Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

SH-SY5Y İnsan Nöroblastom Hücre Hattı Farklılaşma

Published: February 17, 2016 doi: 10.3791/53193
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Huck Institutes of the Life Sciences, The Pennsylvania State University

Introduction

Vitro model sistemlerinde kullanma yeteneği büyük ölçüde nörobiyoloji ve nörolojik bilimler alanlarını artırmıştır. kültürde Hücreler hastalık ve enfeksiyon patolojisi anlamak ve ön uyuşturucu testi değerlendirmeleri gerçekleştirmek için, protein işlevsellik ve moleküler mekanizmalar yatan spesifik olayları karakterize etmek verimli bir platform sağlar. Nörobiyolojisinde, hücre kültürü modelleri arasında en önemli tipleri, örneğin, sıçan B35 hücreleri 5, Neuro-2A, fare hücreleri 6 ve sıçan PC12 hücrelerinin 7 gibi sıçan ve fareler ve nöroblastom hücre çizgilerinden türetilen primer nöron kültürleri içerir. Bu hücre çizgilerinin kullanımı önemli ölçüde alanı gelişmiş olmasına rağmen, insan olmayan hücreler ve doku tutulması ile ilgili çok sayıda karıştırıcı faktörler vardır. insanlara kıyasla bu anlayış türe özgü metabolik süreçlerde farklılıkları, hastalık tezahürü ve patogenezi fenotipleri içerir. Dikkat etmek de önemlidirkemirgen modellerinin sınırlamaları ve yollar kemirgenler ve insanlarda 8-11 arasında korunmuştur anlayış önemini vurgulayarak fare ve insan gen ifadesi ve transkripsiyon faktörü sinyalizasyon arasında önemli farklılıklar, yeniden bulunmaktadır. Diğer N-tera-2 (NT2), insan teratokarsinoma hücre hattı ve uyarılabilir pluripotent kök hücreler (iPSCs) dahil olmak üzere insan nöronal hücre çizgilerinin kullanımı kullanmışlardır. Bu hücre hatları in vitro insan sistemler için iyi modeller sunar. Bununla birlikte, retinoik asit (RA) nöronları, astrositler oluşan karışık bir popülasyonda oluşmasına neden ve ek saflaştırma adımı gerektiren radyal glial hücreleri 12 ile NT2 hücre farklılaşması nöronların saf popülasyonları elde edildi. Buna ek olarak, NT2 hücre hücrelerin% 72 daha büyük 60 kromozomlu bir çok değişken karyotipe 13 göstermektedir. iPSCs farklı hücre hatları arasında farklılaşmasında değişkenlik göstermektedir ve farklılaşma etkinliğinde değişiklik gösterebilir 14. Alternatiflerin güzelleştirmek için tutarlı ve tekrarlanabilir bir insan nöron hücresi modeli olması arzu edilen bir durumdur.

SH-SY5Y neuroblast benzeri hücreler, ebeveyn nöroblastoma hücre çizgisi SK-N-SH bir alt klon vardır. Parenteral hücre hatları neuroblast benzeri ve epitel benzeri hücreler 15 hem de içeren bir kemik iliği biyopsisinden 1970 üretilmiştir. SH-SY5Y hücreleri 47 kromozom içeren stabil karyotipe sahiptir ve farklı RA kullanımı dahil olmak üzere, mekanizma, forbol esterler ve beyin-türevi gibi belirli nörotrofinlerin çeşitli aracılığıyla, olgun insanlara özgü nöronlar bir neuroblast benzeri durumundan ayırt edilebilir nörotrofik faktör (BDNF). Önceki kanıtlar, farklı yöntemlerin kullanılması gibi adrenerjik, kolinerjik ve dopaminerjik nöronlar 16,17 gibi belirli nöron alt tipleri için seçebileceğiniz düşündürmektedir. Bu ikinci yönü Nörobiyoloji deneyler bir çok yararlı SH-SY5Y hücreleri sağlar.

ontent "> Çeşitli çalışmalar onların farklılaşmamış ve farklılaştırılmış devletlerde SH-SY5Y hücreleri arasındaki önemli farklılıklar kaydetti. Zaman SH-SY5Y hücreleri farklılaşmamış, onlar hızla çoğalır ve çok az, kısa süreçleri, polarize olmayan gözükmektedir. Bunlar genellikle büyümek farklılaştırılmış olgunlaşmamış nöronların 18,19 göstergesidir kümeleri ve ekspres belirteçleri., bu hücrelerin uzun kollara ayrılmış işlemleri, çoğalma azalma uzanır, ve bazı durumlarda 2,18 polarize. farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri, daha önce bir ifade gösterilmiştir büyüme-ilişkili protein (GAP-43), nöronal çekirdekleri (Neun), sinaptofizin (SYN), sinaptik vezikül proteini II (SV2), nöron spesifik enolaz (NSE) ve mikrotübül ilişkili protein (MAP) dahil olgun nöronlar farklı belirteçlerin çeşitli 2,16,17,20, ve glial fibriller asidik protein (GFAP) 4 olarak glial markerlerin ifadesi için geçerli değildir. SH-SY5Y hücreleri huk ayırt fazla desteklemeknt homojen bir nöronal nüfus, BDNF kaldırılması hücresel apoptoz 4 sonuçlanır. Bu farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin hayatta kalma nöronlar olgun benzer trofik faktöre bağlı olduğunu göstermektedir.

