Summary
여기에서 우리는 안정적으로 합성 LINE-1을 표현 인 HepG2 세포주의 염색체 스프레드에서 하나의 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스을 추적하기 위해 FISH 방법을 사용한다.
Introduction
인간의 긴 산재 핵 요소-1 (라인-1 또는 L1) 레트로 트랜스 메커니즘을 관통 게놈 내에서 전파 "복사 및 붙여 넣기"자율 이동 요소입니다. 일반적인 인간의 L1은 ~ 6킬로바이트 길고 프로모터 역할을하는 5'UTR (번역되지 않은 지역)으로 구성되어, 두 개의 오픈 리딩 프레임 (ORF를) L1 -ORF1 및 L1 -ORF2 및 폴리 -A와 3'UTR . 코일 코일 도메인, RNA 인식 모티브와 C 터미널 도메인, L1 -ORF2 단백질이 효소를 가지고있는 동안, 효소 및 시스테인이 풍부한 도메인 1,2,3,4,5 역 : 꼬리 L1 -ORF1 단백질은 세 가지 영역이 있습니다. L1 -ORF2는 레트로 트랜스 1,2,6 모두 필요 단백질, 효소 활성을 제공하지만 L1 -ORF1는 핵산 샤페론 활성을 나타낸다.
L1의 레트로 트랜스의주기는 L1의 5'UTR에서 전사로 시작 L1 -ORF1 나타낸다 하나는 다른 RNA를 패키지화 그 자체 RNA 패키지화 시스 - 결합 또는 트랜스 - 결합 (즉, SINE은 / SVAS / 가유)는 L1 -ORF2p 7와 리보 입자 (RNP)을 형성 할 8. 즉 프라이밍 역전사 효소에 의해 사용 턴이고, 기 (9) 및 3 '말단에서 DNA으로서 합성 된 RNA를 역 - RNP들에는 L1 -ORF2p 닉스 게놈 DNA (gDNA를)의 효소 활성은 OH를 노출 핵으로 이동시키다. 역 합성 중에 DNA의 두번째 가닥 서명 L1 삽입 서열 (예 TTTTAA)라는 목표 부위 중복 (TSD) 9,10 형성 채워진다 태거 나누기 만들 원래 닉 사이트 7-20 혈압 새김된다. 이 과정은 대상 주요 역 전사 (TPRT)로 알려져 inserti에 이르게된다삽입 된 시퀀스의 양쪽 끝에서 TSDs와 L1 / 다른 DNA를 전체 또는 절단 된 사본에. L1의 레트로 트랜스도를 통해 매개되는 것으로 나타났다 비 동종 최종 합류 일부 세포 유형 11 TPRT처럼.
우리의 연구에서 사용 된 L1의 레트로 트랜스 벡터가 아닌 에피 솜과 태그 L1 -ORF1 & 2P 결합 CMV-L1-5'UTR 프로모터에 의해 구동 (그림 1) (12)로 구성되어 있습니다. 이 구조의 이전 버전 효모 및 인간의 세포 배양 13,14,15를 사용하여 연구에 기재되어있다. 3 '말단이 접합 및 통합 후 네오 마이신의 발현을 유도하기 위해 반대 방향으로 배치하여 5'및 3 '에있는 두 가지 CMV 프로모터는 벡터의 끝납니다. 3 '말단에서의 레트로 트랜스 표시 카세트 L1 -ORFs에 네오 마이신 유전자 삽입 안티센스 구성 및 글로브에 의해 두 부분으로 분리하여 비활성 렌더링접합 기증자 (SD)과 접합 수용체 (SA) 사이트 (그림 1)과 인트론있다. 염색체 내로 통합되면, L1은 bicistronic mRNA의 비활성 마이신 mRNA에 구성된의 mRNA를 생산하는 일반 프로모터로부터 전사된다. RNA 프로세싱 동안에, 글로빈 인트론은 완전히 기능 네오 마이신 유전자를 복원하는 네오 마이신 유전자에서 접합된다. 하이브리드의 mRNA는 시스의 RNP로 포장이 TPRT를 사용하여 전체 길이 또는 절단하거나 삽입 등의 게놈에 통합되어 핵으로 전좌된다.
