Abstract
Viele gramnegative Bakterien einschließlich pathogenen Yersinia spp. Beschäftigen Typ III-Sekretion Systeme Effektorproteinen in eukaryontische Zielzellen zu translozieren. Im Inneren der Wirtszelle die Effektor-Proteine zu manipulieren zellulären Funktionen zum Vorteil der Bakterien. Um die Kontrolle des Typ III-Sekretion während der Host-Zell-Interaktion, empfindliche und genaue Tests besser zu verstehen, um die Translokation zu messen sind erforderlich. Wir beschreiben hier die Anwendung eines Assays auf der Basis der Fusion einer Yersinia enterocolitica Effektorprotein Fragment (Yersinia Außen Protein; YopE). TEM-1-Beta-Lactamase für eine quantitative Analyse der Translokation Der Assay beruht auf der Spaltung einer Zelle permeant FRET-Farbstoff (CCF4 / AM) durch transloziert Beta-Lactamase-Fusion. Nach der Spaltung des Cephalosporins Kern CCF4 durch die Beta-Lactamase, FRET von Cumarin zu Fluorescein ist gestört und Anregung der Kumarin-Gruppe führt zu blauen Fluoreszenzemission.Verschiedene Anwendungen dieses Verfahrens sind in der Literatur Hervorhebung ihrer Vielseitigkeit beschrieben. Das Verfahren erlaubt die Analyse der Translokation in vitro als auch in vivo, zB in einem Maus-Modell. Detektion der Fluoreszenzsignale kann unter Verwendung von Plattenleser, FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie werden. In der hier von verschiedenen Yersinia Mutanten beschrieben, in vitro Translokation von Effektor-Fusionen in HeLa-Zellen-Setup wird durch Laser Scanning Mikroskopie überwacht. Aufzeichnung intrazellulären Umwandlung des FRET-Reporter durch die Beta-Lactamase-Effektor-Fusion in Echtzeit bietet robuste quantitative Ergebnisse. Wir zeigen hier beispielhafte Daten, was zeigt, erhöhte Translokation von einem Y. enterocolitica YopE Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Stamm.
Introduction
Typ III-Sekretion Systeme sind von verschiedenen spezialisierten Genera gram-negativer Bakterien, direkt liefern bakteriell kodierte Effektorproteinen in eukaryontische Zielzellen genutzt Protein-Export-Maschinen. Während die Sekretion Maschine selbst ist hoch konserviert, haben spezialisierte Gruppen von Effektorproteinen zwischen den verschiedenen Bakterienarten entwickelt, um Signale der Zelle verändern und erleichtern bestimmten bakteriellen Virulenz-Strategien ein. Im Falle von Yersinia, bis zu sieben Effektorproteine sogenannte Yops (Yersinia äußeren Proteine), werden bei Wirtszelle Kontakt transloziert und wirken zusammen, um die Immunzellantworten, wie Phagozytose und die Cytokin-Produktion, dh wandern, um extrazelluläre Überleben der Bakterien erlauben 2-4. Der Prozess der Translokation ist eng in den verschiedenen Phasen 5 gesteuert. Es ist erwiesen, dass die primäre Aktivierung des T3SS durch seinen Kontakt mit dem Ziel ce ausgelöstll 6. Jedoch ist der genaue Mechanismus dieser Einleitung noch aufgeklärt werden. Yersinia in eine zweite Ebene von sogenannten Feinabstimmung der Translokation durch Aufwärts- oder Abwärtsregulierende Aktivität der zellulären Rho GTP-bindenden Proteinen Rac1 oder RhoA erreicht. Aktivierung von Rac1 zB durch Invasindomäne oder zytotoxische nekrotisierende Faktor Y (CNF-Y) führt zu einer erhöhten Translokation 7-9, während die GAP (GTPase-aktivierendes Protein) Funktion transloziert YopE herunterreguliert Rac1-Aktivität und dementsprechend verringert sich die Translokation durch eine negative Rückkopplung der Mechanismus 10,11.
