Summary
Hier hebben wij een reproduceerbare werkwijze voor volwassenen neurogenese onderzocht onder toepassing van een assay neurosphere afgeleid van de gehele hersenen of van ofwel de telencephalic, tectal of cerebellaire gebieden van de volwassen hersenen zebravis. Daarnaast beschrijven we de procedure om genexpressie te manipuleren in zebravis neurosferen.
Introduction
Zoogdieren neurale stamcellen (NSC's) zijn gekarakteriseerd in vitro door hun vermogen te groeien in vrij zwevende clusters culturen van delende cellen genoemd neurosferen 1. In aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en fibroblast groeifactor (FGF), NSC splitsen hetzij symmetrisch zelf-vernieuwing NSC's genereren of asymmetrisch twee dochtercellen te genereren, bijv., Een differentiërende progenitor cel en een nieuwe NSC. Neurosfeerculturen derhalve een mengsel van neurale stam / voorlopercellen en gedifferentieerde neurale cellen NSCs 2-4 kan echter worden onderscheiden van andere celtypen neurosfeer door twee specifieke eigenschappen. Ze langdurig zelfvernieuwing weergegeven in vrij- zwevende culturen en ze kunnen differentiëren naar alle neurale cellijnen (dat wil zeggen, neuronen, astrocyten en oligodendrocyten) na intrekking van groeifactoren en extracellulaire matrix hechting aan substraten. in Mammals het neurosfeercultuur systeem als eerste in vitro systeem gebruikt om de aanwezigheid van NSC in de volwassen hersenen tonen en blijft de meest gebruikte middel om proliferatie, zelfvernieuwingscapaciteit en multipotent van neurale stamcellen en voorlopercellen te analyseren. Zelfs al bol vormende assays lijden aan een aantal nadelen en beperkingen 4 Dit kweeksysteem is waardevol voor het beoordelen van het potentieel van een cel te gedragen als een stamcel wanneer uit de in vivo niche 4 verwijderd en is behulpzaam geweest bij het identificeren sleutelregulatoren van NSC zelfvernieuwing en cel lot bepalen 5-7.
In tegenstelling tot zoogdieren die volwassenen neurogenese beperkt, zebravis constitutief produceren van nieuwe neuronen langs de gehele hersenen as gedurende hun leven. De zebravis volwassen hersenen toont meerdere neurogene nissen harboring neurale stam / progenitorcellen die zebravis een krachtige modelorganisme voor het begrijpen tHij stamcellen activiteit in de hersenen en de moleculaire programma vereist centrale zenuwstelsel regeneratie. In de afgelopen 17 jaar, verschillende onderzoeksgroepen ontwikkelde methoden voor het isoleren en kweken van de zebravis neurale cellen 8,9. Deze studies waren gericht op het produceren embryonale neuronale en gliale cellen in vitro, maar niet op het handhaven NSC en het onderzoeken van hun eigenschappen. Hoewel neurospheres hebben in de volwassen apteronotus leptorhynchus (Brown Ghost knifefish) 10 is gegenereerd, een neurosphere vormende test in de zebravis nog worden vastgesteld.
Hier beschrijven we een neurosfeer vormende bepaling om de rol van miR-107 tonen tijdens zebravis neurogenese 11. Het protocol stelt: 1) het verzamelen van de volwassen neurale stamcellen / voorlopercellen, hetzij van de zebravis hele hersenen of uit verschillende ontleed hersengebieden zoals de telencephalon, de Tectum, en het cerebellum; 2) het genereren van fldrijvende en zelf-vernieuwing van neurospheres van volwassen neurale stamcellen / voorlopercellen; 3) de down- en up-regulatie van de expressie van coderende genen of kleine niet-coderende RNAs 11 in neurosferen, zodat hun rol bij de proliferatie en differentiatie van neurale stamcellen / voorlopercellen te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebravis van de WT CF stam werden opgevoed en onderhouden volgens de protocollen die door de Yale University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC protocol nummer 2012-11.473) goedgekeurd. Alle experimenten moeten eerst worden goedgekeurd door alle relevante gouvernementele en institutionele ethiek regelgevende instanties met betrekking tot het gebruik van dieren voor onderzoeksdoeleinden.
