Summary
Qui ci avvaliamo di una metodologia per monitorare FISH LINE-1 retrotrasposizione a livello di nuclei singolo degli spread dei cromosomi di linee cellulari HepG2 esprimono stabilmente sintetica LINE-1.
Introduction
Umana Lungo intersperse nucleare Element-1 (Linea-1 o L1) è un elemento mobili ed autonome che si propaga all'interno del genoma attraverso un "copia e incolla" meccanismo di retrotrasposizione. Un tipico L1 umano è lunga ~ 6 kb e consiste di un 5'UTR (Regione Untranslated) che serve come un promotore, due telai di lettura aperti (ORF): L1 -ORF1 e L1 -ORF2, e un 3'UTR con polyA . coda L1 proteina -ORF1 ha tre ambiti distinti: un dominio della bobina a bobina, RNA riconoscimento Motif e dominio C-terminale, mentre la proteina L1 -ORF2 ha endonucleasi, trascrittasi inversa e cisteina domini ricchi 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 presenta attività chaperone acidi nucleici, mentre L1 -ORF2 fornisce attività enzimatiche, con entrambe le proteine necessarie per la retrotrasposizione 1,2,6.
Un ciclo di L1 retrotransposition inizia con la trascrizione dal 5'UTR di L1 L1 -ORF1 mostre sia -Binding cis dove si confeziona il proprio RNA o -Binding trans dove confeziona altri RNA (vale a dire, seno / SVAS / pseudogeni) per formare una particella ribonucleoproteina (RNP) con L1 -ORF2p 7, 8. RNP traslocano nel nucleo dove l'attività endonucleasi di L1 -ORF2p nick DNA genomico (gDNA) per esporre un OH - gruppo 9, che è a sua volta utilizzato per la trascrittasi inversa per innescare e invertire RNA sintetizzare il DNA dalla fine del 3 '. Durante la sintesi inverso, il secondo filamento di DNA viene scalfito 7-20 bp dal sito originale nick per creare interruzioni sfalsati che sono riempiti per formare le firme sequenza di inserzione L1 (per esempio, TTTTAA) chiamati duplicazioni del sito di destinazione (TSD) 9,10. Questo processo è noto come primo obiettivo trascrizione inversa (TPRT) e porta a Insertisu di copie complete o tronco di L1 / altri DNA con TSDS a entrambe le estremità della sequenza inserita. L1 retrotrasposizione ha anche dimostrato di essere mediata attraverso TPRT come non omologa end-joining in alcuni tipi di cellule 11.
Il vettore L1 retrotransposition impiegato nei nostri studi è non-episomiale e consiste contrassegnati L1 -ORF1 e 2p guidata da promotori CMV-L1-5'UTR combinate (Figura 1) 12. Le versioni precedenti di questo costrutto sono stati descritti in studi utilizzando lievito e colture di cellule umane 13,14,15. Due promotori CMV distinti situati al 5 'e 3' estremità del vettore, con estremità 3 'collocato in orientamento inverso per guidare l'espressione di neomicina dopo splicing e integrazione. L'indicatore retrotransposition cassette all'estremità 3 'è costituito da un neomicina gene inserito antisenso per L1 -ORFs e reso inattivo mediante separazione in due metà da una globin introni con donatore impiombato (SD) e siti accettore impiombato (SA) (Figura 1). Dopo integrazione in un cromosoma, L1 è trascritto dal promotore comune per produrre un mRNA che consiste di un mRNA bicistronico e inattiva mRNA neomicina. Durante l'elaborazione RNA, l'introne globina è impiombato dal gene neomicina per ripristinare un gene neomicina completamente funzionale. L'mRNA ibrido è confezionato in un RNP in cis e traslocato nel nucleo dove è integrato nel genoma sia come lunghezza totale o troncate inserimenti utilizzando TPRT.