Gültig und präzise Methoden sind die Voraussetzung, um zu untersuchen, wie die Translokation bei Yersinia Wirtszellinteraktion wird geregelt. Viele verschiedene Systeme wurden für diesen Zweck mit spezifischen Vor- und Nachteile gelegt, wobei jeder. Einige Ansätze beruhen auf der Lyse von infizierten Zellen, nicht aber Bakterien durch verschiedene Reinigungsmittel, gefolgt von Western-Blot-Analyse. The gemeinsamer Nachteil dieser Verfahren ist, dass geringfügige, aber unvermeidliche Bakterienlyse potentiell verunreinigt das Zelllysat mit Bakterien-assoziierten Effektor-Proteine. Die Behandlung der Zellen mit Proteinase K, um extrazelluläre Effektorproteine und die anschließende Verwendung von Digitonin zur selektiven Lyse der eukaryotischen Zellen abgebaut wurden vorgeschlagen, um dieses Problem zu 12 zu minimieren. Wichtig ist, dass diese Assays entscheidend davon abhängen, hochwertige Anti-Effektor-Antikörper, die größtenteils im Handel erhältlich sind es nicht. Versuche, translationale Fusionen Effektorproteine und fluoreszierende Proteine wie GFP verwenden, um die Translokation zu überwachen, waren nicht erfolgreich wahrscheinlich aufgrund der globularen Tertiärstruktur der fluoreszierenden Proteine und der Unfähigkeit des Sekretionsapparates, sie vor Sekretion 13 entfalten. Doch verschiedene Reporter-Tags wie die cya (Calmodulin-abhängige Adenylatcyclase) Domäne des Bordetella pertussis Toxin cyclolysin 14 oder dem Flash-Tag wurden erfolgreich eingesetzt, um die Translokation zu analysieren. Im ersteren Assay die enzymatische Aktivität der cya wird verwendet, um das Signal des intrazellulären Fusionsprotein zu verstärken, während der Flash Tag, ein sehr kurzer Tetracysteinmotiv (4cys) Motiv-Tag ermöglicht die Kennzeichnung mit dem biarsenische Farbstoff Flash ohne den Prozess der Sekretion stören 15.
Das hier angewandte Konzept wurde erstmals von Charpentier et al. Berichtet, und ist an der intrazellulären Umwandlung des Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Farbstoff CCF4 durch transloziert Effektor TEM-1-beta-Lactamase-Fusionen 16 (1A) auf der Basis. CCF4 / AM ist ein zelldurchdringenden Verbindung, in der ein Cumarin-Derivat (Donor) und eine Fluoresceingruppe (Akzeptor) werden durch ein Cephalosporin-Kerns verbunden ist. Beim passiven Eintritt in die eukaryotische Zelle, die nicht-fluoreszierende verestert CCF4 / AM-Verbindung durch zelluläre Esterasen zu der geladenen und fluoreszierende CCF4 verarbeitet und dadurch gefangeninnerhalb der Zelle. Anregung der Kumarin-Gruppe bei 405 nm ergibt FRET an die Fluoresceingruppe, die ein grünes Fluoreszenzsignal bei 530 nm emittiert. Nach der Spaltung des Cephalosporins Kern durch die Beta-Lactamase FRET gestört und Anregung der Kumarin-Gruppe führt zu blauen Fluoreszenzemission at460 nm. Verschiedene Anwendungen dieses Verfahrens sind in der Literatur Hervorhebung ihrer Vielseitigkeit beschrieben. Das Verfahren erlaubt die Analyse der Translokation in vitro als auch in vivo, beispielsweise wurde die Technik in einem Mausinfektionsmodell verwendet, um die Leukozyten-Populationen für die Translokation in vivo 17-19 gezielte identifizieren. Auslesen der Signale kann mit Plattenlesegeräte, FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. Zu beachten ist, sieht das Verfahren auch die Möglichkeit, Translokation in Echtzeit Live-Zell-Mikroskopie während des Infektionsprozesses 20,21 überwachen. Hier wurde Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskopie für readou angewendett von Fluoreszenzsignalen da sie die höchste Empfindlichkeit und Genauigkeit. Insbesondere die Möglichkeit der Emissionsfenster mit Nanometer-Präzision in Kombination mit hochempfindlichen Detektoren erleichtert optimierte Fluoreszenzdetektion und minimiert ein Übersprechen zu justieren. Zusätzlich kann diese Einrichtung für die Mikroskopie eine Echtzeitüberwachung der Translokation angepasst werden und potenziell ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktion auf zellulärer Ebene.