여기에서 우리는 하나의 핵 수준에서 L1의 -retrotransposiition 패턴과 삽입 속도를 추적하기 위해 특별히 접합 네오 마이신 유전자 (SNeo)에 지시 프로브와 현장 하이브리드 (FISH)에서 형광을 사용하는 방법을 설명합니다. 효율성과 검출 특이도는 탐지하는 능력 레트로 트랜스와 무능 구조 및 프로브를 사용하여 확인 하였다요법 SNeo 또는 인트론 접합 (16) 글로빈 네오 마이신합니다. 이 방법은 복수의 삽입, 콜로니 저항 양호한 클론 확장으로서 세포 배양 계 레트로 트랜스 분석법의 단점 중 일부를 차지한다.
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Protocol
주 : 달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 실온에서 수행한다. 개별 시약을 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 시약 섹션을 참조하십시오.
1. 레이블 L1 프로브
참고 : 프로브는 화학 물질 또는 PCR 라벨로 표시 할 수 있습니다.
- 화학 표시
- 에티 디움 브로마이드 (0.5 μg의 / ㎖)를 추가 한 후 용융 할 때까지 전자 레인지에 트리스 - 아세테이트 - EDTA (TAE) 버퍼, 열에서 0.7-1 % 아가로 오스 겔을 겔 냉각 할 수 있도록합니다. 젤 트레이에 붓고 빗을 추가하고 젤은 실온에서 응고 할 수 있습니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 1 시간 동안 37 ° C에서 CY3 또는 FITC와 SNeo 프로브 (1-2 μg의)를 레이블.
참고 : SNeo는 S는 레트로 트랜스의 전체 사이클 이후 표현 네오 마이신 유전자를 pliced이다. 프로브의 크기는 1000 ~ BP이다. SNeo는 PCR 어떤 벡터 또는 genom에서 증폭 될 수있다IC에서 DNA. 스트렙 타비 딘 - CY3 / FITC 표지 시약에 대한 자세한 내용은 재료 및 시약의 표를 참조하십시오. - 각 웰에 1 배의 DNA 로딩 버퍼, 부하 표지 SNeo 프로브 솔루션을 혼합하고 15 ~ 20 분 동안 75 ~ 100 볼트에서 실행합니다.
- 울트라 바이올렛 (UV) 조명기를 사용하여 검사 밴드를 시각화. SNeo 프로브의 크기가 조절 될 수 있고 잠금 핵 산 (LNA)도 (도 2)를 추가 할 수 있습니다.
- 컷 용해하고 제조자의 프로토콜에 따라 PCR 클린 - 업 키트를 사용하여 겔로부터 SNeo 프로브를 정제 클린 블레이드 겔로부터 SNeo 프로브를 표지.
주의 : 커버 보호 방패 (즉, 실험실 코트와 UV 맑은 얼굴 마스크)와 함께 신체의 모든 노출 부분보기 및 젤을 절단 할 때. PCR 제품을 정화 젤에 정보 소재의 테이블과 시약을 참조하십시오. - 다시 실행 SNeo 5 μL은 0.7 % 아가로 오스 겔에 미 표지 SNeo 프로브와 프로브를 표시 사기 위해 (1.1.1 참조)기업 규모의 증가와 신호 강도의 감소 (도 2).
- 클레아 자유 H 2 O. 260 nm에서 흡광도를 측정하여 SNeo 표지 프로브의 양을 정량화 10 NG로 SNeo 프로브 희석 / μL 분취 -20 ° C에서 보관 씩.
- PCR 라벨 (프로브 라벨에 대한 대체 방법)
- SNeo 특정 프라이머를 결합 (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 '와 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') 하나의 튜브에 PCR 시약 : 13.6 μL 클레아 무료 H 2 O; 0.1 μL dATP를,의 dCTP, dGTP의 (10 ㎚); 0.05 μL dTTP를 (10 ㎚); 0.05 μL의 dUTP를 비오틴 / dUTP를-FITC / CY3 (10 ㎚); 4 μL 버퍼 5 배 태그를 이동; 0.4 μL는 태그 중합 효소를 이동; 1 μL SNeo 템플릿 (10 NG). PCR 시약에 대한 자세한 내용은 재료 및 시약의 표를 참조하십시오.
- 샘플의 총 수를 곱하여 각 시약의 양을 조정한다.