Subclone 1978 3 yılında kurulmuştur beri SH-SY5Y hücrelerinin kullanımı artmıştır. Kullanımlarına bazı örnekler Parkinson hastalığı 17, Alzheimer hastalığı 21 ve poliovirüsün 22 enterovirüs 71 (EV71) gibi viral enfeksiyon patogenezi 23,24 soruşturma dahil , varicella-zoster virüsü (VZV), 1, insan sitomegalovirüs 25, ve herpes simpleks virüsü (HSV) 2,26. Özellikle neurovirology 27-36 alanında, SH-SY5Y hücreleri farklılaşmamış formunda bu hücreleri kullandık kullanarak bu çeşitli çalışmalar dikkat etmek önemlidir. ayırt SH-SY5Y hücrelerinin karşılık farklılaşmamış gözlenen fenotipin fark whe sorusunu gündeme getirmektedirTher enfeksiyon gözlenen ilerleme olgun farklılaştırılmış nöronlar farklı olurdu. Örneğin, farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri, HSV bağlanan ve farklılaşmamış SH-SY5Y hücrelerinin 2 giriş modüle yüzeyi reseptörlerinin olmaması olabilir farklılaşmamış, prolifere olan SH-SY5Y hücrelerinin karşı, HSV-1 alımı, daha yüksek bir verimliliğe sahiptir. In vitro nöronları test odaklı bir deney tasarımı, SH-SY5Y hücreleri in vivo modeller için çeviri ve karşılaştırma için en doğru sonuçlar elde etmek için farklılaştırılması gerektiğini bu nedenle önemlidir.

insan nöronal kültürlerin üretmek için güvenilir bir yöntem geliştirme araştırmacılar doğru insan sinir sistemini modellemek öteleme deneyler gerçekleştirmek için izin zorunludur. Burada sunulan protokol farklılaşmış insan nöronlar için zenginleştirmek için önceki yöntemlerden 1-4 türetilen en iyi uygulamaları delineates bir işlemdirretinoik asit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Genel Hususlar

  1. Gerekli reaktiflerin listesi için Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın. sıkı aseptik koşullarda tüm adımları uygulayın.
  2. FBS içeren tüm ortam preparasyonlar için ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (hiFBS) kullanın. Isı ile inaktive edilmesi için, her 10 dakikada bir ters çevrilerek 30 dakika için 56 ° C'de FBS, 50 ml'lik bir şişe sıcak (ayrıca Tablo 1 e bakınız).
    Not: FBS ısı inaktive edilmeden kullanıldığında, epitel benzeri fenotip SH-SY5Y hücrelerinin kültürleri içinde daha hızlı bir şekilde ilerler.
  3. Kullanımdan önce, ortam ısınmaya bırakılmış ve her adımda önce uygun bir pH dengesini oluşturmak için bir kuluçka makinesi içinde dengelenmeye gelmeye bırakın. Örnek olarak, ortam, 50 ml tam dengelenmeye yaklaşık bir saat sürer (pH 7, 37 ° C,% 5 CO2).
    Not: Bu protokol, tripsinize edilmiş ve yeniden kaplanacak kısmen farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri gerektiren iki aşamalı bir ayırma prosedürü kullanılır. Bu stresliBu son derece kırılgan hücreler için süreç. Nedenle, en az zaman miktarı için tripsin hücreleri inkübe etmek önemlidir. Bu hala çanak bağlı epitel benzeri hücreleri bırakarak nöronların tercihli bir hareket başlangıcı sağlayacaktır.
  4. yavaş yavaş hücreleri içeren konik tüp alt karşı ucu ile 10 ml plastik pipet ile farklılaşmış hücrelerin öğütme gerçekleştirin. yukarı ve aşağı hayır, yavaş hızda daha fazla beş kez öğütme gerçekleştirin.

SH-SY5Y Bakım Kültürlerin 2. Passage

  1. Hücreler% 70-80 birikime ulaşmış ve 10 ila 15 pasajlar aşmamaktadır bölünmüş bakım kültürleri. Kültürler, tipik olarak (varsayarak kültürler bölme sırasında 5 kat daha seyreltildi değildir) her 3-5 günde geçirilmiş olması gerekir.
  2. T-75 balonuna geçişin hücreleri, ardından PBS 1X yaklaşık 10 ml ile yıkayın, ortam aspire.
    Not: SH-SY5Y bakım kültürleri fu yarma önermiyoruz1'den rther: 5 Pasajlanması sırasında bu hücreler düşük confluency nedeniyle ölmesine neden olabilir, çünkü.
  3. PBS aspire ve daha sonra 2.5 ml% 0.05 tripsin-EDTA (1 x) ekleyin.
  4. inkübatör 2-3 dakika içinde inkübe ve balonun yüzeyindeki hücrelerin serbest bırakmak için yavaşça ucu.
  5. 10 ml temel büyüme ortamında ekleyin (bakınız Tablo 2) ve 1-2 kez Karışım.
  6. 1000 xg'de 2 dakika aşağı Spin, aspirat medya, daha sonra 5 ml Temel Büyüme Medya pelletini.
  7. T-75 balonuna normal kaplama için 20 ml'lik bir toplam hacim içinde 5 veya farklılaşması (Bölüm 5) saymak ve plaka: 1 ila 3: 1 hücreleri ile seyreltilir.