In dieser Studie Translokationsgeschwindigkeiten eines Y. enterocolitica Wildtyp-Stamm und eine YopE Deletionsmutante die eine hypertranslocator Phänotyp 10,11 wurden exemplarisch analysiert.
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Protocol
1. Spitzenemission und Übersprechen Bestimmung (siehe auch Abbildung 2)
- Um die Emissionsspitzen und die Höhe des Übersprechens zwischen dem Donor (Cumarin-Derivat V450) und Akzeptor (Fluorescein) Farbstoffe zu bestimmen, führen spektralen Scans von Zellen, die sowohl einzelne Fluorophore bei 405 nm Anregung bezeichnet.
- Bestimmen einer 10 nm Bandbreite, innerhalb der Spitze von jedem Farbstoff, der für die Donor- und Akzeptor-Kanälen (hier: 455-465 nm und 525-535 nm) verwendet wird. Zeichnen Sie die normierte Intensität über der Wellenlänge und die Berechnung der durchschnittliche Prozentsatz der Übersprechen der Donor-Farbstoff in der Akzeptor-Kanal und umgekehrt (Abbildung 2).
2. Herstellung von Y. enterocolitica Stämme für die Zellkultur-Infektion
- Verwenden Sie die folgenden Stämme: WA-314 pMK-Eizellen und (WA-314 mit den Plasmiden pMK-bla 17 und PMK-17-Eizellen bzw. transformiert) WA-314ΔYopE pMK-bla (WA-314ΔYopE transformiert mit dem Plasmid pMK-bla 17)
- Mindestens zwei Tage vor der Infektion Strähne Y. enterocolitica WA-314 pMK-Eizellen, WA-314 pMK-bla und cryo Bestände auf LB-Agarplatten, die die erforderlichen Antibiotika (Kanamycin für WA-314 pMK-bla und WA-314 pMK-Eizellen WA-314ΔE pMK-BLA ; Kanamycin und Tetracyclin für WA-314ΔE pMK-bla) und wachsen O / N bei 27 ° C. Danach halten die Platten für bis zu einer Woche bei 4 ° C.
- Einen Tag vor der Infektion zu impfen 3 ml LB-Medium, das die erforderlichen Antibiotika mit einer Kolonie der jeweiligen Stämme und inkubieren O / N bei 27 ° C in einem Schüttler bei 180 UpM.
- Am Tag der Infektion zu impfen 2 ml des O / N-Kultur in 40 ml frisches LB-Medium ohne Antibiotika und Inkubation für 90 min bei 37 ° C in einem Schüttler bei 180 rpm, um die Expression des Typ-III-Sekretionssystem induzieren.
- Übertragen Sie die Kulturen in ein geeignetes Rohr und die Kulturen zu halten auf Eis oder bei 4 ° Cvon jetzt an. Zentrifugieren die Kulturen 10 min bei 5000 × g und 4 ° C.
- Resuspendieren Bakterienpellet in 2-3 ml eiskaltem PBS. Verdünnen der Bakteriensuspension auf eine Konzentration von 8 x 10 8 cfu / ml unter Verwendung eines Spektrophotometers. Bestimmen Sie die entsprechende optische Dichte individuell. Bewahren Sie diese Suspension auf Eis, bis die Infektion der HeLa-Zellen.
3. Überzug HeLa-Zellen
- Einen Tag vor der Infektion Saatgut 1,5 x 10 4 Zellen HeLa-Zellen in 200 ul DMEM, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS) in Vertiefungen einer 96-Well-Platte und pflegen in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C. Seed drei Brunnen für jeden Stamm (drei unterschiedlichen Inkubationszeiten).