1. Voorbereidingen
- Bereid 10 ml van dissectie medium, voeg 200 ul van 100x penicilline-streptomycine in 9,8 ml DMEM / F12.
- Bereid L-cysteïne-oplossing: 10 ml water voor weefselkweek, voeg 120 mg van L-cysteïne. Bewaar de L-cysteine oplossing bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken, of in porties bij -20 ° C tot 1 jaar.
- Bereid DNase I-oplossing: tot 1 ml water voor weefselkweek, voeg 10 mg DNase I. Bewaar de DNase I-oplossing bij 4 ° C gedurende maximaal 2 maanden.
- Bereid papaïne oplossing: om papaïne solut bereidenion, voeg 100 pl papaïne (ongeveer 140 eenheden), 100 gl DNase I (1%) en 200 ui L-cysteïne (12 mg / ml) in 5 ml DMEM / F12. Vers de voorbereiding van de papaïne oplossing elke keer en steriliseren met een 0,22 pm poriegrootte filter voor gebruik.
- Bereid wasoplossing: 100 ml wasoplossing bereiden, voeg 650 pl 45% glucose, 500 pl HEPES 1 M en 5 ml FBS in 93,85 ml DPBS 1x. Steriliseer de wasoplossing met een 0,22 um poriegrootte filter voor gebruik. Bewaar de wasoplossing bij 4 ° C gedurende maximaal 2 maanden.
- Bereid insulineoplossing: tot 2 ml insuline-oplossing te bereiden, voeg 25 ul druppel van 10 N NaOH en 100 mg insuline in 2 ml water voor weefselkweek.
- Bereid EGF en FGF oplossingen: Los zowel mitogenen in DMEM / F12 met 100 ug / ml concentratie. Store 10 gl aliquots bij -20 ° C.
- Bereid B-27 en N-2 media: store B-27 en N-2 supplementen bij -20 ° C als 500 pi en 1 ml aliquots, respectieely.
- Bereid Z-differentiatie toestand medium: 100 ml Z-differentiatie toestand medium te bereiden, voeg 40 ul insuline (50 mg / ml), 500 ui B-27, 1 ml N-2, 650 pi glucose 45% en 1 ml 100 x-penicilline streptomycine in 97,81 ml DMEM / F12. Steriliseer de Z-differentiatie toestand medium met een 0,22 pm poriegrootte filter voor gebruik. Bewaar de Z-differentiatie toestand medium bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week.
- Bereid Z conditioning medium: 50 ml Z conditioning media bereiden, voeg 10 ul van EGF en FGF 10 ui in 50 ml steriel Z-differentiatie toestand medium (20 ng / ml). Bewaar de Z-aandoening bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week.
- Bereid bekledingsoplossing differentiatie cultuur: voor 5 ml extracellulair bekledingsoplossing, voeg 100 ul van de extracellulaire matrix oplossing in 4,9 ml DMEM / F12 (bijvoorbeeld Matrigel.). Dooi extracellulaire matrix oplossing bij 4 ° C op ijs. Eenmaal ontdooid, houden bij 4 ° C voor up tot 2 weken.
2. Dissectie van de Adult zebravis Brain
- Bereid een dissectie bed door het invullen van een 100 mm x 15 mm petrischaal met gel ice packs. Plaats de deksel op de petrischaal en incuberen bij -20 ° C totdat de gel bevriest. Bovenop het deksel plaats een vierkant schoon filterpapier en wikkel zowel filterpapier en petrischaaltje met plastic folie.