Qui si descrive un metodo che utilizza ibridazione in situ fluorescente (FISH) con sonde specificamente dirette al gene neomicina impiombato (Sneo) per monitorare i modelli -retrotransposiition L1 e tassi di inserimento a livello di nucleo singolo. L'efficienza e la specificità di rilevazione è stata confermata usando retrotrasposizione competente e costrutti incompetenti e sonde per detect Sneo o la neomicina e globina giunzione introne 16. Questa metodologia rappresenta per alcune delle carenze di analisi retrotrasposizione a base di coltura cellulare, ad esempio più inserimenti, resistenza colonia e l'espansione del clone favorevole.
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Protocol
NOTA: Tutte le fasi deve essere effettuata a temperatura ambiente a meno che diversamente specificato. Si prega di fare riferimento alla sezione Reagenti per i dettagli su come preparare i singoli reagenti.
1. Etichettatura L1 Sonde
NOTA: Le sonde possono essere etichettati, mediante l'etichettatura chimica o PCR.
- etichettatura chimica
- Rendere 0,7-1% gel di agarosio in tampone Tris-acetato-EDTA (TAE), il calore in un forno a microonde fino a fuso, permettono il gel raffreddare, quindi aggiungere etidio bromuro (0,5 mg / ml). Versare in vassoio gel, aggiungere pettini e consentire il gel solidificare a temperatura ambiente.
- Etichettare la sonda Sneo (1-2 mg) con CY3 o FITC a 37 ° C per 1 ora secondo il protocollo del produttore.
NOTA: Sneo indica la S pliced gene mycin Neo espresso dopo un ciclo completo di retrotrasposizione. La sonda è ~ 1000 bp in termini di dimensioni. Sneo può essere PCR amplificato da qualsiasi vettore o da genomic DNA. Vedi tabella dei materiali e reagenti per informazioni su streptavidina-CY3 / FITC reagenti di etichettatura. - Mescolare la soluzione della sonda Sneo etichettato con il tampone 1x DNA di carico, carico in ciascun pozzetto e correre a 75-100 volt per 15-20 minuti.
- Visualizza la banda sonda con una viola Ultra-(UV) Illuminatore. Si noti che le dimensioni della sonda Sneo può essere regolato e che serratura nuclei acido (LNA) può anche essere aggiunto (Figura 2).
- Cut etichettato sonda Sneo dal gel con una lama pulita, solubilizzare e purificare la sonda Sneo dal gel utilizzando un kit PCR Clean-Up secondo il protocollo del produttore.
ATTENZIONE: coprire ogni parte esposta del corpo con schermi di protezione (ad esempio, camici da laboratorio e UV chiaro maschera) durante la visualizzazione e il taglio del gel. Vedere la Tabella di materiali e reagenti per le informazioni di gel purificare prodotti di PCR. - Re-run 5 pl di Sneo etichettati sonda con una sonda Sneo non-marcato su un gel di agarosio 0,7% (vedi 1.1.1) per Conaumento dimensione aziendale e perdita di intensità del segnale (figura 2).
- Quantificare la quantità di sonda Sneo etichettato misurando l'assorbanza a 260 nm e diluire la sonda Sneo a 10 ng / aliquote microlitri di nucleasi libero H 2 O. aliquote conservare a -20 ° C.
- PCR Labeling (metodo alternativo per l'etichettatura sonda)
- Combinare primer specifici Sneo (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'e 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') con PCR reagenti in un unico tubo: 13,6 ml nucleasi libero H 2 O; 0,1 microlitri dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 ml dTTP (10 nM); 0.05 ml dUTP-biotina / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ml Vai Tag 5x tampone; 0,4 ml Vai Tag polimerasi; 1 ml modello Sneo (10 ng). Vedere la Tabella dei materiali e reagenti per informazioni sui reagenti PCR.
- Regolare la quantità di ciascun reagente moltiplicando per il numero totale di campioni.