4. Die Infektion von HeLa-Zellen und Laden mit CCF4
- Infizieren HeLa-Zellen durch Zugabe von 3,5 ul der Bakteriensuspension auf das Medium und mischen durch vorsichtiges Pipettieren das Medium zweimal. Lassen Sie sich die Bakterien zu sedimentieren aufzu den Zellen bei einer MOI (Gruppierung of infection) von etwa 100 Bakterien pro Zelle. Für eine Zeit Kurs beginnen Infektionen bei -90 min, -60 und -30 min min und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator bis 0 min, um einen gemeinsamen Endpunkt zu erreichen.
- Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, wird das Medium sorgfältig absaugen, ohne HeLa-Zellen und 50 & mgr; l PBS, das 20 ug / ml Chloramphenicol, um die Expression von Effektoren und 2,5 mM Probenecid zu stoppen, um den Export von CCF4 reduzieren.
- An dieser Stelle überweisen Sie den 96-Well-Platte in den Mikroskoptisch, und definieren geeignete Plätze für eine spätere Analyse in jede Vertiefung. Beenden Sie den Schritt innerhalb von 10 Minuten (für Details der Akquisition siehe Abschnitt 5.1).
- Pro Loch, fügen Sie 70 ul CCF4 / AM Beladungslösung (0,24 & mgr; l Lösung A, 1,2 ul Lösung B, 18,56 & mgr; l Lösung C (Lösung A, B und C innerhalb CCF4 / AM Lade Kit enthalten) und 50 ul PBS (enthaltend 20 ug / ml Chloramphenicol und 2,5 mM Probenecid) unter Verwendung einer Mehr pipette und Inkubation für 5 min bei RT. Von nun an Arbeiten ohne Unterbrechungen.
- Absaugen Beladungslösung und 100 ul PBS, enthaltend 20 ug / ml Chloramphenicol und 2,5 mM Probenecid mit einem Multipipette. Dann schnell die Platte mit 96 Vertiefungen übertragen in den Mikroskoptisch und starten Akquisition innerhalb von 10 Minuten vom Streben der Beladungslösung.
5. Laser Scanning Mikroskopie und Analyse von Daten
- Bilderfassung
- Setzen die Bilderzeugungsbedingungen in einer Weise, um die Gesamtphotonenzahl zu maximieren und Phototoxizität, Photobleichen und Queranregung.
- In einer modernen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, mit einem 20X hoher numerischer Apertur Sionsobjektiv, öffnen Sie den Detektor Pinhole bis 2,5 Airy-Einheiten (dh breite optische Schnitte), wählen Sie eine hohe Empfindlichkeit GaAsP-Detektoren gleichzeitig aktive Donor und Akzeptor-Kanäle, 8 Bit-Tiefe , ~ 750 nm Pixelgröße, 3-fach-Rahmen Mittelwertbildung und excite mit 10% einer 405 nm Laserdiode.
- Um zu gewährleisten, stellen Sie die korrekte Quantifizierung Detektor-Verstärkung beider Kanäle auf den gleichen Wert und zu gesättigten Pixeln zu vermeiden.
Anmerkung: Hier wurden die Gewinne zu 150% festgelegt.
- Sicherzustellen Überflutung durch Spreizen Sionsmediums zum Boden der Vertiefungen, beispielsweise mit einer 1 ml Spritze und das Einfangen von Luftblasen zu vermeiden.
- Aktivieren Sie den Durchlicht und finden Sie eine repräsentative Sichtfeld in jeder gut. Verwenden Sie eine richtig kalibriert automatische Bühne und markieren Sie die Position in der Software.
- Nach der Entfernung der Platte für die Färbung (siehe Abschnitt 4.3), legen Sie die Platte und fügen Sie ein Gewicht auf den Brenndrift zu vermeiden. Überprüfen Sie die gespeicherten Positionen mit der Laser-Scanning-Modus und stellen Sie den Fokus und Seitenlage richtig.
