Summary
ここでは、安定的に合成LINE-1を発現したHepG2細胞株の染色体スプレッドの単核レベルでのLINE-1レトロ転位を追跡するためにFISH法を採用しています。
Introduction
人間の長い散在要素-1（ ライン1またはL1）は 、「コピー＆ペースト」レトロ転位機構を介してゲノム内を伝播する自律移動要素です。典型的なヒトL1は 〜6キロバイトの長さであり、プロモーターとして機能5'UTR（非翻訳領域）で構成され、2つのオープンリーディングフレーム（ORF）：L1 -ORF1とL1 -ORF2、およびポリAとの3'UTR 。コイルコイルドメイン、RNA認識モチーフとC末端ドメイン、L1 -ORF2タンパク質はエンドヌクレアーゼを持っていながら、転写酵素およびシステインリッチドメイン1,2,3,4,5リバース ：尾L1 -ORF1タンパク質は、3つの異なるドメインを持っています。 L1 -ORF2はレトロ転位1,2,6-に必要な両方のタンパク質と、酵素活性を提供しつつ、L1 -ORF1は、核酸シャペロン活性を示します。
L1のレトロ転位のサイクルは、L1の5'UTRからの転写で始まります、L1 -ORF1展示どちらかそれは独自のRNAまたはそれがL1 -ORF2p 7とリボ核タンパク質粒子（RNP）を形成するために他のRNA（ すなわち、SINE / SVAS /偽）をパッケージ化し、トランス -結合をパッケージ化シス -結合、 8。 RNPはOHを露出させるために、L1 -ORF2pニックのエンドヌクレアーゼ活性ゲノムDNA（gDNAを）核内に移行-グループ9、それが素数に逆転写酵素によって使用される順番で、3 '末端からDNAにRNAを合成する逆。逆合成の間、DNAの第二鎖は、署名のL1挿入配列（ 例えば 、TTTTAA）と呼ばれる標的部位の重複（TSD）9,10を形成するために充填されている互い違いの休憩を作成するために、オリジナルのニック部位7から20塩基対をニックが入っています。このプロセスは、ターゲットプライム逆転写（TPRT）として知られており、insertiにつながります挿入配列の両端にTSDSとL1 /他のDNAの完全または切断型コピーの上。L1のレトロ転位はまた、いくつかの細胞型11にTPRT状の非相同末端結合を介して媒介されることが示されています。
私たちの研究で採用さL1のレトロ転位ベクターは、非エピソームであるとタグ付けされたL1 -ORF1＆2P組み合わせたCMV-L1-5'UTRプロモーターによって駆動される（ 図1）12から構成されています。この構築物の以前のバージョンでは、酵母とヒトの細胞培養物13,14,15を用いた研究に記載されています。スプライシングおよび統合後ネオマイシンの発現を駆動するために逆方向に配置された3 '末端を有する、ベクターの5'および3 '末端に位置する2つの別個のCMVプロモーター。 3 '末端のレトロトランスポジションインジケーターカセットは、L1 -ORFsにネオマイシン遺伝子挿入アンチセンスで構成され、グロブによって半分に分離することによって不活性化さスプライスドナー（SD）およびスプライスさアクセプター（SA）部位（ 図1）とイントロンインチ染色体への組み込みの際に、L1はシストロン性mRNAおよび非アクティブネオマイシンのmRNAから構成されてmRNAを生成するために、共通のプロモーターから転写されます。 RNAプロセシングの間に、グロビンイントロンは完全に機能するネオマイシン遺伝子を復元するために、ネオマイシン遺伝子の外にスプライスされます。ハイブリッドmRNAはシスでRNPにパッケージ化し、それがTPRTを使用して、完全長または切断のいずれかの挿入などゲノムに組み込まれている核内に移行されます。
ここでは、単一の核レベルでのL1 -retrotransposiitionパターンと挿入率を追跡するために、具体的スプライシングされたネオマイシン遺伝子（SNeo）に向けプローブを用いたin situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光を使用する方法について説明します。検出の効率と特異性は、DETにレトロ転位有能と無能な構築物およびプローブを用いて確認しました電気ショック療法SNeoまたはネオマイシンおよびイントロン接合部16をグロビン。この方法論は、このような複数の挿入、コロニー抵抗、良好なクローンの拡大などの細胞培養ベースのレトロ転位アッセイの欠点のいくつかを占めます。