- Schoon en steriliseer alle microdissectie instrumenten met 70% ethanol of warmte voor elk gebruik. Plaats alle gesteriliseerde dissectie instrumenten in de buurt van de microscoop ontleden en, vlak voor euthanasie, plaatst de dissectie bed onder de microscoop met optische vezel verlichting.
- Verzamel 2 volwassen zebravissen voor een hele brein neurosphere voorbereiding; en 3-4 zebravis neurosferen uit ontlede hersengebieden genereren.
- Euthanaseren volwassen zebravissen (8-12 maanden oud) met behulp van een protocol door de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd. Vervolgens dompel de vis in 75% ethanol gedurende 5-10 sec wordt snel in de dissectie bed gevolgd door onthoofding op het niveau van de kieuwen met een chirurgisch mes.
- Om dieren euthanaseren, toedienen van een overdosis (300 mg / L) van tricaïne methaansulfonaat tot hartslag van het dier geleidelijk vertraagt en de circulatie stopt, daarna onder te dompelen in ijswater.
- Draai het hoofd dorsale kant naar beneden, en het gebruik van de schaar maken een longitudinale gesneden uit de gesneden kant naar de mond. Behulp van de tang bloot de basis van de schedel en verwijder alle aangrenzend weefsel. Snijd de zijwanden van de schedel van het begin van het ruggenmerg naar de tectum.
- Met de schaar, schrappen en de optische zenuwen en verwijder beide zijden van de zijkant van de schedel ter hoogte van het tectum. Draai het hoofd ventrale kant naar boven. Met behulp van een tang, schil van de rest van de meest apicale deel van de schedel.
- Breng de hersenen samen met het overige gedeelte van de schedel in een nieuwe schaal with de dissectie medium (1.1). Reinig het hersenweefsel in de dissectie medium met behulp van plastic handvat van de micro mes, het houden van al hersenstructuren intact.
- Vanaf dit punt blijven het protocol met behulp van de hele hersenen zebravis.
- Als alternatief aan te passen dit protocol om specifieke gebieden van de hersenen te neurospheres uit volle zebravis hersenen of van het telencephalon, Tectum / diencephalon of kleine hersenen ontleed met een frisse scalpel te genereren. Gebruik een neuraal specifieke fluorescente zebravis neurale transgene lijn naar de hersenen regio van belang volgens ontleden figuur 3 en vindplaats 11.
3. Single Cell dissociatie van volwassen hersenen
- Voer alle latere werk in een biologisch veiligheidskabinet. Breng de hersenweefsel in een 1,5 ml buis die 800 pl dissectie medium (bereid in stap 1,1). Verwijder de dissectie medium door pipetteren, zonder hersenweefsel raken.
- Voeg 500 pl papaïne oplossing (stap 1,4) en verteren het hersenweefsel bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Niet broeden langer dan 15 min als het levensvatbaarheid van de cellen zou kunnen verminderen.
- Na incubatie dragen het hersenweefsel met 500 ul van de papaïne oplossing in een 15 ml conische buis met een 1000 pi pipetpunt een snede ~ 0,25 duim van de bodem. Voorzichtig distantiëren het hersenweefsel door langzaam en neer te pipetteren 10 keer met dezelfde tip. Pipetteer niet op en neer meer dan 15 keer en geen luchtbellen te genereren tijdens deze stap, omdat cellevensvatbaarheid kunnen veranderen.
- Incubeer het hersenweefsel opnieuw bij 37 ° C gedurende 10 min gevolgd door op en neer pipetteren 10-13 keer met een ongesneden 1000 pl normale tip. Niet pipet op en neer meer dan 15 keer, tot celdood te voorkomen.
- Stop de enzymatische digestie door het toevoegen van 2 ml wasoplossing (stap 1,5) en gecentrifugeerd celsuspensie bij 800 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). decanteren voorzichtig de supernatant en resuspendeer de pellet in de overblijvende oplossing door de buis krachtig met een vinger en tik vervolgens door op en neer pipetteren met een 1000 ui normale tip. Voeg vervolgens 2 ml wasoplossing.