- Stellen Sie den Zeitablauf bis 2 Minuten, die Dauer bis 2 Stunden und starten Akquisition.
- Setzen die Bilderzeugungsbedingungen in einer Weise, um die Gesamtphotonenzahl zu maximieren und Phototoxizität, Photobleichen und Queranregung.
- Bildquantifizierung (Beispiele für Bitplane Softw gegeben werdensind wie Imaris)
- Importieren Sie die Datenmenge in Software, die arithmetische Berechnungen von Pixelmatrix ermöglicht. Tun Sie dies durch Ziehen und Ablegen die Quelldatei, die sowohl den Donor und Akzeptor-Kanal auf das Software-Symbol.
- Subtrahieren Sie den Hintergrund in beiden Kanälen mit den gleichen Versatz. Um dies zu tun, klicken Sie auf Menü und dann auf Bild> Verarbeitung> Basisliniensubtraktion. Wählen Sie jeden Kanal und geben Sie den Ausgangswert.
- Korrigieren Sie den Durchschlag des Spenders Kanal (CH1) in das Akzeptor-Kanal (CH2) mit der vorgegebenen Korrekturfaktor f (siehe 1.1), die Schaffung eines neuen Kanal:
Ch2 '= CH 2 - Ch1 * f
HINWEIS: Ein Durchschlagen des Akzeptors in den Spender Kanal nicht über die Höhe der Rausch nachweisbar.- Klicken Sie auf Menü> Bildverarbeitung> Channel-Arithmetik und geben Sie abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Danach löschen Sie Kanal 2, indem Sie auf Menü> Bearbeiten> Kanäle löschen. Sicherzustellen, dass dieDurchschlagen korrigiert Akzeptorkanal bleibt der neue Kanal 2. Optional: Ändern Sie den Kanal Farbe von grau auf die ursprüngliche Farbe, indem Sie auf Menü> Bearbeiten> Image-Eigenschaften. Wählen Sie Channel 4> Mapped Farbe> Grundfarbe und ändern Sie es in zB grün.
- Erstellen Sie einen neuen Kanal mit den folgenden Vorgang, um die relative FRET Koeffizienten zu bestimmen:
Ch3 = CH 2 '/ (Ch1 + Ch2')- Gehen Sie zu Menü> Bildverarbeitung> Channel-Arithmetik und geben ch2 ./ (ch1 + ch2)
- Für die richtige Visualisierung der FRET-Kanal in einem 8-Bit-Bild, erstellen Sie einen vierten Kanal:
CH4 = 255 * Ch3- Gehen Sie zu Menü> Bildverarbeitung> Channel-Arithmetik und geben Sie 255 * CH 3. Ändern Sie den Kanal Farbe, indem Sie auf Menü> Bearbeiten> Image-Eigenschaften. Wählen Sie Channel 4> Mapped Farbe> Farbtabelle Datei> Jet.
- Tragen Sie eine 3x3 Medianfilter, um die Kanäle CH3 und CH4 that das Rauschen in den Bildern zu reduzieren. Um dies zu tun, Sie zu Menü> Bildverarbeitung> Glätten> Median-Filter klicken. Wählen Sie beide Kanäle und einen Filter Größe "3x3x1".
- Zur Quantifizierung von zellulären Signalen, erkennen die Zellen in Ch4 durch geeignetes Einstellen der Offset und filtern Sie die Strukturen durch Größe, um zu kleine Strukturen auszuschließen.
- Wählen Sie die Surpass-Ansicht und klicken Sie auf das Symbol "Neue Oberflächen". Definieren Sie die Erkennungsalgorithmus Parameter in der Oberflächen Fenster. Für eine schnellere Verarbeitung, aktivieren Sie die beiden Checkboxen "Segment nur eine Region of Interest" und "Prozess gesamte Bild endlich". Definieren Sie die Region von Interesse, indem Sie ihren Dimensionen.