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Protocol
注：特に指定のない限り、すべてのステップは室温で実施されるべきです。個々の試薬を準備する方法の詳細については、試薬のセクションを参照してください。
1.ラベリングL1プローブ
注：プローブは、化学的またはPCRの標識によって標識することができます。
- 化学的標識
- 臭化エチジウム（0.5μgの/ ml）を追加し溶融するまで、電子レンジでトリス - 酢酸-EDTA（TAE）バッファー、暑さの中で0.7から1パーセントアガロースゲルを作成したゲルを冷却することを可能にする、と。ゲルトレイに注ぎ、コームを追加し、ゲルは室温で固化することができます。
- 製造者のプロトコルに従って、37℃で1時間Cy3またはFITCでSNeoプローブ（1-2μgのを）ラベルを付けます。
注：SNeo Sは ネオマイシン遺伝子は、レトロ転位の完全なサイクル後に発現pliced 意味します。プローブのサイズは〜千塩基対です。 SNeoは、任意のベクターから、またはGENOMからPCR増幅することができますIC DNA。ストレプトアビジンCY3 / FITC標識試薬の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。 - 各ウェルに1×DNAローディング緩衝液、負荷とラベルされたSNeoプローブ溶液を混合し、15〜20分間75-100ボルトで実行します。
- ウルトラバイオレット（UV）照明装置を用いたプローブバンドを可視化します。 SNeoプローブの大きさを調整し、ロック核酸（LNA）も（ 図2）を加えることができることができることに留意されたいです。
- きれいな刃でゲルからSNeoの標識プローブの切断は、製造業者のプロトコルに従ってPCRクリーンアップキットを用いてゲルからSNeoプローブを可溶化し、精製します。
注意：カバー保護シールド（ すなわち、実験室のコートとUVクリアなフェイスマスク）との体のあらゆる露出部分のゲルを表示して切断。 PCR産物を精製したゲルへの情報のための材料および試薬の表を参照してください。 - 再実行SNeoの5μlを0.7％アガロースゲル上の未標識SNeoプローブで標識プローブコンする（1.1.1を参照）企業規模の増大や信号強度の損失（ 図2）。
- 260nmの吸光度を測定することにより、標識SNeoプローブの量を定量し、ヌクレアーゼフリーのH 2 O中に10ng /μlのアリコートにSNeoプローブを希釈分注して-20℃で保管。
- PCRラベリング（プローブ標識のための代替方法）
- 単一のチューブにPCR試薬とSNeo特異的プライマー（5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'および5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3'）を組み合わせる：13.6μlのヌクレアーゼフリーのH 2 O; 0.1μlののdATP、dCTPを、dGTPを（10 nM）を、 0.05μlのdTTPの（10 nM）を、 0.05μlのdUTPをビオチン/ dUTPを-FITC / CY3（10 nM）を、 4μlのバッファ5倍タグを移動します。 0.4μlのタグポリメラーゼを行きます。 1μlのSNeoテンプレート（10 NG）。 PCR試薬の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。
- サンプルの総数を乗じて各試薬の量を調整します。
- 以下のPCRサイクルパラメータを使用しますsが増幅し、ラベルSNeoプローブする：2分、95℃; 30秒、30秒、62℃、60秒間72℃、95℃の35サイクル; 2分間72°C;無期限に4℃で保持します。
注：アニーリング温度を調整することができるか、勾配PCRは、他のプローブのための最適なアニーリング温度を決定するために完成させることができます。 - セクション1.1.1、負荷のように0.7から1パーセントゲルを作成し、セクション1.1.4のようにプローブのバンドを可視化します。
- セクション1.1.5のようにラベルされたSNeoプローブをカットし、精製します。
- SNeoの再ラン5μlを（ 図2を参照）信号強度の大きさが増加し、損失を確認するために、未標識SNeoプローブで標識プローブ。