- Utilizzare il seguente parametro ciclismo PCRs per amplificare ed etichette Sneo sonde: 95 ° C per 2 min; 35 cicli di 95 ° C per 30 sec, 62 ° C per 30 sec, 72 ° C per 60 sec; 72 ° C per 2 min; Tenere a 4 ° C a tempo indeterminato.
NOTA: La temperatura di ricottura può essere regolato o gradiente di PCR può essere completata per determinare temperature di ricottura ottimali per altre sonde. - Fare gel 0,7-1% come nella sezione 1.1.1, carico e visualizzare la band sonda come nella sezione 1.1.4.
- Tagliare e purificare la sonda Sneo etichettato come nella sezione 1.1.5.
- Re-run 5 pl di Sneo etichettati sonda con Sneo sonda di un marcato aumento di confermare le dimensioni e la perdita di intensità del segnale (vedi figura 2).
- Quantificare la quantità di sonda Sneo etichettati da assorbanza misurando a 260 nm e diluire la sonda Sneo a 10 ng / aliquote microlitri di nucleasi libero H 2 O.
2. Preparazione spread cromosomiche
- Generare cloni stabili che esprimono vettore backbone (Control) o retrotransposition L1 competente utilizzando metodologie di selezione standard. 12,16 Mentre reporter non episomiale stati usati per correlare risultati con studi di trascrizione, potrebbero anche essere utilizzati vettori episomiale. Crescere cellule che esprimono stabilmente il controllo o L1 vettore (1 x 10 6 cellule per 10 cm piastra, con regolazioni in formato piatto fatte in base alle esigenze) in terreni di crescita completa. Per le cellule HepG2, utilizzare RPMI-1600, 10% FBS e 200 ug / ml di igromicina. Grow culture al 70% di confluenza a 37 ° C e 5% CO 2.
NOTA: La scelta del mezzo di crescita dipende dal tipo di cellula. Dato che i plasmidi usati qui portano cassette di selezione sia per igromicina e neomicina, la selezione dei cloni stabili potrebbe essere fatto anche con neomicina dopo scelta su igromicina, ma la quantità di neomicina deve essere ottimizzato per stabilire livelli di tolleranza per ciascun tipo di cellula. - Aggiungere Colcemid (0,4 mg / ml) per mezzo di coltura e incubare per 90 minuti per arrestare le cellule al Metase. Se utilizzando diversi tipi cellulari, determinare la concentrazione ottimale di Colcemid e del tempo di esposizione (60, 90, e 120 min) per metafase arresto ottimale empiricamente.
- Lavare le cellule 2x con 10 ml di PBS 1x Dulbecco (DPBS), trypsinize aggiungendo 3-5 ml di 0,25% tripsina soluzione alle cellule e incubare per 5 minuti per staccare le cellule. Inattivare la tripsina con una pari quantità di supporti contenenti il 10% FBS.
- Centrifugare le cellule per 2 min a 1000 xga 4 ° C, aspirare il terreno dal pellet cellulare e lavare le cellule con DPBS. Aspirare tutti DPBS, lasciando 200 ml di DPBS per risospendere le cellule. Assicurarsi che le cellule sono mescolate bene e che tutti i grumi sono disperse. Utilizzare sfarfallio o delicato pipettaggio di mescolare e disperdere grumi ed evitare vortex.
- Aggiungere 5 ml di soluzione ipotonica (cioè, 75 mM KCl) che è pre-riscaldato a 37 ° C e goccia a goccia durante la rotazione del tubo 15 ml orizzontale e incubare a 37 ° C per 20 min. Vedere la Tabella dei materiali e Reagents per informazioni su come ottenere e rendere soluzione ipotonica.
- cellule centrifugare a 120 xg per 5 minuti a 4 ° C e ripetere i passaggi 2,4-2,5 3x lasciando circa 200 ml di soluzione ipotonica per risospendere le cellule dopo ogni lavaggio. Assicurarsi che al termine dei 3 lavaggi, il pellet è visibilmente bianca e gonfia.