- Wählen Sie Channel 4 als Quellkanal und stellen Sie die Schwelle durch Thresholding> Hintergrund Subtraktion (Local Contrast) und stellen Durchmesser bis 10 um. Stellen Sie die minimale Intensitätsschwelle manuell auf 0 und die maximale Schwelle der maximalen intensiviertty. Filtern Sie die Strukturen durch Bereich und den Minimalwert auf zB 187 um². Beenden Sie die Oberflächenerfassung.
- Extrahieren der Mittelwerte für Donorfluoreszenzintensität (Ch1) und die relative FRET Koeffizienten (CH3) und ihre Standardabweichungen im zellularen Entität. Um dies zu tun, gehen Sie auf die Oberflächeneigenschaften. Ändern Sie das Aussehen der Strukturen durch Auswahl Surfaces Style / Qualität> Surface. Wählen Sie alle Strukturen, indem Sie auf die Registerkarte Filter. Vereinheitlichen Sie die erfassten Strukturen, indem Sie auf Auswahl> Unify verarbeiten. Exportieren Sie die Oberfläche Statistiken in MS Excel, indem Sie auf der Registerkarte Statistik> Export Alle Statistiken in Datei.
- Zeichnen Sie diese Werte im Laufe der Zeit. Identifizierung der 10 min-Intervall der maximalen Steigung der Spenderkanal Fluoreszenzzunahme für jede Bedingung als eine vernünftige Parameter, um die Menge an transloziert Effektor darzustellen. Berechnung der Steigung m = Δ Donorfluoreszenzintensität / Δ Zeit (min).
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Representative Results
Um die Leistungsfähigkeit des beschriebenen Verfahrens zeigen, um quantitativ zu analysieren Effektor Translokation in Zielzellen wurden zwei Yersinia-Stämmen mit unterschiedlichen Translokation Kinetik untersucht: Y. enterocolitica Wildtyp-Stamm WA-314 (Serogruppe O8, beherbergen die Virulenzplasmid pYVO8 22) und seine Ableitung WA-314ΔYopE (WA-314 beherbergt pYVO8ΔYopE 23). Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Y. enterocolitica Mutanten ohne funktionelle YopE eine signifikant höhere Yop Translokation Rate 10. Beide Stämme wurden mit Vektoren Codierung für Fusionen von der N-terminalen Sekretionssignal YopE und TEM-1-Beta-Lactamase (bla pMK-) 17 umgewandelt. WA-314 wurde zusätzlich mit einem Vektor, der für einen jeweiligen YopE Ovalbumin Fusion (pMK-Eizellen 17) als negative Kontrolle dienen umgewandelt. Inkubationszeiten von 30, 60 und 90 Minuten wurden zur weiteren Beurteilung der method`s effektive Reichweite a angewendetnd Eignung für die Quantifizierung. Zwei verschiedene Ablesungen wurden für die Datenanalyse verwendet: Donor-Fluoreszenz (CH1) und relative FRET-Koeffizienten (CH 3 = CH 2 '/ (Ch1 + Ch2')) (Abbildung 1B und 1C).