- 260nmの吸光度を測定することにより、標識SNeoプローブの量を定量し、ヌクレアーゼフリーのH 2 O中に10ng /μlのアリコートにSNeoプローブを希釈
2.準備染色体スプレッド
- ベクター骨格を発現する安定なクローンを生成します（制御L）または標準的な選択方法を使用してレトロ転位コンピL1。12,16非エピソームレポーターは、転写の研究で結果を関連付けるために使用されたが、エピソームベクターを使用することもできます。安定的に制御またはL1ベクトル完全増殖培地中で（必要に応じて作られたプレートサイズの調整と10cmプレートあたり1×10 6個の細胞を、）を発現する細胞を増殖させます。 HepG2細胞は、RPMI-1600、10％FBSおよびハイグロマイシン200μg/ mlのを使用します。 37℃で70％コンフルエンスに培養を成長させ、5％のCO 2。
注：成長培地の選択は、細胞型に依存します。ここで使用されるプラスミドは、ハイグロマイシンおよびネオマイシン両方の選択カセットを運ぶことを指定された、クローンの安定した選択はまた、ハイグロマイシンでの選択の後にネオマイシンを用いて行うことができるが、ネオマイシンの量は、各細胞型のための許容レベルを確立するために最適化する必要があります。 - 培養培地にコルセミド（0.4μgの/ ml）を追加し、metaphで細胞を停止させるために90分間インキュベートASE。異なる種類の細胞を使用している場合は、経験的に最適な中期停止のためのコルセミドと露光時（60、90、および120分）の最適濃度を決定します。
- 洗浄細胞は、細胞に0.25％トリプシン溶液を3-5 mlで添加することによりトリプシン処理し、細胞を分離するために5分間インキュベートし、1×ダルベッコPBS（DPBS）10mlで2倍。 10％FBSを含む培地の等量とトリプシンを不活性化します。
- 4℃、1,000×gで2分間遠心分離細胞は、細胞ペレットから培地を吸引し、DPBSで細胞を洗浄します。細胞を再懸濁するためにDPBSの200μLを残して吸引し、すべてのDPBS、。確認した細胞を十分に混合され、すべての塊が分散していること。ミックスと塊を分散し、ボルテックスを回避するために、ちらつきや穏やかなピペッティングを使用してください。
- 低張溶液5mlを加える（ すなわち、75 mMの塩化カリウム）で水平15mlチューブを回転させながら37℃滴下する前に温め、20分間37℃でインキュベートします。材料とReagenの表を参照してください。取得し、低張液を作成する方法の詳細については、TS。
- 各洗浄後の細胞を再懸濁するために低張液の約200μLを残して2.5 3X - 5 4℃で分間繰り返し、120×gで遠心分離した細胞は、2.4を繰り返します。 3回の洗浄の最後に、ペレットは目に見えて白と腫れであることを確認してください。
- カルノア固定液溶液200μlでペレットを再懸濁し、1にする：2、1：4、1：8を、カルノア固定液溶液中で1：16の希釈。上記の約1cmからドライクリーンスライド上に各希釈液10μlを削除し、すぐに30秒を沸騰水から熱い蒸気に広がりのない側を露出させます。カルノア固定剤溶液を作成する方法については、材料および試薬の表を参照してください。
- 、室温でスプレッドを乾燥コプリンジャーで15-20分間の浸漬によっては0.1μg/ mlのヘキスト33342で染色し、DPBSで3回洗浄します。ヘキスト33342溶液を作製する方法については、材料および試薬の表を参照してください。 <李>表示は40倍の倍率で蛍光/位相差顕微鏡に広がります。スプレッドの準備を最適化した後、スプレッドはヘキスト33342で染色する必要はありません 。ビューは、結果セクションで概説されるように広がり、品質と分離を決定するために10倍の倍率で位相差顕微鏡に広がる（ 図3を参照）。
- スライド（ すなわち、広がりのない側）とは反対側のダイヤモンドポイントマーカーとの良好なスプレッドを選択し、円。
- ストアは月まで-20℃で広がります。湿気への暴露を避けます。
in situハイブリダイゼーション（FISH）3.蛍光
- スプレッドを安定化し、脱水
注：-20℃で保存した場合に平衡化中期染色体を室温に広がります。試薬を入手して作成する方法の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。- 中期染色体が200μlのRNase Aで広がるインキュベート37℃で1時間。
