendimento superiore rispetto a ad esempio, ratti Lewis). Pertanto, al fine di soddisfare la sfida richiedonomenti del compito, i tassi di successo possono richiedere modifiche del paradigma a seconda del sesso e la tensione. Per mantenere la bassa varianza, non mescolare sforzi e di genere in una serie sperimentale.
Ben strutturato e paradigmi comportamentali controllabili sono di importanza cruciale per gli studi che indagano correlati cellulari alla base meccanismi del comportamento patologico e fisiologico. I compiti più complessi comportamentali che i ratti sono in grado di apprendere rappresentano un importante vantaggio di ratto su topi. I progressi in corso in tecnologie per le manipolazioni genetiche nel ratto permetteranno nel prossimo futuro di condurre esperimenti nei ratti che erano finora possibile solo nei topi 19-21. In combinazione con le tecnologie di imaging nuove e tecniche che permettono la manipolazione mirata dei circuiti neuronali, paradigmi comportamentali nei ratti possono aprire nuove strade verso la comprensione dei principi fisiologici e patologici delle funzioni del sistema nervoso.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni del Fondo nazionale svizzero (Grant 31003A-149315-1 per MES e di Grant IZK0Z3-150809 di AZ), per AZ il Demetriades Fondazione Heidi, al MES il Consiglio europeo della ricerca ('Nogorise') e la Christopher e Dana Reeve Foundation (CDRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Training box | Self Made | ||
| Pedestal | Self Made | ||
| Sugar pellets | TSE Systems Intl. Group | 45 mg dustless precision pellets | |
| Sprague Dawley rats | 5-6 week old males | ||
| Laptop computer | Hewlett Packard | ||
| Stop Watch | |||
| Forceps | Fine Science Tools (FST) | ||
| Excel | Microsoft | ||
| Prism | GraphPad | ||
| Weighing scale | |||
| Counter |
References
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