- 다음 PCR 사이클 매개 변수를 사용하여들 증폭 및 레이블 SNeo 프로브합니다 : 2 분 95 ° C; 30 초, 30 초 동안 62 ° C, 60 초, 72 ° C, 95 ° C의 35주기; 2 분 72 ° C; 무기한 4 ° C에서 잡으십시오.
주 : 소둔 온도가 조절 될 수 있거나, 다른 구배 PCR 프로브 최적의 어닐링 온도를 결정하기 위해 완료 될 수있다. - 섹션 1.1.1, 부하로 0.7-1 % 젤을 확인하고 섹션 1.1.4에서와 같이 프로브 밴드를 시각화.
- 잘라 내기 및 섹션 1.1.5에서와 같이 표시 SNeo 프로브를 정화.
- 다시 실행 SNeo 5 μL (그림 2 참조) 크기의 증가와 신호 강도의 손실을 확인하기 취소 표지 SNeo 프로브와 프로브를 표시.
- 클레아 자유 H 2 O. 260 nm에서 흡광도 측정에 의해 표시된 SNeo 프로브의 양을 정량화 10 NG로 SNeo 프로브 희석 / μL 분취
2. 준비 염색체 스프레드
- 벡터 백본을 표현 안정적인 클론을 생성 (contro표준 선택 방법을 사용 리터) 또는 레트로 트랜스 관할 L1. 비 에피 솜 기자가 전사 연구와 연구 결과의 상관 관계를하는 데 사용 된 반면 12, 16, 에피 솜 벡터도 사용될 수있다. 안정적으로 제어 또는 L1 벡터 전체 성장 미디어 (필요에 따라 만든 접시 크기 조정에 10cm 접시 당 1 × 10 6 세포를) 발현하는 세포를 성장. 인 HepG2 세포, RPMI-1600, 10 % FBS 및 하이 그로 마이신 200 ㎍ / mL로 사용한다. 37 ° C에서 70 %의 합류에 문화를 성장 5 % CO 2.
주 : 성장 배지의 선택은 세포 형태에 따라 달라진다. 여기에서 사용되는 플라스미드는 하이 그로 마이신 및 네오 마이신 모두 선택 카세트를 가지고 있음을 감안할 때, 클론의 안정적인 선택도 하이 그로 마이신에서 선택한 후 네오 마이신으로 수행 될 수 있지만, 네오 마이신의 양은 각 세포 유형에 대해 허용 레벨을 설정하기 위해 최적화 될 필요가있다. - 문화 매체에 colcemid (0.4 μg의 / ㎖)를 첨가하고, 90 분 metaph에서 세포를 체포하는 동안 품어ASE. 다른 세포 유형을 사용하는 경우, 경험적으로 최적의 중기 체포 colcemid와 노출 시간 (60 분, 90 분, 120 분)의 최적 농도를 결정한다.
- 워시 세포는 세포 3-5 ml의 0.25 % 트립신 용액을 첨가하고, 세포를 분리하기 위해 5 분 동안 배양하여 1X 둘 베코 PBS (DPBS)를 Trypsinize 10 mL로 2 배. 10 % FBS를 함유 배지의 동일한 양의 트립신을 비활성화한다.
- 4 ° C에서 1,000 XG에서 2 분 동안 세포를 원심 분리기 세포 펠렛에서 매체를 기음과 DPBS로 세포를 씻어. 세포를 다시 일시 DPBS 200㎕를 떠나는 모든 대기음 DPBS. 확인 세포를 잘 혼합하고, 모든 덩어리가 분산되어있다. 혼합 덩어리를 분산하고 텍싱을 피하기 위해 깜박임 또는 부드러운 피펫을 사용합니다.
- 저장성 용액 5 ㎖를 추가 (즉, 75 밀리미터의 KCl)는 수평으로 15 ML 튜브를 회전시키면서 37 ° C 드롭 현명한에 미리은 예열 20 분 동안 37 ° C에서 품어. 재료 및 Reagen의 표를 참조하십시오취득 및 저장성 용액을 제조하는 방법에 대한 자세한 내용은 TS.