- In dit stadium kijk onder de microscoop dat een enkele celsuspensie werd verkregen. Centrifugeer de celsuspensie opnieuw bij 800 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met behulp van 1 ml vers Z-conditie medium (stap 1.10).
- Stain cellen met behulp van trypan blauwe 12 en tel de levende cellen met behulp van een hemocytometer door het uitsluiten van blauwe dode cellen. Bereid een 24-putjes plaat met 200 pl celsuspensie en 300 ul vers Z conditioning medium in elk putje. Zaadcellen met een dichtheid van ~ 500 cellen / ul. Handhaven gekweekte cellen in een incubator bij 30 ° C in 5% CO 2, omdat zebravis hersenen afgeleide neurosferen niet goed groeien bij 37 ° C.
4. Generation of Primary Neurosferen </ P>
- Na 1 dag in vitro (DIV1), observeert de enkele celsuspensie verkregen uit volwassen gehele hersenen onder de microscoop en noteer of zich vuil in het midden van de put. Verwijder vuil voorzichtig pipetteren ongeveer 100 ul medium (minder indien mogelijk). Voeg vervolgens 100 ul van verse Z-conditie medium. Enkele cel schorsingen moeten worden genomen op dit moment (Figuur 2A div1).
- Na 2 dagen in vitro (div2), uitbreiding van de gekweekte cellen. Met behulp van een 1000 ui pipet met de punt knippen, te verzamelen en overdragen 250 ui celsuspensie uit elk putje in een nieuwe put. Voeg 250 ul van verse Z-conditie medium in ieder putje. Groeide zij de gekweekte cellen, de suspensie gehomogeniseerd door zachtjes en neer te pipetteren gedurende de put.
- Herhaal de stappen 4,1 en 4,2 voor de volgende 4 dagen in vitro (DiV4). Een geleidelijke verhoging van de grootte van neurospheres moet vilijk in het midden en de randen van de put op DIV3 en DiV4 (figuur 2B en C).
Opmerking: Primaire neurospheres kan worden verwerkt voor doorgang of differentiatie naar multipotent beoordelen. Als alternatief kunnen zij worden bewerkt voor nucleofection of lipo-transfectie 11 om de rol van specifieke genen te karakteriseren tijdens het differentiatieproces.
5. passage van de Primary Neurosferen
- Verwijder 250 pl weefselkweek uit elk putje en mechanisch distantiëren DiV4 neurospheres met een 1 ml pipet. Niet pipet op en neer te snel als luchtbel vorming celdood kan toegenomen.
- Tel de cellen met een hemocytometer en verdeel 800 cellen / ul in 250 ui primaire kweek supernatans in elk putje van een 24-wells plaat.
- Voeg 250 ul van Z conditioning medium aan elk putje.
- Na 2 dagen in vitro (div2), uitbreiding van de gekweekte cellen zoals gerapporteerd in stap 4.2 eend 4,3.
6. Differentiatie van Primary Neurosferen
- Steriliseren dekglaasjes door onderdompeling in 70% ethanol gedurende 10 minuten en droog dekglaasjes bij kamertemperatuur door ze in elk putje van een 12-wells plaat.
- Voeg 300 ul van extracellulaire bekledingsoplossing (stap 1.11) in het midden van het dekglas op zodanige wijze dat het op grote schaal kan expanderen en de gehele dekglas. Vervolgens incuberen bij 37 ° C gedurende 1 uur (met de bevochtigde celkweek incubator).
- Verwijder de extracellulaire bekledingsoplossing na incubatie, en droog het dekglas gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Verwijder 250 pl weefselkweek uit elk putje. Mechanisch dissociëren alle primaire neurosferen DiV4 per putje met 1 ml pipet (met bredere einde tip) door en neer te pipetteren.