- Risospendere il pellet in 200 ml di soluzione di Carnoy fissativo e fare 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 diluizioni in soluzione Carnoy fissativo. Goccia 10 ml di ciascuna diluizione su un vetrino pulito e asciutto da circa 1 cm sopra ed esporre immediatamente il lato libero-diffusione di vapore caldo da acqua bollente per 30 sec. Vedi tabella dei materiali e reagenti per le informazioni su come fare soluzione Carnoy fissativo.
- Asciugare gli spread a temperatura ambiente, macchia con 0,1 mg / ml Hoechst-33342 per immersione per 15-20 minuti in Coplin vaso e lavare 3x con DPBS. Vedi tabella dei materiali e reagenti per informazioni su come rendere la soluzione Hoechst-33342. <li> Visualizza estende su microscopio a fluorescenza / contrasto di fase a 40X di ingrandimento. Dopo l'ottimizzazione preparazione diffusione, spread non devono essere colorati con Hoechst-33342. Vedi estende su microscopio a contrasto di fase a 10X di ingrandimento per determinare la qualità diffusione e la separazione come indicato nella sezione Risultati (vedi figura 3).
- Selezionare e cerchio buone spread con Diamond Point Marker sul lato opposto della slitta (cioè, si sviluppa senza side).
- Conservare diffonde a -20 ° C per un massimo di un mese. Evitare l'esposizione all'umidità.
3. ibridazione in situ fluorescente (FISH)
- Stabilizzazione e disidratazione spread
NOTA: Equilibrare metafase cromosoma si diffonde a temperatura ambiente, se conservati a -20 ° C. Vedi tabella dei materiali e reagenti per informazioni su come ottenere e fare reagenti.- Incubare metafase cromosoma si diffonde con 200 microlitri RNasi A per1 ora a 37 ° C.
- Lavare i vetrini in tampone 2x-SSC due volte per 5 minuti ciascuno seguito da risciacquo con 10 mM soluzione HCl.
- Incubare spread con 1% di pepsina per 10 minuti a 37 ° C, lavare con H 2 O deionizzata e lavare due volte con tampone 2x-SSC per 5 minuti ciascuna.
- Incubare spread con 4% paraformaldeide per 10 minuti e lavare in tampone SSC 2x due volte per 5 minuti ciascuno.
- Disidratare diffondere incubando per 2 min in serie etanolo: 70%, 80% e 95% di etanolo.
- diapositive asciugare all'aria.
- Ibridazione diffonde con L1 sonde -labeled retrotrasposizione (cioè, Sneo)
ATTENZIONE: Per le sonde dirette marcato, tenere lontano dalla luce in ogni momento. Vedi tabella dei materiali e reagenti per informazioni su come ottenere e fare reagenti.- Aggiungere 30 ng di Sneo al tampone di ibridazione, di calore a 72 ° C per 10 minuti e raffreddare per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 30 ml di soluzione della sonda Sneo all'each diffusione, coprire con coprioggetto e sigillare i bordi con mastice. Garantire l'assenza di formazione di bolle.
- Riscaldare il vetrino a 72 ° C per 5 min su un blocco di calore, gradualmente scendere la temperatura a 37 ° C, e incubare durante la notte in una camera umidificata al buio a 37 ° C.
- Lavaggio e visualizzazione (o l'aggiunta di anticorpo secondario)
ATTENZIONE: Per le sonde dirette marcato, tenere lontano dalla luce in ogni momento.
NOTA: vedere tabella dei materiali e reagenti per informazioni su come preparare. Si consiglia l'uso di un volume sufficiente a coprire l'intero cromosoma diffusione. Si ricorda che il volume in eccesso sarà perso quando si aggiunge vetrino.- Immergere i vetrini in tampone SSC 2x per rimuovere coprioggetto.