Für die negative Kontrollstamm WA-314-pMK-Eizellen Plotten von Geberkanal Intensitäten (K1) über die Zeit zeigt keinen Anstieg der Fluoreszenzemission unabhängig von der Inkubationszeit (1B). Hingegen in WA-314-pMK-bla-infizierten Zellen eine Zunahme der Fluoreszenzintensität über die Zeit wurde nachgewiesen, was auf das Vorhandensein von YopE beta-Lactamase-Fusion im Cytoplasma der Zielzelle. Wie erwartet ist die maximale Steigung der Fluoreszenzintensität positiv mit der Länge der Infektion (0,10 / min, 60 min Infektion: 0,33 / min, 90 min Infektion: 30 min Infektions 0,76 / min) korreliert anzeigt, daß unterschiedliche Konzentrationen von transloziert beta- Lactamase unterschieden werden. In Übereinstimmung mit früheren Studien, WA-314ΔYopE-pMK-bla-infizierten Zellen zeigen eine schnellere Zunahme der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu dem Wildtyp-Stamm (30 min der Infektion: 1.28 / min, 60 min-Infektion: 1.53 / min, 90 min-Infektion: 1.41 / min). Interessanterweise erweitert Infektion bis 90 min keine weitere Beschleunigung der Anstieg der Donor-Fluoreszenz im Vergleich zu 60 min der Infektion (1B). Diese Feststellung kann vermutlich durch die fortschreitende zytotoxische Wirkung von WA-314ΔYopE-pMK-bla, die entweder hemmen könnten effiziente Translokation über 60 min der Infektion oder die Sicherheit von Fluoreszenzfarbstoffen wegen Störung der Plasmamembranintegrität ausgeübt erläutert. Die Ergebnisse unter Verwendung der relativen FRET Koeffizienten (Ch3) zur Analyse vorgesehen sind in guter Übereinstimmung mit den von dem Spenderkanal alleine erhalten wurden. Jedoch kann in einigen Bedingungen (WA-314ΔYopE-pMK-bla, 60 und 90 min-Infektion), die sehr große Mengen an transloziert beta-Lactamase-Fusion, war offensichtlich die CCF4 Substratlaufend verarbeitet vor der Bilderzeugung begonnen werden konnte. Diese Bedingungen würde nicht zur Berechnung einer angemessenen maximale negative Steigung, weil der relevante Teil der Kurve wird in diesem Datendarstellung (Abbildung 1c) verpasst zu ermöglichen. Bilder der relativen FRET Koeffizienten Kanal bieten die Möglichkeit, Unterschiede zwischen den einzelnen Zellen (1D) zu vergleichen.
Abbildung 1. Die quantitative Analyse der Effektor-Translokation von TEM-1 YopE Fusionen in Y. enterocolitica. (A) Die Hydrolyse des Substrats durch CCF4 transloziert TEM-1-beta-Lactamase durch Laser-Scanning-Mikroskopie überwacht. Anregung bei 405 nm im grünen Fluoreszenz-Emission (530 nm) des intakten Substrat und in blaue Fluoreszenz-Emission (460 nm) des gespaltenen Hydrolyse pr resultierteoduct (Cumarin). (B, C) Mikroskopie Daten wurden quantitativ durch Auftragen des Spenderintensitätskanal (CH1) oder Berechnung und Aufzeichnung der relativen FRET Koeffizienten (CH3 = CH 2 '/ (Ch1 + Ch2')) analysiert. Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. (D) Dargestellt Aufnahmen (FRET Kanal) wurden aus repräsentativen Filme zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. WA-314ΔE-pMK-bla-infizierten Zellen zeigen eine schnellere Abnahme der relativen FRET-Koeffizienten im Vergleich zum Wildtyp-WA-314-pMK-bla (60 min-Infektion). Maßstabsleiste, 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Übersprechen Bestimmung der Fluorophore V450 und FITC.Die Spektren sowohl der einzelnen Fluorophore wurden mit dem konfokalen Mikroskop gemessen. Durchschlagen des Spenders V450 in die Akzeptor-Kanal innerhalb des 525-535 nm Detektorbereich wurde aus einer linearen Regression (Einsatz) berechnet. Der mittlere Prozentsatz von Nebensprechen von zwei Messungen berechnet gleich 0,33. Durchschlagen des Akzeptor-FITC in den Geberkanal (455-465 nm) nicht über den Geräuschpegel zu erkennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir hier erfolgreich angewendet ein TEM-1-beta-Lactamase-Reporter-basierten Assay für die quantitative Analyse von Effektorzellen Translokation von Y. enterocolitica. Viele verschiedene Variationen dieses empfindliche, spezifische und relativ einfache Technik, wurden in der Literatur beschrieben worden. In dieser Studie wurde der Laser Scanning Mikroskopie für die empfindlichsten und präzise Detektion von Fluoreszenzsignalen durchgeführt. Insbesondere die Korrektur für das Übersprechen zwischen den Donor- und Akzeptor-Farbstoffe und die individuell einstellbare Erfassungsbandbreiten ermöglichen eine überlegene Messgenauigkeit im Vergleich zu anderen Variationen des Verfahrens. Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß das Verfahren in der Lage, quantitative Analyse Translokation. Verschiedenen Inkubationszeiten, die verschiedene Konzentrationen an intrazelluläre beta-Lactamase positiv mit der Steigung Donorfluoreszenzintensität korreliert. Auch eine deutlich höhere Translokationsrate der WA-314ΔYopE Vergleichzu dem Wildtyp-Stamm WA-314 nachgewiesen werden.