- Zaad neurosfeer gedissocieerd celsuspensies bij een celdichtheid van 4 x 10 3 cellen / ml van eerder bereide extracellulaire matrix gecoate coverglasses (stap 6,1-6.3) en gedurende ten minste 30 min, bij 30 ° C in 5% CO2 totdat gehecht aan het substraat. Verwijder vervolgens het kweekmedium en snel 1 ml voorverwarmde verse Z-differentiatie toestand medium (stap 1,9) toe voor het kweken van de cellen gedurende 24 uur bij 30 ° C in 5% CO2.
- Elke twee dagen, de helft van de Z-differentiatie toestand medium vervangen tijdens de tijd van cel differentiatie.
7. Gene Manipulatie van Primary Neurosferen
- Verzamel DiV3-4 primaire neurosferen (stap 4,3) door centrifugeren gedurende 8 minuten bij 80 x g bij 4 ° C. Bereid je voor op liposoom transfectie van commerciële oligonucleoatides zoals previouly beschreven 11 of nucleo-transfectie van DNA-plasmidevectoren.
- Neurosfeer resuspendeer pellet bij een celdichtheid van 4 x 10 3 cellen / ul in 100 ui van een reactiemengsel (82 pi nucleofactor oplossing en 18 ui supplement).
- Meng de neurosphere ophanging,verder met 5 gl van het DNA plasmidevectoren keuze (plasmide voorraden aan 1 ug / ul). Breng de neurosphere / DNA mengsel in een Nucleofector cuvette voor nucleotransfection en selecteer Nucleofector programma volgens de instructies van de fabrikant, mits door de Nucleofector kit.
- Onmiddellijk na nucleofectie, voeg een volume van 500 ml voorverwarmde Z conditioning media (1,10) aan de cellen en de getransfecteerde plaat neurosferen voor het bestuderen van de celvernieuwing en / of differentiatie eigenschappen, zoals hierboven beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Algemene regeling van de Adult zebravis neurosfeercultuur
Hier beschrijven we alle stappen van het protocol van een neurosphere vormende test uitgevoerd vanaf de volwassen hersenen zebravis. Ten eerste hebben volwassen neurale stamcellen / voorlopercellen zijn verzameld hetzij uit zebravis gehele hersenen of uit verschillende ontlede hersengebieden zoals het telencephalon, het tectum en het cerebellum (Figuur 1 A-C). Enkele celsuspensie van volwassen neurale stamcellen / voorlopercellen zijn vervolgens gebruikt voor het genereren drijvende en zelfvernieuwende neurosferen (figuur 1D, E). Tenslotte hebben neurosferen gespeeld bij het bestuderen van de down- en up-regulatie van de expressie van coderende genen of kleine niet-coderende RNA's 11 zijn om hun rol bij de proliferatie en differentiatie van zebravis neurale stam / voorlopercellen te onderzoeken.
Zebravis primaire neurospheres kan self-vernieuwen na verscheidene passages. Om neurosferen te Passage 1 en 2 genereren stappen 5,1-5,4 werden tweemaal herhaald met een totaal van 6-8 dagen. DiV2-4 van de grootte van de neurosferen verhoogd tot ongeveer 50 urn in diameter. Secundaire en tertiaire neurosferen werden ook verkregen na Passage 1 en 2, respectievelijk (figuur 2D). Bij Passage 3, zebravis neurosferen waren echter niet in staat te groeien op het kritieke grootte van 50 urn diameter en niet om te hernieuwen, suggereert dat onze kweekomstandigheid plaats selecteert een pool van stam / progenitorcellen dan een zuivere populatie van neurale stamcellen 4 .