- Lavare i vetrini per immersione in tampone 2x-SSC a 45 ° C per 5 min.
- Lavare i vetrini per immersione in tampone di lavaggio a 45 ° C per 5 min, 2x.
- Lavare i vetrini per immersione in tampone SSC 0,1x a 45 ° C per 10 min.
- Lavare i vetrini per immersione in 2x SSC tampone a 45 ° C per 10 min.
NOTA: Posizionare una vaschetta Coplin contenente tampone raccomandato in un bagno d'acqua, regolare la temperatura a 45 ° C. - scivoli raffreddare a temperatura ambiente ed equilibrare i vetrini in tampone di rilevamento.
- Per le sonde marcate diretti, passare al punto 3.4.10.
- Per le sonde marcate indiretti, blocco nel tampone di bloccaggio per 20-30 min e lavare 3 volte in DPBS.
- Incubare con 50 ml di anticorpo secondario (ad esempio, 5 mg / ml di streptavidina-FITC, o αCY3 in tampone di bloccaggio) per 1 ora.
- Lavare i vetrini in 2x SSC per 5 minuti due volte.
- Controcolorare con Hoechst 33342-soluzione (0,1 mg / ml) per 10 min.
NOTA: questa colorazione viene fatto per macchiare cromosomi di co-localizzazione con sonda. - Lavare in DPBS 3x, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio, inserire un vetrino e sigillare i bordi con smalto.
- Analizzare L1 retrotrasposizione utilizzando microscopio a fluorescenza a 40X magnification.
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Representative Results
Un diagramma schematico del vettore retrotrasposizione L1 è presentato in Figura 1. Il vettore costituito da un gene neomicina in orientamento antisenso per L1 ORF che è interrotta da un introne globina in orientamento senso e intramezzato da SD e siti SA. Quando stabilmente integrato in un cromosoma, L1 mRNA è trascritto dal combinato CMV e promotore L1-5'UTR (Figura 1). Durante l'elaborazione RNA, l'introne globina è impiombato dal gene neomicina. Il neo-L1 RNA è confezionato, traslocato e integrato nel genoma sia come figura intera o l'inserimento troncato. Come indicato, L1 retrotrasposizione possono essere monitorati con la FISH con sonde specifiche per la neomicina impiombato (Figura 1).
La figura 2 mostra una rappresentazione schematica della sonda neomicina, con il labeled sondato che è più grande in termini di dimensioni e fluorescenza carente a causa di differenze di lunghezze d'onda di eccitazione. Si noti che il CY3 e FITC eccita a lunghezze d'onda diverse rispetto bromuro di etidio DNA macchiato.
La densità di metafase spread cromosomiche è stata determinata diluendo la soluzione madre originale in 1: 2, 1: 4, 1: 8 e 1:16 diluizioni e ogni diffusione valutati per la densità, la distribuzione e la distanza degli spread dal nucleo a 10X di ingrandimento ( Figura 3A). I risultati mostrano ad alta densità, clumpy e scoppiarono a spread (figura 3A-I-II), così come uniformemente distribuito e si diffonde ben distanziati (figura 3A-III-IV). A bassa densità si diffonde con una distribuzione uniforme sono stati scelti per la successiva analisi.