- 각 세척 후 세포를 다시 일시 중단 저장성 용액을 약 200 μl를 떠나 2.5 배 - 5 4 ° C에서 분 반복 120 XG에 원심 분리기 세포는 2.4 단계를 반복합니다. 3 세척의 끝에서, 펠렛은 눈에 띄게 흰색과 부어 있는지 확인하십시오.
- Carnoy 정착액 솔루션 200 μL의 펠렛을 다시 중단하고는 1 : Carnoy 정착액 솔루션 8, 1시 16분 희석 : 2, 1 : 4, 1. 위의 약 1cm에서 건조 깨끗한 슬라이드에 각 희석의 10 μl를 삭제하고 즉시 30 초 동안 끓는 물에서 뜨거운 증기로 확산없는면을 노출. Carnoy 정착액 솔루션을 만드는 방법에 대한 자료 및 정보 용 시약의 표를 참조하십시오.
- 0.1 μg의 /으로 상온에서 얼룩 스프레드를 건조 ml의 훽스트-33342 코 플린 항아리에서 15 ~ 20 분간 침지하여 씻어 DPBS와 배. 의 Hoechst-33342 솔루션을 만드는 방법에 대한 자료 및 정보 용 시약의 표를 참조하십시오. <리>보기는 40X 배율에서 형광 / 위상차 현미경에 펼쳐집니다. 확산 제제를 최적화 한 후, 스프레드는 훽스트-33342로 염색 할 필요가 없다. 보기 결과 섹션에서 설명한 바와 같이 확산 및 분리 품질을 결정하기 위해 10 배 배율에서 위상차 현미경 확산 (도 3 참조).
- 선택하고 슬라이드의 반대편에 다이아몬드 포인트 마커 좋은 스프레드 동그라미 (즉, 확산이없는 쪽).
- 저장 한 달에 최대 -20 ° C에서 펼쳐집니다. 습기에 노출되지 않도록 할 것.
제자리 하이브리드 3. 형광 (FISH)
- 스프레드 안정화 및 탈수
주 : -20 ° C에 저장된 경우 평형 중기 염색체 실온으로 퍼진다. 취득 및 시약을 만드는 방법에 대한 자료 및 정보 용 시약의 표를 참조하십시오.- 부화 중기 염색체 200 ㎕의 RNA 분해 효소 A의 확산으로37 ℃에서 1 시간.
- 워시 각각 10mM의 HCl 용액으로 세척 한 다음 5 분 동안 두 배-SSC 완충액 슬라이드.
- 탈 H 2 O로 씻어 5 분마다 2 배-SSC 버퍼로 두 번 씻어, 37 ° C에서 10 분 동안 1 % 펩신과 확산을 품어.
- 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 스프레드을 품어 5 분마다 두 배 SSC 버퍼에 씻어.
- 70 %, 80 %, 95 % 에탄올 : 에탄올 시리즈에서 2 분 동안 항온 처리에 의해 확산 탈수.
- 공기 건조 슬라이드.
- 하이브리드는 L1 라벨이 지정된 레트로 트랜스 프로브와 스프레드 (즉, SNeo)
주의 : 직접 표지 된 프로브의 경우, 항상 빛에 가까이하지 말 것. 취득 및 시약을 만드는 방법에 대한 자료 및 정보 용 시약의 표를 참조하십시오.- 10 분 동안 72 ° C에서 하이브리드 버퍼에 SNeo 30 ng의 열을 추가하고 실온에서 2 분 동안 멋진.
- 전자에 SNeo 프로브 솔루션의 30 μl를 추가ACH 확산, 커버 슬립으로 커버 고무 시멘트와 가장자리를 밀봉. 더 거품 형성을 확인하지 않습니다.
- 점차적으로 37 ℃로 온도를 삭제하고, 37 ℃에서 어두운 가습 실에서 하룻밤 부화, 히트 블록을 5 분 동안 72 ° C에서 슬라이드를 가열한다.
- 세탁보기 (또는 이차 항체의 추가)
주의 : 직접 표지 된 프로브의 경우, 항상 빛에 가까이하지 말 것.
주 : 재료 및 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 시약의 표를 참조하십시오. 전체 염색체의 확산을 충당하기에 충분한 볼륨의 사용을 권장합니다. coverslip에 추가 할 때 여분의 볼륨이 손실됩니다 것을 기억하십시오.- 커버 슬립을 제거하기 위해 2 배 SSC 버퍼에 슬라이드를 담가.