neurosphere Differentiatie
Primaire, secundaire of tertiaire neurospheres afgeleid van ofwel de groe hersenen of het telencephalic, cerebellaire en tectal gebied van volwassen zebravissen werden getest op hun differentiatie mogelijkheden. Tussen 1 en 3 dagen in vitro differentiatie omstandigheden (DiVd1-DiVd3), een monolaag van hechtende cellen werd waargenomen (Figuren 3A, B). Zoals geïllustreerd in figuur 3C, in DiVd4, axonale uitsteeksels en gliacellen waren zichtbaar en herkenbaar aan immunohistologische of genexpressie analyses 11, beoordelen dat neurale stamcellen / voorlopercellen waren gedifferentieerd. Evenzo neuronen en gliacellen opzichte van neurale stam / progenitorcellen geïsoleerd uit verschillende gebieden hersenen (figuur 3D, E).
Gene Expression Manipulatie in zebravis Neurosferen
We hebben de rol van miR-107 getest op de neuronale en gliale differentiatie van de hele hersenen zebravis-de rived neurale stam / progenitorcellen (figuur 4). We toonden aan dat de down-regulatie van miR-107 door anti-miR-107 had geen invloed neurosphere vorming maar veranderde neuronale differentiatie, zoals aangegeven door de abnormale groei van axonale processen (Figuren 4A, B). RT-PCR genexpressie analyses bevestigden dat remming van miR-107 leidt tot een verhoogde expressie van zowel de neuroblast marker Neurogenine-1 (Ngn-1) en axonen specifieke moleculen, zoals Map-2 en α-tubuline, zonder dat gliale celmarker expressie (S-100, GFAP, Olig2) (Figuur 4C). Dienovereenkomstig, de versterking van miR-107 expressie van miR-107-nabootser induceerde een daling van neuroblast- en axonen specifieke marker expressie (figuur 4D), de beoordeling van deze, in vitro, miR-107 werkt als een regulator neuronale differentiatie tijdens zebravis neurogenese 11.
/53617/53617fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schematische weergave van Protocol stappen De procedures en bijbehorende timing omvatten de ontleding van ofwel de gehele hersenen of het telencephalic, tectal en cerebellaire gebieden van de volwassen hersenen zebravis (A, B), het verkrijgen van een enkele celsuspensie (C ), het opwekken van drijvende neurosferen (D) en de differentiatie van neurosferen (E).
Figuur 2: Het vormen van de hersenen zebravis-afgeleide Neurosferen. (A - C) Representatieve fasecontrastbeelden van hele hersenen afgeleide primaire zwevende neurosferen waargenomen op dag 1 (Div1, A), dag 3 (DIV3, B) en dag 4 (DiV4, C). (D) Grafiek die het relatieve aantal neurospheres bij Passages 1 en 2 in vergelijking met het aantal neurosphere bij Passage 0. Na Passage 2, neurospheres formatie was drastisch afgenomen. Schaal bar: 25 pm.
. Figuur 3: Differentiatie van zebravis hersenen afgeleide Neurosferen (A - C, E) fasecontrastbeelden van hele hersenen afgeleide neurosferen gekweekt in de Z-differentiatiemedium in 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) en 4 (C en D, DiVd4) dagen. (E) Dorsaal uitzicht over de hele hersenen van een 12 maanden oude Tg (GFAP: DsRed) zebravis. De telencephalon (tel), Tectum (Tec) en het cerebellum (CER) werden ontleed en verzameld, zoals getoond. (D) Foto's van DiVd4 neurospheres afgeleid van het Tectum, telencephalon en het cerebellum bij Passage 0 (P0), 1 (P1) En 2 (P2). Schaal bar: 25 pm.