spread cromosomiche sono state colorate con Hoechst tintura e la diffusione della qualità valutata in base alla lunghezza dei cromosomi, rotondità delle spreads e la distanza tra cromosomi (Figura 3B). Questi indici sono stati influenzati dalla lunghezza del tempo le cellule sono state trattate con Colcemid, soluzione ipotonica, soluzione Carnoy fissativo e / o il modo in cui sono state di arresti le cellule di rilasciare cromosomi. Se le cellule sono state incubate per un breve periodo in soluzione ipotonica, spread cromosomiche divennero strettamente annodati e singoli cromosomi erano difficili da visualizzare (Figura 3B-i). D'altro canto, più incubazione in soluzione ipotonica provocato la rottura dei nuclei, dispersione di cromosomi, e / o perdita di cromosomi (Figura 3B-ii). Incubazioni più lunghe in Colcemid aumentato il numero di cellule in metafase, ma portano a condensazione di cromosomi (Figura 3B-iii). Come tale, una buona diffusione cromosoma qualità richiede periodi di incubazione ottimali sia in Colcemid e soluzione ipotonica KCl. Nelle nostre mani, a 90 min incubazione in Colcemid, 20 in soluzione ipotonica a 37° C e l'uso di un vapore caldo per scoppiare le cellule sono risultate essere le condizioni ottimali per la generazione dei differenziali di alta qualità (Figura 3B-IV).
Spread cromosomiche sono state colorate per L1 retrotrasposizione utilizzando sonde che hanno come target Sneo. La sonda è stato etichettato sia con FITC e CY3 per dimostrare che in entrambi i casi L1 retrotrasposizione è visto solo in cellule che esprimono wild type L1 (Figura 4). Nessuna colorazione è stato visto in cellule che esprimono la spina dorsale vettore da solo (figura 4; confrontare cieli e fondi per ogni fluoroforo). Nelle nostre mani, segnale della sonda è stata rilevata nel 80-90% dei nuclei, con la stragrande maggioranza del segnale che rappresenta i singoli eventi retrotrasposizione. Abbiamo segnato solo retrotransposition nei nuclei con più di un inserimento e di qualità sparse era sempre esaminato prima di FISH.
Figura 1. Schema di L1 retrotrasposizione vettoriale. Diagramma illustra il processo di obiettivo primario trascrizione inversa che porta a inserimenti L1 pieno o troncato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. etichetta Sneo e sonde neomicina senza etichetta. La sonda marcata presenta meno di fluorescenza ed è di dimensioni maggiori rispetto alla sonda senza etichetta. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. contrasto di fase (campo Bright) e Hoechst spread macchia cromosomiche. A) mostra la diluizione degli spread per ottenere preparati ben distanziati. Barra della scala è di 50 micron. B) Hoechst macchia cromosoma che mostra l'influenza di Colcemid, soluzione ipotonica, soluzione Carnoy fissativo e la rottura sulla qualità diffusione. Barra della scala è di 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Analisi FISH di L1 retrotrasposizione. Colorazione di Sneo è assente in cellule di controllo, ma presente in cellule che esprimono L1 di tipo selvatico vettore. barra della scala è di 10 micron.Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Metodologie come il sequenziamento dell'intero genoma, inversa PCR e Southern blotting sono stati impiegati per studiare L1 retrotrasposizione. Sebbene queste metodologie sono estremamente utili nel localizzare dove si verificano inserimenti L1 all'interno di genomi, una sfida confusione per tutti loro è la necessità per la programmazione in-silico per riassemblare sequenze. La metodologia FISH descritta qui è concepito per integrare questi metodi, soprattutto nel caso di studi che richiedono analisi ectopica retrotransposition L1 nelle cellule coltivate. L'approccio può essere utilizzato sia per la valutazione quantitativa e qualitativa degli eventi retrotransposition e applicato ai nuclei interfase. Questa metodologia si vanta la precisione dei successivi metodi di allineamento sequenza in-silico impiegate per determinare ectopiche siti di inserzione L1 16. L'allineamento delle sequenze ripetitive può essere ambiguo a causa della formazione di omopolimeri, mentre sequen ripetitivaces possono essere persi durante l'amplificazione Primer di template con conseguente sottorappresentazione delle sequenze ripetitive. Metodologia di pesce può superare questi problemi perché sonde FISH possono temprare a omopolimeri ed è improbabile che essere di parte contro sequenze ripetute intatti 16. Inoltre, rispetto ai test retrotrasposizione basati su colture cellulari, pesce può determinare i tassi di retrotrasposizione a livello di nucleo singolo. Come tale, questo approccio impedisce sia sotto e sopra la stima dei tassi di retrotransposition come più inserimenti possono verificarsi in singoli nuclei 16. Dati recenti ottenuti da NGS hanno confermato che le metodologie basate su colture cellulari sottovalutano frequenze retrotrasposizione 25.