- 5 분 동안 45 ° C에서 2 배-SSC 버퍼에 침지하여 슬라이드를 씻으십시오.
- 5 분, 2 배 45 ° C에서 세척 버퍼에 침지하여 슬라이드를 씻으십시오.
- 10 분 동안 45 ° C에서 0.1X SSC 버퍼에 침지하여 슬라이드를 씻으십시오.
- 10 분 동안 45 ° C에서 2 배 SSC 버퍼에 침지하여 슬라이드를 씻으십시오.
참고 : 장소 수조에 추천 버퍼를 포함하는 코 플린 항아리는 45 ° C까지 온도를 조정합니다. - 실온으로 냉각 슬라이드 및 검출 완충액 슬라이드 평형.
- 직접 표지 된 프로브를 들어, 3.4.10 단계로 건너 뜁니다.
- 간접 표지 프로브를 들어, 20 ~ 30 분 동안 버퍼를 차단하는 블록 DPBS에 배를 씻는다.
- 1 시간 동안 (버퍼를 차단하는 예를 들어, 5 μg의 / ㎖의 스트렙 타비 딘 - FITC, 또는 αCY3) 차 항체의 50 μL에 품어.
- 두 번 5 분 동안 2 배 SSC에서 슬라이드를 씻으십시오.
- 10 분 동안의 Hoechst-33342 용액 (0.1 μg의 / ㎖) Counterstain과.
참고 :이 염색이 프로브와 공동 현지화 염색체를 염색하기위한 것입니다. - 장착 매체의 드롭을 추가 DPBS 배에 씻어 커버 슬립을 배치하고 매니큐어와 가장자리를 밀봉.
- 40X mA에서 형광 현미경을 사용하여 L1의 레트로 트랜스 분석gnification.
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Representative Results
L1의 레트로 트랜스 벡터의 개략도는도 1에 제시되어있다. 벡터는 센스 방향의 글로빈 인트론에 의해 중단 및 SD 및 SA 사이트에서 끼워 L1의 ORF에 안티센스 방향 네오 마이신 유전자로 구성된다. 안정적으로 염색체에 통합하면, L1의 mRNA가 결합 된 CMV 및 L1-5'UTR 프로모터 (그림 1)에서 전사한다. RNA 프로세싱 동안에, 글로빈 인트론은 네오 마이신 유전자에서 접합된다. 신자유 L1 RNA는 패키지 전좌와 전체 길이 또는 절단 삽입 중 하나로 게놈에 통합되어 있습니다. 나타낸 바와 같이, L1은 접합의 레트로 트랜스 네오 마이신 (도 1)에 특이적인 프로브를 이용하여 FISH에 의해 추적 될 수있다.
도 2는 labele와 네오 마이신 프로브의 개략도를 도시d를 그 때문에 여기 파장의 차이로 크기와 결핍 형광 큰 프로브. CY3 및 FITC는 에티 디움 브로마이드 염색 DNA와 다른 파장에서 자극합니다.
2, 1 : 4, 1 : 8, 1시 16분 희석하고 10 배 배율에서 핵의 퍼짐의 밀도 분포와의 거리를 평가 각 확산 (중기 염색체 스프레드의 밀도는 (1)로 원래의 원액을 희석함으로써 결정되었다 도 3a). 결과뿐만 아니라, 균일하게 분포하고 잘 이격 퍼짐 (도 3A-III-IV), 덩어리의 높은 밀도를 보여 스프레드 (도 3A-I-II)를 아웃 버스트. 도 분포가 이후의 분석을 위해 선택되었다으로 낮은 밀도가 펼쳐집니다.