3. Dondurucu SH-SY5Y hücreleri

  1. % 5 (h / h) DMSO ile desteklenmiş temel büyüme ortamında SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinin erken pasajlar dondurun.
  2. Başlangıçta, 24 saat süre ile, -80 ° C'de alikot sonra dondurularak uzun süreli depolama için sıvı azot transfer.
    Not: Başvuru için konfluent (% 75-85), T-75 şişesi beş verecektirdondurma için SH-SY5Y hücrelerinin 1 ml'lik eş payları. Bu alikotları her biri toplam bir yerde 2-5 milyon hücre içermelidir.

4. Çözülme ve Kültür ayrım yapılmamış SH-SY5Y Nöroblastom Hücreleri

  1. Temel Büyüme Medya hazırlayın.
  2. Hızla bir 37 ° C su banyosu (yaklaşık 2 dakika) donmuş hücrelerini eritin.
  3. 15 ml konik bir tüp içinde 9 ml temel büyüme ortamında yeniden süspanse hücreleri ve daha sonra 1,000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüjlenir.
  4. Süpernatant aspire 10 ml Temel Büyüme Medya pelet hücreleri, ve yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri rahatsız etmemek için dikkatli olurken.
  5. T-25 balonuna veya 60 mm 2 tabağa plaka hücreleri.
  6. Ertesi gün, ölü hücreleri çıkarmak için ortamı değiştirin.

5. Gün: 0 Farklılaşma için Kaplama Hücreler

  1. Farklılaşma programı için Bkz: Şekil 1.
  2. 1x PBS, aspirat ile farklılaşmamış hücreler durulayın ve sonra 1-2 ml ısındı kullanarak trypsinize1x% 0.05 Tripsin-EDTA.
  3. Hücreler tripsin içinde olduğunda, bir kuluçka makinesi içinde, yaklaşık 3 dakika boyunca inkübe edin.
  4. , 10 ml Temel Büyüme Medya ekleyerek tripsin Quench şişeye ya da yemeğin kenarlarını durulayın ve nazikçe 1-3 kez çiğnemek. 15 ml konik tüp içeriği aktarın.
  5. pelet rahatsız etmemek için dikkatli olurken 1,000 xg'de 2 dakika süreyle santrifüj ve medya aspire.
  6. Süspanse 5 ml Temel Büyüme Medya pelet ve 1-3 kez çiğnemek.
  7. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak, sonra / ml 50,000 hücrelere Temel Büyüme Medya kullanarak sulandırmak.
  8. Plaka 2 çanak başına 100,000 hücre toplam 35 mm2 çanak başına hücre ml tekrar inkübatör içine yerleştirin.

6. Gün 1: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 1)

  1. Farklılaşma Ortam # 1 kısım 50 mi (bakınız Tablo 2) ve 37 ° C su banyosu içinde inkübe edilir.
  2. Ortam ısıtıldı olduğunda, (bir kuluçka makinesi içinde dengelenmeye 37 sağlar° C,% 5 CO2), en azından bir saat için, kullanımdan önce uygun bir pH dengesini kurmak.
  3. Retinoik Asit (RA) ekleyin hemen yemekleri medya eklemeden önce ısındı ve dengelenmiş medya (Tablo 1).
    Not: Retinoik asit ışığa duyarlı ve 4 ° C'de koyu renkli şişelerde muhafaza edilmelidir
  4. Yavaşça eski medya aspire ve atın.
  5. 35 mm 2 tabak başına RA 2 ml Farklılaşma Medya 1. ekleyin ve inkübatör dönmek.

7. Gün 3: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 1)

  1. Tekrarlama Bölüm 6 (1-5 adımlar)

8. Gün 5: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 1)

  1. Tekrarlama Bölüm 6 (1-5 adımlar)

9. Gün 7: Hücreleri Böl 1: 1

  1. RA ısındı ekle ve hemen yemekleri medyayı eklemeden önce Farklılaşma Medya 1. dengelenmiş.
  2. Yavaşça eski medya aspire ve atın.
  3. 200 ul ekle35 mm 2 tabak başına% 0.05 1x tripsin EDTA ısındı ve yaklaşık 2-3 dakika ya da hücrelere kadar gözle görülür bir mikroskop altında gözlenen olarak plaka kaldırılır inkübatör sıcak.
  4. 35 mm 2 tabak başına RA 2 ml Farklılaşma Medya 1. ekleyerek tripsin Quench ve plaka kapalı nöronal hücrelerin kalan durulama ortam kullanın. Daha sonra, 50 ml konik tüp içeriğini aktarın.
    Not: trypsinization aşamaları sırasında, aynı anda çok sayıda yemekleri trypsinize yok. Bu sitotoksik olabilir, nöronal kültürler için çok uzun tripsin inkübe değildir sağlamaya yardımcı olur.
  5. 50 ml konik tüp içinde 10 kadar yemekler birleştirin ve yavaşça yukarı ve en fazla beş kez aşağı 10 ml plastik pipet ile yavaş yavaş çiğnemek.
  6. Kısım 2 ml hücre taze 35 mm 2 kaplarına süspansiyon ve inkübatör dönmek.