Non è chiaro dove i giovani L1S preferiscono inserire e se un meccanismo di targeting esiste per dirigere questi inserimenti all'interno del genoma. Utilizzando la metodologia sopra abbiamo dimostrato che L1 inserisce preferenzialmente in gene re poveriregioni del genoma 16. Altri hanno dimostrato che l'abbondanza di sequenze L1 è in aumento cromosomi con una minore densità di gene 17,18. Insieme, questi risultati suggeriscono una modalità regolata di inserimento dove minacce alla cella sono minimizzati inserendo L1 in "minori attivi" regioni del genoma. Il modello di movimento elemento trasponibile in organismi inferiori ha prestato sostegno a questa interpretazione. Ad esempio, lievito di fissione retrotrasposoni, Tf1, integra 95% del tempo di monte promotori dei geni e la maggioranza di questi geni sono coinvolti nella regolazione dello stress 19,20. In cellule di lievito che non hanno accesso ad azoto, TY5 integra nelle ORF invece delle regioni eterocromatina 21. Gli esperimenti nel mais hanno dimostrato che l'integrazione dei trasposoni del DNA portano a fenotipi cereale colore variegato e integrazione di Hatvine1-RRM DNA trasposone nella regione del promotore del gene VvTFL1A ha dimostrato di influenCe lo schema di ramificazione e la pezzatura dei frutti della vite 22,23.
I passi fondamentali per il successo della metodologia FISH dettagliato qui ci sono la generazione di buoni spread cromosomiche e l'etichettatura corretta, la purificazione e l'ibridazione di sonde. Se le sonde non sono puliti correttamente, il segnale di fondo elevato risultante renderà difficile risolvere sonda legame cromosomi. Preferibilmente, le sonde dovrebbero essere gel purificato per eliminare la fluorescenza residuo dNTP. Inoltre, il periodo di tempo che spread vengono incubate in soluzione Carnoy fissativo è importante preparare buoni spread cromosomiche. Se troppo a lungo, la membrana cellulare può scoppiare prematuramente e causare la perdita di cromosomi. Se troppo breve, può essere difficile ottenere adeguate spread causa della rottura della membrana carente. La quantità / concentrazione di formammide determina il centro di cromatidi e quindi è importante ottimizzare empiricamente per i migliori risultati. Tutti i lavaggi devono essere approfondita per enteure che tutte le sonde non legate e anticorpi secondari sono lavati via.
In conclusione, il metodo FISH qui descritto può essere utilizzato per rilevare sia la lunghezza piena e ectopiche eventi retrotransposition troncate L1 e può essere applicata ad altri vettori retrotransposition utilizzando proteina fluorescente verde (GFP) come indicatore retrotrasposizione cassetta. Sebbene integrali inserimenti L1 possono essere determinate utilizzando questa metodologia, non discernere nuovi inserimenti troncati endogeni a causa del numero di troncato L1 s all'interno del genoma. L'accessibilità sonda potrebbe anche essere limitata dalla formazione aumento eterocromatina 16,24. Tuttavia, l'inclusione di LNA all'interno di sonde FISH può essere impiegato per migliorare la sonda ricottura. Rilevamento di Sneo è subordinato un ciclo completo di retrotransposition e inserimenti più piccola della sonda / cancellazione può essere mancato.
Per una descrizione dettagliata di esperimenti in which l'uso di questi vettori e l'espressione di proteine L1 e retrotrasposizione sono caratterizzati, si prega di fare riferimento alla pubblicato lavora 12,16.
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza potenziali interessi in competizione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
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