Figuur 4:. Analyse van Neurosferen Gevormd volgende MiR107 Manipulatie (A) Fase contrast beelden die Div4d neurospheres behandeld Div4 met de aangegeven oligonucleotiden. Zwarte dozen in de top panelen geven het gebied vergroot in de onderste panelen. (B) Bovenste grafiek vertegenwoordigt de kwantificering van het aantal neurosferen gevormd met of zonder miR107. Neurosferen worden subgrouped door hun grootte (20-30 pm, 31-50 pm,> 51 pm in diameter). Bottom grafiek geeft de kwantificering van de axonale projecties van neurospheres behandeld en sub gegroepeerd als hierboven. (C, D) qRT-PCR expressie analyse van genen aangeduid door Div4d neurosferen eerder met oligonucleotiden aangeduid op Div4. Gegevens stellen hetgemiddelde ± SEM, * p <0,05, n = 3. Scr: scramble. Schaal bar: 25 pm.
| Probleem | mogelijke oorzaak | Oplossing |
| Terugvordering van te veel dode cellen | Tijd vertraging bij de voorbereiding van de hersenen vóór enzymatische behandeling | Zorg ervoor dat de dissectie opgezet en media zijn klaar voor het opofferen van de vis (ook controleren steriliteit, temperatuur) |
| Strenge papaïne behandeling | Mechanische dissociatie moet gevoelig genoeg om een live enkele celsuspensie te genereren, maar sterk genoeg om te voorkomen dat te veel achter klonten weefsel zijn. Respecteer de aanbevolen tijden en temperaturen voor broederijen / centrifugeren perioden | |
| Neurospheres niet verschijnen of te laten groeien slecht | onjuiste temperatuur | Controleer of incubator ingesteld op 30 ° C levert het correct temperatuur. |
| Groeiende bollen verwijderd met puin | Voor elk putje, aspiratie van afval moet goed worden uitgevoerd bovenop het medium. Vermijd het aangaan van het medium met je pipet | |
| De integriteit van sommige reagentia (B27 supplement, EGF, FGF) is verzwakt | Deze integriteit vormt beperkende factoren bij de celgroei. Controleer batchnummer, en de manier waarop de monsters werden bewaard. Vermijd dooi / opnieuw invriezen cycli van elke bemonsterde reagens dat wordt gebruikt in de cultuur | |
| Aanwezigheid van enkele cellen | Wijze van overdracht / uitbreiding van neurospheres is te hard | Deze stap is een uitbreiding / verdunningsstap omdat teveel bolletjes worden gevormd in de put. Vermijd zware bol collectie tijdens transfer naar neurosphere dissociatie in enkele cellen te voorkomen |
| Aangezien cellen op Matrigel | Matrigel was niet goed ontdooid / verdund | Matrigel van -20 ° C heeft ten minste 30 minuten bij 4 ° C te ontdooien en blijft viskeuze Pipet voorzichtig |
| Geen hechting op matrigel | Het volume van celsuspensie moet klein genoeg zijn om cellen depositie op Matrigel laag mogelijk zijn | |
| Meer tijd voor cellulaire depositie (tot 2 uur als grotere hoeveelheden worden gebruikt) | ||
| Verse differentiatie medium te koud | Vervang de cel gehecht medium, het differentiatiemedium moet worden opgewarmd tot 30 ° C om thermische schokken te voorkomen op de cellen neergeslagen | |
| slechte nucleofectie | dode cellen | Zorg ervoor dat u geen luchtbellen te genereren tijdens het uitvoeren van nucleofectie. Gebruik van hoge kwaliteit DNA-vectoren door het gebruik van Maxi-preparaten. Minstens 1-2 uur na nucleofectie vervangen kweekmedium met behulp van verse Z-differentiatie toestand medium of Z-conditie medium. |
| Weinige positieve neurospheres | Neurospheres van verschillende groottes kan leiden tot slechte nucleofectie. Met behulp van neurospheres bij div2 en DIV3 zijn ideaal voor nucleofectie. Dichtheid van de cellen mag niet meer dan 4 x 10 3 neurospheres ml -1 in een 100 ml reactie. |
Tabel 1: Problemen oplossen Advies Listing, voor elke stap van het protocol, de mogelijke problemen en de oplossingen om ze te overwinnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hoofddoel van dit protocol het isoleren en kweken volwassen zebravissen hersenen afgeleide neurosferen voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire kenmerken van neurale stam / voorlopercellen. Hier melden wij hoe multipotente neurale cellen te selecteren en het genereren van de drie neurale celtypes, dat wil zeggen, astrocyten, neuronen en oligodendrocyten, van de volwassen hersenen zebravis. Het protocol is zeer belangrijk omdat een reproduceerbare neurosfeer vormende assay was niet in de zebravis vastgesteld dusver.