- 洗浄は、それぞれ10mMのHCl溶液ですすぎ、続いて5分間二回2×SSC、バッファにスライド。
- 脱イオンH 2 Oで洗浄し、5分間ずつ2回-SSC緩衝液で2回洗浄し、37℃で10分間、1％ペプシンでスプレッドをインキュベートします。
- 10分間、4％パラホルムアルデヒドでスプレッドをインキュベートし、5分間ずつ二回2×SSC緩衝液で洗います。
- 70％、80％、および95％エタノール：エタノールシリーズ中で2分間インキュベートすることによって広がる脱水。
- 空気乾燥スライド。
- ハイブリダイゼーションは、L1標識レトロ転位プローブ（ すなわち、SNeo）とスプレッド
注意：直接標識プローブの場合は、すべての回で光から遠ざけます。試薬を入手して作成する方法の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。- 10分間の72℃でのハイブリダイゼーション緩衝液にSNeo 30ngの、熱を加え、室温で2分間のクール。
- 電子にSNeoプローブ溶液の30μlのを追加ACHスプレッドは、カバーガラスで覆い、ゴムセメントでエッジを封印します。全く泡の形成を確認していません。
- 徐々に37℃まで温度をドロップし、37℃で暗所の加湿チャンバー内で一晩インキュベートし、ヒートブロック上で5分間、72℃でスライドを加熱します。
- 洗濯と表示（または二次抗体の添加）
注意：直接標識プローブの場合は、すべての回で光から遠ざけます。
注：準備する方法については、材料および試薬の表を参照してください。染色体全体の広がりをカバーするのに十分な量の使用が推奨されます。カバーガラスを添加した場合、過剰なボリュームが失われることに注意してください。- カバースリップを削除するには、2×SSC緩衝液でスライドを浸し。
- 洗浄は5分間、45℃で2×SSC、バッファー中に浸漬することによりスライド。
- 5分間、2×45℃で洗浄緩衝液に浸漬することによってスライドを洗浄します。
- 洗浄は、10分間、45℃で0.1×SSC緩衝液中に浸漬することによりスライド。
- 洗浄は、10分間、45℃で2×SSC緩衝液中に浸漬することによりスライド。
注：場所水浴中で推奨される緩衝液を含むコプリンジャーは、45℃に温度を調整します。 - 室温にスライドを冷却し、検出緩衝液でスライドを平衡化します。
- 直接標識プローブの場合は、3.4.10に進みます。
- 間接的な標識プローブの場合は、20〜30分間、およびブロッキング緩衝液中のブロックは、DPBSで3回洗います。
- 1時間ブロッキング緩衝液（ 例えば 、5μg/ mlのストレプトアビジン-FITC、またはαCY3）二次抗体を50μlとインキュベートします。
- 洗浄は回5分間、2×SSC中でスライド。
- 10分間ヘキスト33342溶液（0.1μgの/ ml）で対比染色。
注：この染色はプローブとの共局在化のための染色体を染色するために行われます。 - DPBS 3倍に洗って、マウンティング培地のドロップを追加し、カバースリップを置き、マニキュアとエッジを封印。
- 40Xミリアンペアで蛍光顕微鏡を用いて、L1のレトロ転位を分析gnification。
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Representative Results
L1のレトロ転位ベクターの模式図を図1に示されている。ベクターは、センス配向でグロビンイントロンによって中断され、SDおよびSA部位により挟まれているL1のORFに対してアンチセンス配向のネオマイシン遺伝子から成ります。安定して染色体に組み込まれた場合、L1 mRNAが組み合わさCMVおよびL1-5'UTRプロモーター（ 図1）から転写されます。 RNAプロセシングの間に、グロビンイントロンはネオマイシン遺伝子の外にスプライスされます。ネオL1 RNAは、パッケージ化された転座および全長又は切断挿入のいずれかとしてゲノムに組み込まれます。示されるように、L1のレトロ転位は、スプライスネオマイシン（ 図1）に特異的なプローブを用いてFISHによって追跡することができます。
図2は labeleと、ネオマイシンプローブの概略図を示しますdはそれが原因で励起波長の違いにサイズが大きく、蛍光不足しているプローブしました。 CY3とFITCは、臭化エチジウム染色されたDNAとは異なる波長で励起することに注意してください。