Zwei Alternativen für die Datenanalyse wurden angewandt: Geberkanal Intensitäten und relative FRET-Koeffizienten. Der Vorteil der Verwendung der Donor-Kanal ist, dass es direkt die Ansammlung einer CCF-4 Hydrolyseprodukt (Cumarin) darstellt. Dieser Ansatz wird in einem mikroskopischen Aufbau möglich, denn anders als in einem Plattenleser Korrektur für Unterschiede in der Zelldichten, die durch Verwendung eines Verhältnisses von Donor / Akzeptor ist nicht notwendig. Allerdings ist Export der CCF4 Farbstoff oder dessen Hydrolyseprodukte noch eine mögliche Confounder in diesem Ansatz. Dieser Nachteil kann durch Berechnen der relativen FRET Koeffizienten überwunden werden.
In den beschriebenen Setup-Experimente wurden in 96-Well-Platten durchgeführt. Dieses Format ermöglicht die Prüfung von mehreren Bedingungen in einem einzigen Experiment und hilft, teure Chemikalien (insbesondere CCF4 / AM Lade Kit) zu speichern. In der beschriebenen Arbeitsablauf ist es wichtig, im startenAlter Erfassung bei einem definierten Zeitpunkt kurz nach Zugabe des CCF4 / AM Beladungslösung, da die Hydrolyse von CCF4 vom transloziert beta-Lactamase wird sofort gestartet. Bei Verarbeitung der vielen Einflussfaktoren auf einmal, kann die Einstellung des Fokus und der seitlichen Positionen (Schritt 5.1.4) zu lange dauern und behindern eine rechtzeitige Beginn der Bildaufnahme. Daher muss die maximale Anzahl der parallelen Proben individuell bestimmt werden.
Eines der Hauptprobleme mit diesem Verfahren war die erhebliche Ausfuhr CCF4 Substrats durch die HeLa-Zellen bei 37 ° C. Dieses Phänomen konnte nicht ausreichend durch Behandlung der Zellen mit Probenecid entgegengewirkt werden. Daher haben wir beschlossen, anstatt der Überwachung Translokation im laufenden Infektion, wie zuvor beschrieben, an der ersten vollständigen Infektion der Zellen mit dem CCF4 / AM Farbstoff danach laden. Mit dieser Vorgehensweise war es möglich, die Verarbeitung des CCF4 Substrat bei RT überwachen. Unter diesen Bedingungen reduCED Export von CCF4 beobachtet. Die Höhe der Export von CCF4 Substrat scheint zu sein, Zelllinie spezifische; der hier beschriebene Aufbau ermöglicht eine zuverlässige Analyse der Translokation auch in Zelllinien, die stark exportieren CCF4 bei 37 ° C.
Export von CCF4 ist nicht ein Problem in einigen anderen Zelllinien erlaubt, die Mikroskopie-Setup für die gleichzeitige Überwachung der Prozesse der Infektion und Translokation in Echtzeit anzunehmen. Dies bietet die Möglichkeit, Translokation in einzelne Zellen untersucht und verwendet werden, um die Translokation mit bestimmten Ereignissen von Wirtszellinteraktion wie bakterielle Adhäsion oder der Bildung von Mikrokolonien 20 korrelieren. Daher ist dieser Test ein wertvolles Werkzeug zur weiteren Aufklärung der Mechanismen der Translokation in dem Zusammenspiel von Bakterien und Wirtszellen, reguliert wird.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