10. 8. Gün: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 2)

  1. RA ekleyin (bkz <strong> Tablo 1) ısıtılır ve hemen yemekleri medyayı eklemeden önce medyayı dengelenmiş için.
  2. Yavaşça eski medya aspire ve atın.
  3. Yavaşça 2 ml farklılaşma medya # 2 (bakınız Tablo 2) ekleyin 35 mm 2 çanak ve inkübatör dönüş başına RA. izin verme nöronlar, hızlı bir şekilde kuru gibi uzun bir süre boyunca havaya maruz.

11. Gün 9: Ekstrasellüler Matrix (ECM) hazırlayın Kaplı Yemekleri

  1. buz üzerinde ECM çözümün bir şişe çözülme ve 1 sulandırmak: 100 soğuk DMEM içine.
  2. Her 35 mm 2 çanak içine karışımı 2 ml dağıtın ve yemeğin tüm baz kaplı olduğundan emin olun.
  3. Bir inkübatör içerisinde yer (37 ° C,% 5 CO2), 1 saat veya gece boyunca.
  4. Aspire karışımı ve başlıkta yaklaşık olarak 1 saat süre ile kurumaya bırakın. en fazla 2 ay boyunca oda sıcaklığında saklayınız.

12. Gün 10: Aktarım Hücreler üzerineECM ile kaplı levhalar 1: 1

  1. RA ekle hemen yemekleri medyayı eklemeden önce ısındı ve dengelenmiş medya (Tablo 1).
  2. Yavaşça medya aspire ve atın.
  3. Her 35 mm2 çanak tripsin ısıtıldı 200 ul ilave edin ve yaklaşık 1-2 dakika boyunca ya da nöronlar gözle mikroskop altında görüldüğü gibi, çanak kaldırılıncaya kadar oda sıcaklığında inkübe edin.
    Not: tripsin ile nöronların aşırı-inkübe ve hasara neden olmamak için oda sıcaklığında bu trypsinization adımı yürütün. Nöronlar bu aşamada epitel benzeri hücreler çok daha hızlı plakaları bırakın.
  4. 35 mm 2 tabak başına 2 ml Farklılaşma Medya 2. ekleyerek tripsin gidermek ve plaka kapalı nöronal hücrelerin kalan durulama ortam kullanın. Daha sonra, 50 ml konik tüp içeriğini aktarın.
  5. 50 ml konik tüp içinde 10 kadar yemekler birleştirin ve yavaşça yukarı ve sahip en fazla beş kez aşağı yavaşça çiğnemek10 ml'lik plastik pipet.
  6. ECM-kaplı 35 mm 2 yemekleri içine 2 ml hücre süspansiyonu koyun ve inkübatör dönmek.

13. Gün 11: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 3)

  1. RA ekle hemen yemekleri medyayı eklemeden önce ısındı ve dengelenmiş medya (Tablo 1).
  2. Yavaşça eski medya aspire ve atın.
  3. Yavaşça 35 mm 2 tabak başına RA 2 ml Farklılaşma Medya 3. (bakınız Tablo 2) ekleyin ve inkübatör dönmek. izin verme nöronlar uzun bir süre boyunca havaya maruz.

14. Gün 14: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 3)

  1. Tekrarlama Bölüm 13 (1-3 arasındaki adımları)

15. Gün 17: Son Medya Değişimi (Farklılaşma Medya # 3)

  1. Tekrarlama Bölüm 13 (1-3 arasındaki adımları)

16. Gün 18: Kullanıma Hazır Nöronal Kültürleri

  1. Taze Diff bir ortam3 günde RA, farklılık yaratmak Medya 3. nöron sağlığını korumak için.
    Hücreler nöronlar içine ayırt edilmelidir ve nöronal fenotip sergilerler Not:. Kültürler, terminal farklılaşma, aşağıdaki sonra 14 gün boyunca, tipik olarak stabil, nöron canlılığının Ancak süresi farklılaşma başlangıcında farklılaşmamış hücreler geçiş sayısına bağlıdır. Daha yüksek geçiş sayıları kısa kullanım ömrü ile farklı nöronların verim.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şu anda, bu tür olan optimum viral alımı 2 olarak farklılaşmamış SH-SY5Y hücreleri önemlisi, farklılaşmamış hücreler olmayabilir insan nöronlar 27-36 ve fenotipleri için fonksiyonel bir model olarak kullanılmakta olan nörobiyoloji ve neurovirology alanında birçok örnekleri vardır doğru yorumlanması için gerekli. In vitro nöronal sistem SH-SY5Y hücreleri kullanılarak ya da başka bir zaman, hücreler uygun bir şekilde, in vivo nöron meydana olabilir ne iyi bir şekilde temsil verileri elde etmek üzere, nöronlar ayrılır kritiktir. sonraki biyokimyasal ve görüntüleme için kullanılabilir 18 gün içinde son derece canlı, homojen, farklılaştırılmış nöronal kültürlerin yukarıdaki protokol verimleri, analiz eder. Farklılaşmamış SH-SY5Y nöroblastom hücreleri (Şekil 2A) dışarı doğru uzanan çok sayıda kısa süreçlerle büyük, düz epitel benzeri fenotip gösteren farklılaştırılmış hücrenin ises çevreleyen hücreler (Şekil 2B) bağlanmak birkaç nöritik projeksiyonlar sahiptirler. SH-SY5Y hücreleri ayırt, hücreler sadece nöronlar çanak serbest olmasını sağlamak için en az zaman uzunluğu için tripsin ile inkübe edilmesi önemlidir. Bu, aksi farklı nöronal hücre popülasyonu kontamine olur diferansiyasyon sergilemeyen epitelyal hücreleri bırakır. Tamamen farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin nöronal özellikleri gibi klasik nöronal belirteçlerin (Şekil 3) immünofloresan algılama gibi tekniklerle gösterilmiştir.