2、1：4、1：8と1：16希釈液と10倍の倍率での核からスプレッドの密度、分布および距離の評価を行った各スプレッド（分裂中期の染色体スプレッドの密度は1に、元の原液を希釈することによって決定しました図3A）。結果は、高密度を示し、塊状とスプレッド（ 図3A-I〜II）、ならびに均等に分配し、よく間隔のスプレッド（ 図3A-III〜IV）をアウトバースト。均一な分布は、その後の分析のために選択したと低密度で広がります。
染色体スプレッドは、ヘキスト染料および染色体の長さに基づいて評価広がり品質、Sの丸みで染色しましたPREADSと間染色体の距離（ 図3B）。これらの指標は、細胞は、コルセミド、低張液、カルノア固定液溶液および/または細胞が染色体を解放するために逮捕された方法で処理した時間の長さによって影響を受けました。細胞を低張液中で短時間インキュベートした場合には、染色体スプレッドは、しっかりと結ばれ、個々の染色体が（ 図3B-i）を可視化することは困難であったになりました。一方、低張液中でより長いインキュベーションは、核の破裂で染色体の散乱をもたらし、および/ または染色体の損失（ 図3B-II）。コルセミドでより長いインキュベーションは、中期で細胞の数を増加したが、染色体の凝縮につながる（ 図3B-III）。このように、良質の染色体スプレッドは、コルセミドおよび低張KCl溶液の両方に最適なインキュベーション期間を必要とします。 37での低張液中コルセミド、20で私たちの手で、90分のインキュベーション°Cと細胞破裂する熱蒸気の使用は、高品質の広がり（ 図3B-IV）の生成のための最適条件であることが見出されました。
染色体スプレッドは、L1のレトロ転位がSNeoをターゲットプローブを用いて染色しました。プローブは、いずれの場合もL1のレトロ転位は、野生型L1を発現する細胞でのみ見られることを示すために、FITCおよびCy3の両方で標識しました （ 図4）。染色だけでは、ベクター骨格を発現する細胞において見られなかった（ 図4;各蛍光団のために上部と下部のパネルを比較します）。私たちの手では、プローブ信号は、単一のレトロ転位事象を表す信号の圧倒的多数で、核の百分の80から90で検出されました。私たちは、複数の挿入に核内にレトロトランスポジションを獲得し、スプレッドの品質は常にFISHの前に調べました。
L1の レトロ転位ベクトル の図1.模式図 。図は、完全または切断L1挿入につながる目標プライム逆転写のプロセスを示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. SNeoと非標識ネオマイシンプローブ。標識プローブの展示少ない蛍光を標識し、非標識プローブに比べてサイズが大きくなっている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.位相コントラスト（明視野）とヘキスト染色染色体スプレッド。 A）よく間隔の調製物を得るためにスプレッドの希釈を表示します。スケールバーは、スプレッドの品質にコルセミド、低張液、カルノア固定溶液と破裂の影響を示す50μmである。B）ヘキスト染色染色体です。スケールバーは10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
L1の レトロ転位 の 図4 FISH分析 。SNeoの染色は、対照細胞には存在しないが、L1野生型ベクターを発現する細胞内に存在します。スケールバーは10μmです。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このような全ゲノムシーケンシング、逆PCRおよびサザンブロッティングなどの方法論は、L1のレトロ転位を研究するために使用されてきました。これらの方法論は、L1の挿入がゲノム内で発生する場所位置で非常に貴重であるが、それらのすべてのための交絡課題は、シーケンスを再構成するためのインシリコプログラミングの必要性があります。ここで説明するFISH法は、特に培養細胞における異所性のL1レトロ転位の分析を必要とする研究の場合には、これらの方法を補完するように設計されています。アプローチは、レトロ転位事象の定量的および定性的評価の両方のために使用し、核を間期に適用することができます。この方法は、異所性L1挿入部位16を決定するために用いられる後続のインシリコ配列アラインメント方法の精度を誇ります。反復配列のアラインメントは、反復sequenながら、によるホモポリマーの形成にあいまいにすることができますCESは、反復配列の過少に結果のテンプレートのプライマー増幅の間に失われる可能性があります。 