염색체 스프레드 훽스트 (Hoechst) 염료 및 확산 품질이의의 염색체의 길이, 원형에 기초하여 평가로 염색했다preads 간 염색체 거리 (그림 3B). 이 지표는 세포 colcemid, 저장성 용액 Carnoy 고착성 용액 및 / 또는 세포의 염색체를 분리하는 파열 된 방식으로 처리 된 시간의 길이에 의해 영향을 받았다. 세포를 저장성 용액의 단기간 배양하면 염색체 스프레드 단단히 매듭 개별 염색체 (도 3B-i)를 시각화하기 어려웠다되었다. 한편, 저장성 용액 이상 배양은 핵의 파열의 결과 염색체 산란 및 / 또는 염색체의 손실 (도 3B-Ⅱ). colcemid에서 긴 배양은 중기 세포의 수를 증가하지만 염색체의 응축으로 이어질 (그림 3B-III). 이와 같이, 좋은 품질의 염색체 스프레드는 colcemid 및 저장성의 KCl 용액 모두에서 최적의 배양 기간이 필요합니다. 37 저장성 용액 colcemid, 20에서 우리의 손에, 90 분 배양° C 및 셀 버스트 뜨거운 증기의 사용은 양질의 퍼짐 (도 3B-IV)의 생성을위한 최적의 조건 인 것으로 밝혀졌다.
염색체 스프레드는 L1의 레트로 트랜스가 SNeo을 대상으로 프로브를 사용하는 염색 하였다. 프로브는 두 경우 모두 L1의 레트로 트랜스은 야생형 (L1)를 발현하는 세포에서만 볼 수 있음을 보여 FITC와 CY3 모두 표시했다 (그림 4). 어떤 염색은 혼자 벡터 백본을 발현하는 세포에서 볼 수 없었다 (그림 4, 각각의 형광을 위해 상단과 하단 패널을 비교). 우리 손에 프로브 신호는 단일 레트로 트랜스 이벤트를 나타내는 신호를 압도적으로 핵 80-90 %가 검출되었다. 우리는 하나 이상의 삽입과 핵에 레트로 트랜스을 기록하고 확산 품질은 항상 FISH 전에 조사 하였다.
L1의 레트로 트랜스 벡터 그림 1. 도식 다이어그램.도 전체 또는 절단 L1 삽입을 선도 대상 주요 역 전사하는 과정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
SNeo 및 레이블이없는 네오 마이신 프로브 레이블 그림 2.. 표지 프로브는 적은 형광을 나타내는 및 레이블이없는 프로브에 비해 크기가 더 크다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3 단계 대비 (밝은 필드) 및 훽스트 얼룩 염색체 스프레드 그림. A) 스프레드의 희석이 잘 간격 준비를 얻을 보여줍니다. 스케일 바는 colcemid, 저장성 용액, Carnoy 정착액 솔루션 및 확산 품질에 분출의 영향을 보여주는 50 μm의. B) 훽스트 얼룩 염색체이다. 스케일 바는 10 μm의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
L1의 레트로 트랜스의도 4 FISH 분석. SNeo 염색은 대조군 세포에 존재하지만, L1의 야생형 벡터를 발현하는 세포에 존재한다. 스케일 바는 10 μm의입니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이러한 전체 게놈 시퀀싱, 역 PCR 및 남부 블롯 같은 방법론은 L1의 레트로 트랜스을 연구하기 위해 사용되어왔다. 이 방법은 L1 삽입은 게놈 내에서 발생하는 곳의 위치에서 매우 가치가 있지만, 그들 모두에 대한 혼란 문제는 순서를 재 조립하기에 실리 프로그래밍의 필요성이다. 여기에 설명 된 FISH 방법은 특히 배양 된 세포에서의 이소성 L1 레트로 트랜스의 분석을 요구하는 시험의 경우에는, 이러한 방법을 보충하도록 설계된다. 접근법은 레트로 트랜스 이벤트 양적 질적 평가를 위해 사용되는 핵 간기에 적용될 수있다. 이 방법론은 이소성 L1 삽입 부위 (16)를 결정하는데 사용 이후에 실리 서열 정렬 방법의 정확도를 제공합니다. 반복적 서열 정렬 의한 단독 중합체의 형성 모호 할 수있는 동안 반복 sequenCES는 반복 서열의 과소 대표 결과 템플릿의 프라이머 증폭 중에 손실 될 수 있습니다. FISH 프로브 단독 중합체로 어닐링 그대로 반복 서열 (16)에 대해 바이어스 될 수있는 가능성 때문에 FISH 방법은 이러한 문제점을 극복 할 수있다. 또한, 세포 배양 계 레트로 트랜스 분석법에 비해 FISH는 단일 핵 수준 레트로 트랜스 요금을 결정할 수있다. 이와 같이,이 방법은 아래와 같은 다수의 삽입은 하나의 핵 (16)에 발생할 수있는 레트로 트랜스 비율의 추정을 통해 모두 방지한다. NGS에서 얻은 최근의 데이터는 세포 배양 기반 방법론 레트로 트랜스 주파수 (25)을 과소 평가 것으로 확인되었습니다.