SH-SY5Y hücreleri farklılaşması sırasında farklı fenotip çeşitli göstermektedir ve stresli olanlar sağlıklı nöronlar tespit edebilmek için önemlidir. Farklılaşma 1. gün, Farklılaşma Medya 1. tanıtımı öncesinde, hücreler kısa, kalın süreçler (Şekil 4A) ile düz, geri çekilmiş fenotip var.Serum mahrumiyeti 5 gün sonra, SH-SY5Y hücreleri, daha uzun çıkıntılarla geliştirmek ve daha nöronal fenotipine (Şekil 4B) göstermektedir başlar. Pasaj SH-SY5Y hücreleri için sert bir işlemdir ve hemen gerçekleşen pasajlanmasını da takip eden günlerde hücreler sağlıksız görünür. Bu hücre gövdesi topaklanma ve daha az, daha kısa işlemler varlığı ile belirlenir. (Görüntülerin önce Bkz: Şekil 4C ve 4E ve görüntüler sonrası: Şekil 4D ve 4F). Yaklaşık 48 saat bölünmüş ardından, hücreler kurtarmak için görünür ve tam olgun, farklılaşmış nöronlar Gün 18 (Şekil 2B) elde edilir. Bu hücre gövdesi topaklanma azalma ve ince sayısız uzantısı kanıtladığı, sık sık komşu hücrelere bağlanmak nevrotik süreçleri dallı.

tekrarlanabilir ve canlı nöronal kültürlerin elde etmek önemlidir faktörler tripsin inkübasyon minimize ısı ile inaktive edilmiş FBS kullanılması yer alıyorZaman ve dikkatlice toz haline getirilerek. Önemli olarak, bu protokol, böylece hücrelerin bir seruma acıktırıldı duruma yumuşak bir geçiş oluşturmak hiFBS çeşitli konsantrasyonlarda, dört farklı medya formülasyonlann kullanımını göstermektedir. Olgun SH-SY5Y hücreleri sağlıklı olduklarında, çevredeki nöronların (Şekil 5A) bağlanmak sayısız projeksiyonlar göstermektedir. Farklılaşma sürecine (Şekil 5B) sırasında hatalı ise farklı bir epitel fenotipi nöron hücreleri geçeceği unutulmamalıdır. nöronlar ölmeye başlar, ayrıca, neurites geri çekilecektir, hücre gövdeleri bir araya gelme ve yuvarlak başlayacak ve nörit dejenerasyonu enkaz de ve hücre süreçleri etrafında birikir başlayacaktır. Şekil 5C, besin ve çevresel yoksunluk aşağıdaki hücre ölümü daha doğal bir ilerleme gösterir birlikte bu proses. Şekiller 5C ve 5D'de gösterilmiştir ne benzer olduğunuŞekil 5D 10 6 PFU bir enfeksiyon (MOI) bir HSV-1 suşu kos ile farklılaştınlan SH-SY5Y nöron 4 saat şu enfeksiyon gösterir. Bu protokol iyice aşağı analiz ve deney için gerekli olan nöron laboratuar ve verimleri tekrarlanabilir, homojen toplumlarda, optimize edilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1:. Farklılaşma prosedürünün Zaman Çizelgesi farklılaşma süreci 18 günlük süre boyunca yayılmış 11 adımdan oluşur. farklılaşma protokolü (gün 0) ilk gününde, 25.000 ila 100.000 hücre kaplanmamış 35 mm yemekleri üzerine kaplanmıştır. günler 1, 3 ve 5, eski ortam uzaklaştırılır ve farklılaşma medya 1. uygulanır. Farklılaşma Medya # 1 kaplanmamış 35mm yemekleri üzerine 1: 7. günde, hücreler 1 bölünür. 8. günde, ortam Farklılaşma değiştirilirMedya 2. ve 10. günde, hücreler tekrar 1 split: 1, ama Farklılaşma Medya 2. ECM-kaplı 35 mm yemekleri üzerine bu kez. gün 11, 14, ve 17, eski ortam uzaklaştırılır ve farklılaşma medya 3. uygulanır. günde 18, farklılaştırılmış nöronlar downstream uygulamalar için kullanıma hazırdır.