Een paar kritische stappen in het protocol moeten worden gerespecteerd en zijn recapitutaled in het advies het oplossen van problemen (tabel 1). Ten eerste, celdood optreedt zowel tijdens de dissectie van de volwassen hersenen zebravis en de enkele celsuspensie procedure. Te beperken de mate van celdood, is het essentieel om schoon en andere scherpe voorwerpen alsmede strikt aan de timing en incubatietemperatuur aanbevolen in de onderhavige proprotocol. Ten tweede moet neurosfeercultuur worden uitgevoerd met vers bereide media en een zorgvuldige pipetteertechniek. Ten derde, aanbevelingen celdichtheid moet worden gevolgd om betrouwbare vernieuwing of differentiatie van neurosphere cellen te verkrijgen. Met dit in het achterhoofd, zou iemand bekwaam in celcultuur technieken in staat zijn om het protocol te gebruiken en uit te voeren de isolatie, de cultuur en genmanipulatie van volwassen zebravis hersenen afgeleide neurosferen.
De bol vormende assays in de zebravis lijdt aan dezelfde beperkingen eerder in zoogdiersoorten 4: 1) het gedrag van neurale stam / voorlopercellen wordt veranderd na hun cellen uit hun natuurlijke hersenen niche; 2) neurosferen geen homogene populatie van stamcellen, maar omvatten stamcellen, progenitorcellen en post-mitotische gedifferentieerde cellen. Het is bovendien opgemerkt dat ons protocol genereert aclonal neurosfeerculturen. De celdichtheid van cultureneen kritische parameter in-gebied vormende assays omdat het bepaalt clonaliteit, dat wil zeggen, of de cultuur is klonale, semi-klonen of aclonal. Klonale omstandigheden het toelaten om nauwkeurig te karakteriseren en kwantificeren van de verschillende zwembaden van stamcellen en voorlopercellen cellen aanwezig in de cultuur. We zijn niet in staat om mobiele clonaliteit assays uit te voeren tot nu toe en onze kweekomstandigheden meer optimalisatie moeten nog voordat we neurale stamcellen kunnen onderscheiden van andere voorlopercellen cel zwembaden.
Zebravis neurosfeerculturen kan worden gebruikt voor een groot aantal experimenten. Ze laten genexpressie analyse en manipulatie van genexpressie tijdens neurogenese zoals blijkt uit onze studie naar miR-107 functie in de weefselspecifieke bepaling van neurale lot van de cel (figuur 4 en 11). Bijkomende toepassingen omvatten genoom bewerken strategieën, zoals CRISPR / Cas9 systeem, teneinde de rol van neurale stam / voorlopercellen genen in neuroge testenNesis en de hersenen reparatie 13. Tenslotte maken protocol duidelijk dat zebravis neurosferen worden afgeleid van verschillende hersengebieden opent de mogelijkheid regiospecifieke kenmerken van neuronen en gliacellen te bestuderen en om de cellulaire en moleculaire basis van neurale cellen heterogeniteit verkennen in verschillende ventriculaire gebieden van de hersenen zebravis 14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS 1x | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1x | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1 M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
- Winter, M., et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).
- Gage, F. H.
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).
- Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539 (2013).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Ristori, E., et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell. 32, 546-560 (2015).
- Louis, S. K., SIegel, A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio. 740, (2011).
- Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J.
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