FISHプローブはホモポリマーにアニールし、完全な反復配列16に対して付勢されそうにないことができるので、FISH法は、これらの問題を克服することができます。また、細胞培養ベースのレトロ転位アッセイに比べて、FISHは、単一の核レベルでのレトロ転位率を決定することができます。複数の挿入を単一の核16に発生する可能性がありますなどのように、このアプローチは、レトロ転位率の推定の下と上を両方防ぐことができます。 NGSから得られた最近のデータは、細胞培養ベースの方法論は、レトロトランスポジション頻度25を過小評価していることを確認しています。
若いL1S挿入することを好むとターゲティング機構は、ゲノム内のこれらの挿入を指示するために存在しているかどうかをどこかは不明のまま。上記の方法論を用いて、我々は、L1は 、遺伝子貧しい再に優先的に挿入することが示されていますゲノム16のgions。その他はL1配列の存在量がより少ない遺伝子密度17,18と染色体の増加であることを示しています。まとめると、これらの知見は、細胞への脅威は、ゲノムの「低いアクティブ」領域にL1を挿入することによって最小化され、挿入の規制モードを示唆しています。下等生物における転移因子の動きのパターンは、この解釈にサポートを貸しました。例えば、分裂酵母レトロトランスポゾン、Tf1のは、遺伝子プロモーターの上流の時間の95％を統合し、これらの遺伝子の大部分は、応力調整19,20に関与しています。窒素へのアクセスを欠いている酵母細胞では、Ty5はのORFの代わりにヘテロクロマチン領域21に統合されています。トウモロコシでの実験は、DNAトランスポゾンの統合は多彩なトウモロコシの色の表現型につながることを示したとVvTFL1A遺伝子のプロモーター領域にHatvine1-RRMの DNAトランスポゾンの統合はinfluenすることが示されています分岐パターンとブドウ22,23の果実の大きさをCE。
ここに詳述FISH方法論の成功への重要なステップは、良好な染色体スプレッドと適切な標識、精製およびプローブのハイブリダイゼーションの世代です。プローブが適切に洗浄されていない場合は、得られる高バックグラウンドシグナルは、それが困難な染色体に結合するプローブを解決するために行います。好ましくは、プローブは、ゲル精製したdNTPからの残留蛍光を排除することであるべきです。また、スプレッドはカルノア固定溶液中でインキュベートされる時間の長さは、良好な染色体スプレッドを調製することが重要です。長すぎる場合、細胞膜が早期に破裂し、染色体の損失を引き起こす可能性があります。短すぎる場合、原因欠損破水の適切なスプレッドを得ることが困難となります。ホルムアミドの量/濃度は、染色分のフォーカスを決定し、したがって、最良の結果を得るために実験的に最適化することが重要です。すべての洗浄はENSに徹底すべきですすべての未結合プローブ及び二次抗体が洗い流されているURE。
結論として、ここで説明するFISH法は、完全長および切断型の異所性のL1レトロ転位事象の両方を検出するために使用することができ、レトロ転位インジケータカセットとして緑色蛍光タンパク質（GFP）を使用して、他のレトロ転位ベクトルに適用することができます。全長L1の挿入は、この方法論を用いて決定することができますが、それが原因で切り捨てL1のゲノム内の数に新たな内因性の切り捨て挿入を識別しません。プローブのアクセスも増加のヘテロクロマチン形成16,24によって制限される可能性があります。しかし、FISHプローブ内のLNAの包含は、プローブのアニーリングを増強するために使用することができます。 SNeoの検出は、レトロ転位およびプローブ/削除を逃したことができるよりも小さい挿入のフルサイクル次第です。
whicでの実験の詳細な説明について時間これらのベクターの使用およびL1タンパク質およびレトロ転位の発現が特徴としているが、公開された作品12,16を参照してください。
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Disclosures
著者らは、潜在的な競合する利益を宣言しません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
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