şekil 2
Şekil 2:. (B), farklılaştınlan SH-SY5Y nöron kapsamlı ve uzun nöritik çıkıntıları gösterir ise, farklılaşmamış ve farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin morfolojik görünüşü (A) ayrım SH-SY5Y hücreleri birkaç çıkıntıları olan düz fenotipi. Fotoğraflar bir ters mikroskop kullanılarak epifloresans 20X büyütme fazında elde edilmiştir.

Şekil 3,
Şekil 3:Belirteçleri nöronal farklılaşma. İmmünofloresan tamamen farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin nöronal özelliklerini aydınlatır. (A) anti-SMI31 (yeşil) nörit geniş bir ağ fosforile lifi H boyar. (B) Anti-map2 (kırmızı) nöronal soma ve neurites proksimal kısmını açığa mikrotübül ilişkili protein 2, etiketler. Her immünofloresan panel için ilgili faz görüntü sağda gösterilir. Fotoğraflar bir ters mikroskop kullanılarak epifloresans 10X büyütmede elde edilmiştir. Ölçek çubuğu, 100 mikron.

Şekil 4,
Şekil 4: farklılaşma protokolünün Intermediate adımlar farklılaşma (A) Gün 1.. Hücreler, kısa çıkıntılar ile geri çekilmiş bir fenotip korumak. (B) farklılaşma Gün 5. Hücreler, 5 gün maruz kalmışSerum yoksunluğunun s (Farklılaşma Medya # 1). hayatta kalan hücreler uzamış ve komşu hücrelerle bağlantı uzun süreçleri oluşmaya başlar. (C) bölünmüş önce farklılaşma Günlük 7. Hücreler bir epitel benzeri fenotip gösteren hücrelerin daha az sayıda, uzun süreçlerin yüksek sayıda göstermektedir. (D) gün farklılaşma 8, ilk geçit bir gün sonra. bölme sonra, hücre gövdeleri ve süreçleri kümeleri pasajlama prosedürünün bir sonucu olarak, kısa görünür oluşturur. (E) farklılaşma Gün 10, ECM ile kaplanmış plakalar üzerine bölünmüş önce. Hücreler yakın hücreleri ile bağlantıları yapmak daha uzun süreçleri göstermektedir. Hücre gövdesi kümeleme da belirgindir. (F) Gün farklılaşma 11, ikinci split aşağıdaki bir gün. Hücreler ikinci geçit takip stresli ve birçok nöronlar sonuçta kaybolur. Ancak, geri kalan nüfus, canlı homojen ve fenotip nöronal olduğunu. Hücre gövdeleri l üretmekArger kümeleri ve süreçler kümelerin tabanından yayarlar başlar.

Şekil 5,
Şekil 5:. Epitelyal aşırı çoğalma ve nöronal ölüm - farklılaşma sürecinin iki alternatif sonuçları (A) Sağlıklı, olgun SH-SY5Y nöronlar komşu hücrelere bağlanarak yaygın aksonal projeksiyonlar göstermektedir. Bazı durumlarda, (B), daha epitel benzeri fenotip ile hücrelerin bakım kültür geçeceği. epitel benzeri hücrelerin bu aşırı nüfus bakım kültürlerin nadir Pasajlanması nedeniyle olabilir. epitel benzeri hücreler nöronlar sayıca üstün devam edecek gibi bu kültürler, atılmalıdır. Oklar epitel benzeri hücreler belirtir. (C) Ne zaman SH-SY5Y hücreleri sağlıksız ve ölmeye başlar, enkaz önemli miktarda üreten, hücre gövdeleri yuvarlamak ve süreçler aşağılamak. (D 6 enfeksiyon çokluğu (MOI) herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) Kos soyu ile enfeksiyondan sonra 4 saat PFU.

Bileşen ayrıntılar Stok talimatlar
10 uM RA All-trans retinoik asit 5 mM 33.3 ml% 95 EtOH 50 mg RA süspanse. RA ısı, ışık, hava ve hassastır. 6 hafta boyunca 4 ° C'de koyu renkli bir şişede ve mağaza tutun. 1 kullan: 500 seyreltme ve kullanımdan hemen önce farklılaşma ortamı içine seyreltilmesi
(300,44 g / Mol)
1x B-27 B-27 Ek 50x -80 ° C de 1-10 mi şişe ve kısım kalan tek kullanımlık, 1 ml'lik porsiyonlar halinde ve mağaza çözülme. Mağaza 10 mi şişe -20 ° C 'de
20 mM KCI Potasyum klorür 1M 18.6 g KCI ve steril filtre 250 mi su ilave edilir. oda sıcaklığında saklayın
(74,55 g / Mol)
2 mM db-cAMP dibutiril siklik AMP 1M 2.04 ml su 1 g db-cAMP ekleyerek tam bir şişe tekrar süspansiyon. ışığa ve neme karşı duyarlıdır. ya da -20 ° C ya da 100 ul veya 200 ul'lik alikolar içinde mağaza -80 ° C
(491,37 g / Mol)
50 ng / ml BDNF Beyin türevli nörotropik faktör (BDNF) - Santrifüj flakon altına tozu almak için.60; 1 mi Neurobasal 10 ug şişeyi yeniden süspanse + 1 x B27 ya da 5 0.5 mi Neurobasal + 1 x B27 ug şişe 10 ug / ml elde etmek için. 200 seyreltme: 1 kullanmak. -80 ° C'de saklayın çalışma alikotları (ör: 250 ul)
hiFBS Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu - Kısım 50 ml konik tüpler içine FBS çözülmüş. 30 dakika boyunca bir su banyosu içinde 56 ° C'de ısıtın. Çıkarın ve -20 ° C'de çalışan alikotları dondurmak

Tablo 1: Stok çözümleri ve bileşenleri.