젊은 L1s 삽입하는 것을 선호하고, 대상기구가 게놈 내에서 이러한 삽입을 지시하는 존재하는지 여부 곳은 확실하지 않다. 위의 방법을 사용하여 우리는 L1 유전자 가난한 재에 우선적으로 삽입하는 것으로 나타났습니다게놈 (16)의 gions. 다른 사람은 L1 시퀀스의 풍부가 낮은 유전자 밀도 (17, 18)와 염색체의 증가가 있음을 보여 주었다. 함께, 이러한 연구 결과는 셀에 대한 위협은 게놈의 "낮은 활성"영역으로 L1의 삽입에 의해 최소화 삽입의 조정 모드를 제안한다. 낮은 생물에서 transposable 요소 움직임의 패턴이 해석에 지원을 빌려있다. 예를 들어, 분열 효모 레트로 트랜스포존, 건이 TF1, 유전자 프로모터의 상류의 시간의 95 %를 통합하고 이들 유전자의 대부분은 스트레스를 조절 (19, 20)에 포함된다. 질소에 대한 액세스 권한이없는 효모 세포에서 Ty5 대신 이질 염색질 영역 (21)의 개의 ORF로 통합합니다. 옥수수의 실험 트랜스포존 DNA의 통합 influen 밝혀졌다 잡 옥수수 컬러 표현형과 VvTFL1A 유전자의 프로모터 영역에 Hatvine1-RRM의 트랜스포존 DNA의 통합을 초래할 보여분기 패턴과 포도 22, 23의 열매의 크기를 CE.
여기에 설명 된 FISH 방법의 성공에 중요한 단계는 좋은 염색체 스프레드 적절한 라벨링, 정제 및 프로브의 하이브리드의 생성이다. 탐침이 적절하게 세정되지 않으면, 그 결과 높은 백그라운드 신호 어려운 염색체에 결합하는 프로브를 해결하게된다. 바람직하게는, 프로브는 젤 정제 된 dNTP에서 잔류 형광을 제거해야합니다. 또한, 스프레드 Carnoy 고착성 용액에 인큐베이션 시간의 길이는 양호한 염색체 스프레드을 준비하는 것이 중요하다. 너무 긴 경우, 세포막이 조기에 파열 염색체 손실이 발생할 수있다. 너무 짧은 경우에는 불충분하기 때문에, 막 파열 적합한 퍼짐을 얻기 어려울 수있다. 포름 아미드의 양 / 농도는 염색 분체의 초점을 결정하고, 따라서, 최상의 결과를 위해 경험적으로 최적화하는 것이 중요하다. 모든 세척은 ENS에 철저해야한다모든 언 바운드 프로브 및 이차 항체가 떨어져 세척 URE.
결론적으로 여기 기재된 FISH 방법은 모두 전체 길이 및 절단 이소성 L1의 레트로 트랜스 이벤트를 검출하는데 사용될 수 있고, 레트로 트랜스 표시기 카세트 등, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하여 다른 레트로 트랜스 벡터에 적용될 수있다. 전체 길이 L1 삽입이 방법을 사용하여 결정될 수 있지만 의한 게놈 내의 절두 L1의 수에 새로운 내인성 절단 삽입을 식별 할 것이다. 프로브의 접근성도 증가 이질 염색질 형성 16, 24에 의해 제한 될 수 있습니다. 그러나, FISH 프로브 내의 LNA의 포함은 프로브 어닐링을 강화하는데 이용 될 수있다. SNeo의 검출은 레트로 트랜스의 전체주기에 달려 및 / 삭제가 누락 될 수있는 프로브보다 작은 삽입.
whic에서 실험에 대한 자세한 설명발표에이 벡터의 사용과 L1 단백질과 레트로 트랜스의 표현이 특징 시간은, 12, 16 작동을 참조하시기 바랍니다.
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Disclosures
저자는 잠재적 경쟁 이익을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
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