Temel Büyüme Medya
Bileşen 500 ml için hacim seyreltme
EMEM 415 mi ENEM
% 15 hiFBS 75 mi hiFBS
1x Pen / Strep 5 mi Pen / Strep 1: 100
2 mM Glutamin 5 ml glutamin 1: 100
* 6 hafta maksimum tutun
Farklılaşma Medya 1.
Bileşen 50 ml hacim seyreltme
EMEM 48 mi ENEM
% 2.5 hiFBS 1.3 mi hiFBS
1x Pen / Strep 500 ul Pen / Strep 1: 100
2 mM Glutamin 500 ul Glutamin 1: 100
10 uM RA 100 ul RA (5 mM stok) 1: 500
* 2 hafta maksimum tutun ve öncesinde hemen RA ekleyinkullanmak
* RA eklendikten sonra ekstra ortamı tutmayın - RA kararsız
Farklılaşma Medya 2.
Bileşen 50 ml hacim seyreltme
EMEM 49 mi ENEM
% 1 hiFBS 500 ul hiFBS
1x Pen / Strep 500 ul Pen / Strep 1: 100
2 mM Glutamin 500 ul Glutamin 1: 100
10 uM RA 100 ul RA (5 mM stok) 1: 500
* 2 hafta maksimum tutun ve eklemek RA kullanımdan hemen önce
* Ekstra ortamı tutmayınRA kararsız - CE RA ilave edilir
Farklılaşma Medya 3.
Bileşen 50 ml hacim seyreltme
Neurobasal 47 mL Neurobasal
1x B-27 1 ml B-27 (50X stok) 01:50
20 mM KCI 1 ml KCl (1M stok) 01:50
1x Pen / Strep 500 ul Pen / Strep 1: 100
2 mM GlutamaxI 500 ul GlutamaxI (100x stok) 1: 100
50 ng / ml BDNF 250 ul BDNF stok (10 mg / ml) 1: 200
2 mM siklik AMP (db-cAMP) dibutiril 100 ul db-cAMP (1M stok) 1: 500
10 uM RA 100 ul RA (5 mM stok) 1: 500
* 2 hafta maksimum tutun ve eklemek RA kullanımdan hemen önce
* RA eklendikten sonra ekstra ortamı tutmayın - RA kararsız

Tablo 2: Medya tarifleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yukarıdaki protokol homojen ve uygun bir insan nöronal kültürler meydana getirmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu protokol teknikleri ve her birinin en iyi uygulamaları tanımlamak için birkaç daha önce yayınlanmış yöntemler 1-4 ve amaçlarını entegre uygulamaları kullanır. SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşması kademeli serum yoksunluğu dayanır; retinoik asit, nörotrofik faktörler ve hücre dışı matris proteinlerinin eklenmesi; ve seri yarma farklılaşmış olgun yapışık nöronlar için seçin. Bu hücre hattı, yapışan ve asma hücre heterojen popülasyon olarak başlar. Bu protokol pasajlama veya medya değişiminden önce PBS yıkar stopaj hem nüfusu korumayı amaçlayan, ancak askıya bazı hücreler zarar ölü epitel hücrelerinin kaldırılmasına izin gereklidir. sunulan yöntem olup, ayrıca deney için ayırt edilen insan SH-SY5Y nöron bir homogenus popülasyonu verir.

othe olmasına rağmenr ajanlar kolinerjik ve adrenerjik fenotip 16,17 içine nöronların farklılaşmasını rehberlik için kullanılabilir, RA kullanımı SH-SY5Y hücreleri bir dopaminerjik fenotip 37,38 ile nöronların üretmek için daha önce kullanılan olmuştur ayırt etmek. RA eklenmesi sikline bağımlı kinaz (CDK) inhibitörleri p21 ve p27 Kip1 ve anti-apoptotik proteinler, bcl artan G0 / G1 üzerinden hücre döngüsü ilerlemesini durdurma dahil mekanizmalar, bir numara ile hücresel farklılaşmayı indüklediği gösterilmiştir 2 ve Bcl-xL, ve nörit gelişimi ve farklılaşması 39 önemli bir rol oynar PI3K / AKT aktivitesi artar.

SH-SY5Y hücreleri ani değişime çok hassas olarak bu protokolün yürütülmesi, nazik ve steril taşıma teknikleri kullanmak boyunca zorunlu bir durumdur. Çünkü kademeli serum yoksunluk protokolü med hızlı değişiklikler yapılmasını gerektirir protokolleri üzerinden tercih edilir, bu hassasiyeti olania kompozisyon. gün 7 ve 10 hücreleri yarma zaman, kısmen farklılaşmış nöronların tripsin geçirdikleri süreyi en aza indirmek için önemlidir. Bu zarar nöronların olasılığını azaltır ve ayırmak için daha uzun sürer epitel hücrelerinde karşı nöronların, tercihli serbest bırakılmasını teşvik etmektedir. Bu hücreler daha homojen bir nöronal nüfus oluşturulması ve çoğalan ve diferansiyasyon sergilemeyen epitelyal hücreleri ile kirlenmesini en aza indirmek için yardımcı olur. Süresiz olarak tutulması rutin olup değiştirilmelidir SH-SY5Y hücrelerinin kültür ve farklılaşması için kullanılan reaktifler dikkat etmek de önemlidir. Farklılaşma Medya sadece 2 hafta kadar tutulmalıdır Örneğin, Temel Büyüme Medya 6 haftaya kadar saklanabilir. Bu, dbcAMP ve BDNF olarak reaktifler taze ve istikrarlı olmasını sağlar. Buna ek olarak, yeni bir parti yapılmalıdır önce RA olduğunda, en fazla 6 hafta boyunca karanlıkta saklanmalıdır hazırlanabilir. Biz nöronal sonuçların fazla tutarlılık w gözlemledikBu önlemler i.

Hücreler olgun nöronlar ayrışmıştır edildikten sonra, onlar 2 hafta sonrası terminal farklılaşma için muhafaza ve deney için kullanılabilir. terminal farklılaşmasına ardından, medya her 3-4 days (Farklılaşma Medya # 3) değiştirilmelidir. farklılaşmış nöronların aksine, farklılaşmamış SH-SY5Y hücre kültürleri ihtiva eden bakım şişelerinden normal pasaj birçok hafta boyunca muhafaza edilebilir. Bunu engellemek için, düzenli kanalı bakım kültürleri için önemli aşırı nüfus artık nöronlara ayırt edebilen epitel benzeri hücrelerin. bu hücreler nöro-potansiyeline sahip olanlar sayıca üstün olduğunda, serum açlık hücre ölümü orantısız miktarda neden olur. Farklılaşmamış kültürler sadece yaklaşık 15 pasajlar kadar muhafaza edilebilir. kültür 15 pasajlar etrafında aştı sonra, farklılaşmamış hücreler ölmeye başlar ve bir kaba, sağlıksız bir görünüme sahip. Buna ek olarak, ayırıcıdaha az hücre her split hayatta yüksek geçit SH-SY5Y hücrelerinin sokan daha zordur ve bunu o genellikle daha sonraki analizler daha zor hale hücre gövdeleri ve aksonlar hem agrega.

Birçok hücre kaybolur veya bölme işlemi hayatta yok gibi farklılaşma sürecinde hücre sayısında belirgin bir azalma var. Bu nedenle, farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri kapsayan herhangi bir deneyin başlangıcında bir nöron% 30-40 kaybı ~ hesaba ve hücrelerin uygun bir sayısı, istenen verim elde etmek için başlangıç ​​plakalandı sağlamalıdır. 100.000 hücre kaplama sağlıklı, olgun SH-SY5Y nöron bol üretirken, daha az ya da daha çok sayıda başlangıçta deneysel ihtiyaca göre kaplama olabilir.

Tamamen farklılaşmış SH-SY5Y nöronlar göre daha in vivo bulundu olgun insan nöronlarının daha yakın bir sağlamak olduğu açıktır onların farklılaşmamış progenitör hücre muadilleri (Şekil 2). Bu nöronlar nörotopik virüslerdir çalışması için, bunların nörobiyolojinin gelecekteki karakterizasyonları için avantajlı bir örnek teşkil edecek ya da nöronlar kemoterapötik toksisite taranması için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B-27 ThermoFisher Scientific 17504-044 See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Sigma SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) Sigma D0627 See Table 1 for preparation
DMSO ATCC 4-X -
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) Sigma M5650 -
Fetal Bovine Serum (FBS)  Hyclone SH30071.03 See Table 1 for preparation
GlutamaxI Life Technologies 35050-061 -
Glutamine Hyclone SH30034.01 -
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-1 See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution Sigma E0282 See step 11 of the protocol
Neurobasal Life Technologies 21103-049 -
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Life Technologies 15140-122 -
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells ATCC CRL-2266 -
0.5% Trypsin + EDTA Life Technologies 15400-054 -
Falcon 35 mm TC dishes Falcon (A Corning Brand) 353001 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
  2. Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
  3. Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
  4. Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
  5. Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
  8. Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
  9. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  10. Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
  11. Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
  12. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
  13. Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
  14. Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  15. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  16. Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
  17. Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
  18. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).
  19. Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
  20. Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
  21. Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
  22. La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
  23. Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
  24. Xu, L. -J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
  25. Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
  26. Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
  27. Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
  28. Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
  29. Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
  30. Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
  31. Xu, K., Liu, X. -N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
  32. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
  33. Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
  34. Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
  35. Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
  36. Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
  37. Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
  38. Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
  39. Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 108 SH-SY5Y nöroblastom farklılaşma nörobiyoloji nöronlar enfeksiyon hücre kültürü
SH-SY5Y İnsan Nöroblastom Hücre Hattı Farklılaşma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shipley, M. M., Mangold, C. A.,… More

Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line. J. Vis. Exp. (108), e53193, doi:10.3791/53193 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter