Summary
Здесь мы используем методологию FISH для отслеживания LINE-1 ретротранспозиции на одном уровне ядер в хромосомных спредов клеточных линий HepG2 , стабильно экспрессирующих синтетический LINE-1.
Introduction
Человек Длинные перемежаются Ядерный элемент-1 (линия-1 или L1) представляет собой автономный подвижный элемент , который распространяется внутри генома через "копировать и вставить" механизм ретротранспозиции. Типичный человек L1 имеет длину ~ 6 кб и состоит из 5'UTR (Непереведенные область) , который служит в качестве промотора, две открытые рамки считывания (ORFs): L1 -ORF1 и L1 -ORF2 и 3'UTR с полиА . хвост L1 -ORF1 белок имеет три различных областях: доменное катушки катушки, РНК и распознавания Motif С-концевой домен, в то время как L1 -ORF2 белок имеет эндонуклеазы, обратной транскриптазы и цистеина богатые домены 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 проявляет деятельность нуклеиновой кислоты Chaperone, в то время как L1 -ORF2 обеспечивает ферментативную активность, с обоих белков , необходимых для ретротранспозиции 1,2,6.
Цикл L1 ретротранспозиции начинается с транскрипции от 5' - UTR L1 , L1 -ORF1 проявляет либо цис -связывающим , где пакеты свою собственную РНК или транс -связывающим , где пакеты других РНК (т.е., синусоида / СВА / Псевдогены) с образованием рибонуклеопротеиновый частицы (RNP) с L1 -ORF2p 7, 8. Рибонуклеопротеиды транслокации в ядро , где эндонуклеаза активность L1 -ORF2p зарубок геномную ДНК (GDNA) , чтобы разоблачить ОН - группа 9, что в свою очередь , используется обратной транскриптазы для простого и обратного синтезировать РНК в ДНК с 3' - конца. Во время обратного синтеза, вторая цепь ДНК порезал 7-20 пар оснований от исходного сайта нику , чтобы создать в шахматном порядке перерывы , которые заполнены для формирования подписи вставки L1 последовательности (например, TTTTAA) называется дупликации целевой сайт (ТСД) 9,10. Этот процесс известен как целевой Prime обратной транскрипцией (TPRT) и приводит к insertiна полных или усеченных копий L1 / других ДНК с TSDs на обоих концах вставленной последовательности. L1 ретротранспозиции также было показано, опосредовано через TPRT типа негомологичный конечного присоединения в некоторых типах клеток 11.
Вектор L1 ретротранспозиции используется в наших исследованиях является неэписомные и состоит из маркированного L1 -ORF1 & 2р движимый комбинированных ЦМВ-L1-5'UTR промоутеров (рис 1) 12. Более ранние версии этой конструкции были описаны в исследованиях с использованием дрожжей и клеточных культур человека 13,14,15. Два различных CMV промоторы, расположенные на 5 'и 3'-концы вектора, с 3'-конец помещен в обратной ориентации по отношению к управлению экспрессией неомицина после сращивания и интеграции. Кассета индикатор ретротранспозиции на 3' - конце состоит из ген неомицина вставляется антисмысловой по отношению к L1 -ORFs и приведены в нерабочее состояние путем разделения на две половины Глобв интроне с сращивания донора (SD) и сращены акцептор (SA) участки (рисунок 1). После интеграции в хромосому, L1 , транскрибируется из общего промотора для получения мРНК , которая состоит из бицистронной мРНК , так и неактивный неомицина мРНК. Во время обработки РНК, глобина интрон сращены из гена неомицин, чтобы восстановить полностью функциональный ген неомицина. Гибридный мРНК упаковывается в РНП в цис и транслокации в ядро , где он встроен в геном либо как полной длины или усеченных вставок с использованием TPRT.
Здесь мы опишем методологию , которая использует флуоресценции в гибридизация (FISH) с зондами , специально направленных на сращивания геном неомицин (SNeo) , чтобы отслеживать L1 -retrotransposiition модели и скорости вставки на одном уровне ядра. Эффективность и специфичность обнаружения была подтверждена с использованием ретротранспозиции компетентных и некомпетентных конструкции и зонды опрЭСТ SNeo или неомицин и глобина интрона 16. Эта методология учитывает некоторые из недостатков ретротранспозиции анализов на основе клеточных культур, таких как множественные вставки, сопротивление колонии и благоприятного расширения клона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Все шаги должны быть выполнены при комнатной температуре, если не указано иное. Пожалуйста, обратитесь к разделу Реагенты для подробной информации о том, как подготовить отдельные реагенты.
1. Маркировка L1 Зонды
ПРИМЕЧАНИЕ: Зонды могут быть помечены с помощью химического или ПЦР-маркировки.
- Химическая маркировка
- Сделать 0,7-1% -ном агарозном геле в трис-ацетат-ЭДТА (ТАЕ) буфера, тепла в микроволновой печи до тех пор, пока расплавится, дайте гелю остыть, а затем добавляют этидий бромид (0,5 мкг / мл). Налейте в лоток гель, добавьте гребешки и дайте гелю затвердевать при комнатной температуре.
- Этикетка зонда SNeo (1-2 мкг) с Су3 или FITC при 37 ° С в течение 1 ч в соответствии с протоколом производителя.
Примечание: SNeo обозначает S pliced Neo ген Mycin , выраженное после полного цикла ретротранспозиции. Зонд ~ 1000 п.о.. SNeo может быть ПЦР-амплификации из любого вектора или из геномаIC ДНК. См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о стрептавидин-Cy3 / FITC маркировки реагентов. - Смешать раствора меченого зонда SNeo с погрузкой ДНК 1x буфер, загрузку в каждую лунку и работать на 75-100 вольт в течение 15-20 мин.
- Визуализируйте группу зонда с использованием ультрафиолетового (УФ) осветитель. Обратите внимание , что размер зонда SNeo можно регулировать и блокировки ядра кислоты (МШУ) , могут быть также добавлены (рисунок 2).
- Вырезать меченый зонд SNeo из геля с чистым лезвием, растворять и очистить зонд SNeo из геля с использованием набора для ПЦР-Clean-Up в соответствии с протоколом производителя.
ВНИМАНИЕ: Крышка каждый открытая часть тела с защитными экранами (т.е. лабораторный халат и УФ - прозрачного маски для лица) при просмотре и резки геля. Таблицу материалов и реагентов для получения информации в гель очистки продуктов ПЦР. - Повторно пробежать 5 мкл SNeo меченным зондом с ООН-меченых SNeo зонда на агарозном геле 0,7% (см 1.1.1) для конразмер фирмы увеличение и потеря интенсивности сигнала (рисунок 2).
- Количественную оценку количества меченого зонда SNeo путем измерения оптической плотности при 260 нм и разбавить зонд SNeo до 10 нг / мкл аликвоты в нуклеазная свободной H 2 O. Храните аликвоты при -20 ° C.
- ПЦР Этикетировочное (Альтернативный способ маркировки зонда)
- Объединить SNeo специфических праймеров (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'и 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') с ПЦР - реагентов в одну пробирку: 13,6 мкл нуклеазная свободной H 2 O; 0,1 мкл дАТФ, дЦТФ, дГТФ (10 нМ); 0,05 мкл дТТФ (10 нМ); 0,05 мкл дУТФ-биотин / дУТФ-ФИТЦ / Су3 (10 нМ); 4 мкл Go Tag 5х буфера; 0,4 мкл Go Tag полимеразу; 1 мкл шаблон SNeo (10 нг). См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о реагентов для ПЦР.
- Регулировка количества каждого реагента путем умножения на общее количество образцов.
- Используйте следующий ПЦР параметр велосипедныйs для усиления и этикеток SNeo зондов: 95 ° C в течение 2 мин; 35 циклов при 95 ° С в течение 30 сек, 62 ° C в течение 30 сек, 72 ° С в течение 60 сек; 72 ° С в течение 2 мин; Держите при температуре 4 ° С до бесконечности.
Примечание: Температура отжига может быть отрегулирована или градиент ПЦР может быть завершен, чтобы определить оптимальные температуры отжига для других зондов. - Сделать 0,7-1% геля, как и в разделе 1.1.1, нагрузки и визуализировать полосу зонда, как в разделе 1.1.4.
- Вырезать и очистить меченый зонд SNeo, как и в разделе 1.1.5.
- Повторно пробежать 5 мкл SNeo меченным зондом с ООН-меченых SNeo зонда для подтверждения увеличения размеров и потерю интенсивности сигнала (см рисунок 2).
- Количественную оценку количества меченого зонда SNeo путем измерения оптической плотности при 260 нм и разбавьте SNeo зонд до концентрации 10 нг / мкл аликвоты в нуклеазная свободной H 2 O.
2. Подготовка спреды Хромосомные
- Создавать стабильные клоны, экспрессирующие вектор позвоночника (CONTROл) или ретротранспозиции компетентен L1 с использованием стандартных методик отбора. 12,16 В то время как неэписомальные репортеры были использованы для корреляции результатов с исследованиями транскрипции, могут быть также использованы векторы эписомные. Рост клеток , стабильно экспрессирующие контроль или L1 вектор (1 × 10 6 клеток на 10 см пластины, скорректированные размером пластины , изготовленной по мере необходимости) в полной среде роста. Для клеток HepG2, используют RPMI-1600, 10% FBS и 200 мкг / мл гигромицину. Grow культур до 70% слияния при 37 ° С и 5% СО 2.
Примечание: Выбор среды для роста, зависит от типа клеток. Учитывая, что Плазмиды, используемые здесь, несут кассеты отбора как гигромицину и неомицина, стабильный отбор клонов, также может быть сделано с неомицин после выбора на гигромицину, но количество неомицина должен быть оптимизирован, чтобы установить уровни допустимых отклонений для каждого типа клеток. - Добавить колцемид (0,4 мкг / мл) в культуральной среде и инкубировать в течение 90 мин, чтобы арестовать клетки в metaphаза. При использовании различных типов клеток, определяют оптимальную концентрацию колцемид и времени воздействия (60, 90 и 120 мин) для оптимального метафазы задержания эмпирически.
- Промыть клетки 2 раза с 10 мл PBS 1X Дульбекко (DPBS), Trypsinize добавлением 3-5 мл 0,25% раствора трипсина в клетки и инкубируют в течение 5 мин, чтобы отделить клетки. Деактивировать трипсина с равным количеством среды, содержащей 10% FBS.
- Центрифуга клетки в течение 2 мин при 1000 х г при температуре 4 ° С, аспирация среды от осадка клеток и промыть клетки с ДЗФР. Вытяжку все DPBS, оставляя 200 мкл ДЗФР повторно приостанавливать клетки. Обеспечение клетки смешивают хорошо и что все комки рассеяны. Используйте мерцающий или осторожно пипеткой, чтобы смешивать и дисперсных сгустки и избегать встряхиванием.
- Добавьте 5 мл гипотонический раствор (то есть, 75 мМ КСl) , который предварительно нагревают до 37 ° С по каплям при вращении 15 мл трубки в горизонтальном направлении и инкубировать при 37 ° С в течение 20 мин. Таблицу материалов и ReageNTS для получения информации о том, как получить и гипотонический раствор.
- Центрифуга клетки при 120 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С и повторите шаги 2.4 - 2.5 3x оставляя приблизительно 200 мкл гипотонический раствор повторно суспендирования клеток после каждой промывки. Убедитесь, что в конце 3-х промывок осадок заметно белый и опухшие.
- Повторное приостановить осадок в 200 мкл раствора Карной Fixative и сделать 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 разбавление в растворе Карной Fixative. Оставьте 10 мкл каждого разведения на сухую чистую горкой от приблизительно 1 см выше и сразу же выставить распространение свободной стороной к горячим паром от кипящей воды в течение 30 сек. См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о том, как сделать решение Карной закрепителем.
- Сушат спреды при комнатной температуре, пятно с 0,1 мкг / мл Hoechst-33342 погружением в воду в течение 15-20 мин в Коплин Jar и мыть 3x с ДЗФР. См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о том, как сделать решение Hoechst-33342. <LI> Просмотр распространяется на флуоресценцию / фазоконтрастного микроскопом при 40-кратном увеличении. После оптимизации подготовки распространения, спреды не должны быть окрашены Hoechst-33342. Просмотр распространяется на фазово-контрастным микроскопом при 10 - кратным увеличением для определения распространения качества и разделения , как это описано в разделе Результаты (смотри рисунок 3).
- Выбрать и обвести хорошие спреды с маркера точки алмазом на противоположной стороне затвора (т.е. распространяться свободной сторона).
- Магазин распространяется при -20 ° С в течение до одного месяца. Избегайте воздействия влаги.
3. флуоресценцию в гибридизация (FISH)
- Стабилизирующие и дегидратацией спреды
Примечание: Равновесие метафазы хромосома распространяется до комнатной температуры при хранении при температуре -20 ° C. См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о том, как получить и реагенты.- Выдержите метафазы хромосомы распространяется с 200 мкл РНКазы А для1 час при температуре 37 ° С.
- Мытье скользит в 2х SSC-буфером дважды в течение 5 мин каждый с последующей промывкой 10 мМ раствором HCl.
- Выдержите спреды с добавлением 1% пепсина в течение 10 мин при температуре 37 ° С, промывают деионизированной H 2 O и дважды промывали 2Х SSC буфером в течение 5 мин каждый.
- Выдержите спреды 4% параформальдегидом в течение 10 мин и моют в 2 x SSC буфера в два раза в течение 5 мин каждый.
- Обезвоживают распространяться путем инкубации в течение 2 мин в серии этанола: 70%, 80% и 95% этанола.
- Воздушно-сухой слайдов.
- Гибридизация раздвигает с L1 меченных ретротранспозиции зондов (т.е. SNeo)
ВНИМАНИЕ: Для прямых меченных зондов, держаться подальше от света во все времена. См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о том, как получить и реагенты.- Добавьте 30 нг SNeo гибридизации буфера, нагревают при 72 ° С в течение 10 мин и охладить в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Добавить 30 мкл раствора зонда SNeo на еACH спрэд, крышка с покровное и запечатать края с резиновым клеем. Убедитесь в отсутствии образования пузырьков.
- Нагреть скольжение при 72 ° С в течение 5 мин на тепловом блоке, постепенно понизить температуру до 37 ° С, и инкубировать в течение ночи в темной увлажненной камере при 37 ° С.
- Стиральная и просмотр (или добавление вторичного антитела)
ВНИМАНИЕ: Для прямых меченных зондов, держаться подальше от света во все времена.
ПРИМЕЧАНИЕ: См Таблицу материалов и реагентов для получения информации о том, как подготовиться. Использование достаточного объема, чтобы охватить весь разброс хромосом рекомендуется. Следует помнить, что избыточный объем будет потеряна при добавлении покровное.- Погрузитесь слайдов в буфер 2x SSC для удаления покровные.
- Промыть слайды путем погружения в 2х SSC-буфере при 45 ° С в течение 5 мин.
- Промыть слайды путем погружения в промывном буфере при 45 ° С в течение 5 мин, 2 раза.
- Промыть слайдов путем погружения в 0.1x SSC буфере при 45 ° С в течение 10 мин.
- Промыть слайды путем погружения в 2Х SSC буфере при 45 ° С в течение 10 мин.
Примечание: Поместите Jar Коплин, содержащий рекомендованный буфер на водяной бане, регулировать температуру до 45 ° C. - Классные слайды до комнатной температуры и уравновешивания слайды в буфере обнаружения.
- Для прямых меченых зондов, перейдите к шагу 3.4.10.
- Для непрямых меченых зондов, блок в блокирующем буфере в течение 20-30 мин и промойте 3 раза в ДЗФР.
- Инкубируют 50 мкл вторичного антитела (например, 5 мкг / мл стрептавидин-FITC или αCY3 в блокирующем буфере) в течение 1 ч.
- Вымойте слайды в 2х SSC в течение 5 мин дважды.
- Проводят контрастное с Hoechst-33342 раствором (0,1 мкг / мл) в течение 10 мин.
Примечание: это окрашивание делается для окрашивания хромосом для совместной локализации с зондом. - Стирать в DPBS 3x, добавить каплю монтажной среды, поместите покровное и запечатать края с лаком для ногтей.
- Анализ L1 ретротранспозиции с помощью флуоресцентного микроскопа в 40х маgnification.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Принципиальная схема ретротранспозиции вектора L1 представлена на рисунке 1. Вектор состоит из неомицину гена в антисмысловой ориентации на L1 ORF , которая прерывается глобина интрона в смысловой ориентации и зажат SD и SA сайтов. Когда стабильно интегрирована в хромосому, мРНК L1 транскрибируется с комбинированной ЦМВ и L1-5'UTR промотор (рисунок 1). Во время процессинга РНК, глобина интрон сплайсируется из геном неомицин. L1 РНК упакована Нео, транслокация и интегрированы в геном либо в виде полной длины или усеченного вставки. Как указано, L1 ретротранспозиции можно отслеживать с помощью FISH с использованием зондов , специфичных для сращивания неомицина (рисунок 1).
На рисунке 2 показано схематическое изображение неомицин зонда, с этикетокd зондировали, что больше по размеру и флуоресценции с дефицитом из-за различий в длинах волн возбуждения. Обратите внимание, что Cy3 и FITC возбуждают на разных длинах волн, чем бромистым этидием, окрашенном ДНК.
Плотность метафазных хромосом спредов определяли путем разбавления исходного сырья в раствор 1: 2, 1: 4, 1: 8 и 1:16 разбавление и каждый разброс оценивали по плотности, распределения и расстояния спредов от ядра при 10-кратным увеличением ( Рисунок 3А). Результаты показывают высокую плотность, массивно и выпалил спреды (рис 3А-I-II), а также равномерно распределены и хорошо разнесены спреды (фиг.3А-III-IV). Низкая плотность распространяется с равномерного распределения были выбраны для последующего анализа.
Хромосомные спреды окрашивали качество красителя и распространение Hoechst оценивали на основе длины хромосом, округлость сpreads и между хромосома расстояние (рис 3B). Эти показатели были под влиянием продолжительности времени клетки обрабатывали колцемид, гипотонический раствор, раствор Карной Fixative и / или способа, в котором клетки лопнул выпустить хромосомы. Если клетки инкубировали в течение короткого периода времени в гипотонический раствор, хромосомные спреды стали плотно зажимали и отдельные хромосомы было трудно представить себе (фигура 3В-I). С другой стороны, больше инкубацию в гипотонический раствор приводило к разрыву ядер, рассеивающих хромосом, и / или потеря хромосом (фигура 3В-II). Более длинные инкубирование в колцемид увеличил число клеток в метафазе, но приводят к конденсации хромосом (рис 3B-III). Таким образом, хороший разброс качества хромосома требует оптимальные периоды инкубации в обоих колцемид и гипотонического раствора хлорида калия. В наших руках, 90 мин инкубирование в колцемид 20, в гипотоническому растворе при 37Были обнаружены ° С и использование горячего пара дл разрыва клеток , чтобы быть оптимальные условия для получения больших спредов качества (фигура 3В-IV).
Хромосомные спреды окрашивали для L1 ретротранспозиции с использованием зондов , которые предназначаются для SNeo. Зонд метили как FITC и Су3 , чтобы показать , что в обоих случаях L1 ретротранспозиции наблюдается только в клетках , экспрессирующих дикого типа L1 (Рисунок 4). Ни один окрашивание не было обнаружено в клетках , экспрессирующих вектор позвоночник в покое (рис 4; сравнить верхнюю и нижнюю панели для каждого флуорофора). В наших руках, зондирующий сигнал был обнаружен в 80-90% ядер, с подавляющим большинством сигнала, представляющего одиночные ретротранспозиции события. Мы только забил ретротранспозиции в ядрах с более чем одной вставки и качество распространения всегда обследованы до FISH.
Рисунок 1. Принципиальная схема ретротранспозиции вектора L1. Диаграмма изображает процесс целевого простого обратной транскрипции , приводящей к полной или усеченной L1 вставках. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Маркированный SNeo и немаркированные неомицин зондов. Меченый зонд имеет меньшую флуоресценцию и больше по размеру по сравнению с немеченого зонда. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. фазового контраста (светлое поле) и Hoechst пятно хромосом спреды. A) Показывает разведение спредов для получения хорошо разнесенные препаратов. Шкала бар составляет 50 мкм. В) Hoechst пятно хромосомы , показывающий влияние колцемид, гипотонический раствор, раствор Карной Fixative и разрывной по качеству распространения. Шкала бар составляет 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. FISH анализ L1 ретротранспозиции. Окрашивание SNeo отсутствует в контрольных клетках, но присутствует в клетках , экспрессирующих дикого типа вектора L1. Шкала бар составляет 10 мкм.Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методологии , такие как целого генома, обратной ПЦР и Саузерн - блоттинга были использованы для изучения L1 ретротранспозиции. Хотя эти методики являются чрезвычайно ценными в поиске , где L1 вставки происходят в геномах, Поразительным вызов для всех из них является необходимость в-силикомарганца программирования повторно собрать последовательности. Методика FISH , описанная здесь, предназначена , чтобы дополнить эти методы, особенно в случае исследований , требующих анализа внематочной ретротранспозиции L1 в культивируемых клетках. Такой подход может быть использован как для количественной и качественной оценки ретротранспозиции событий и применительно к интерфазных ядрах. Эта методика имеет точность последующих методов выравнивания последовательностей в-силикомарганца , используемых для определения внематочной вставки участков L1 16. Выравнивание повторяющихся последовательностей может быть неоднозначной из-за образования гомополимеров, в то время как повторяющиеся sequenКЕС могут быть потеряны во время праймера амплификации матрицы, что приводит к недопредставленностью повторяющихся последовательностей. Методология FISH может преодолеть эти проблемы , поскольку FISH зонды могут отжигать к гомо- и вряд ли будут настроены против интактных последовательностей повторяющихся 16. Кроме того, по сравнению с ретротранспозиции анализа клеточной культуры на основе, FISH можно определить цены ретротранспозиции на одном уровне ядра. Таким образом , этот подход не позволяет одновременно под и над оценкой ставок ретротранспозиции как множественные вставки могут произойти в отдельных ядрах 16. Последние данные , полученные из NGS подтвердили , что методологии , основанные клеточных культур недооценивают ретротранспозиции частот 25.
Остается неясным , где молодые L1s предпочитают вставлять и существует ли механизм ориентации , чтобы направить эти вставки в геном. Используя описанную выше методику , мы показали , что L1 вставляет преимущественно в геном бедных повторнорегионов генома 16. Другие показали , что обилие последовательностей L1 является увеличение хромосом с меньшей плотностью генов 17,18. В совокупности эти данные позволяют предположить , регулируемый режим вставки , где угрозы клетки минимизируются путем вставки L1 в "менее активных" областей генома. Характер движения транспозируемого элемента у низших организмов оказала поддержку этой интерпретации. Например, делящихся дрожжей ретротранспозон, TF1, объединяет 95% времени перед промоторов генов и большинство из этих генов участвуют в регуляции стресса 19,20. В клетках дрожжей , которые не имеют доступа к азоту, Ty5 интегрируется в ORF , вместо гетерохроматиновых регионов 21. Эксперименты в кукурузы показали , что интеграция ДНК - транспозонов приводят к пестрых кукурузы цвета фенотипов и интеграции ДНК транспозонов Hatvine1-Rrm в промоторной области гена VvTFL1A Было показано , что influenсе ветвящиеся рисунок и размер плодов виноградной лозы 22,23.
Шаги, имеющие решающее значение для успеха методологии FISH подробно здесь поколение хороших хромосом спредов и надлежащей маркировки, очистки и гибридизации зондов. Если зонды не очищаются должным образом, в результате высокого фонового сигнала будет трудно разрешить связывание с хромосомами зонда. Предпочтительно, зонды должны быть очищали на геле, чтобы исключить остаточную флуоресценцию из дНТФ. Кроме того, продолжительность времени, спреды инкубируют в растворе Карной Fixative важно подготовить хорошие хромосомные спреды. Если слишком долго, клеточная мембрана может взорваться преждевременно и привести к потере хромосом. Если слишком мало, это может быть трудно получить подходящие спреды из-за недостаточного разрыва мембраны. Величина / концентрация формамида определяет концентрацию хроматидах и поэтому важно, чтобы оптимизировать опытным путем для достижения наилучших результатов. Все смывки должны быть тщательным в епзЮр, что все несвязанные зонды и вторичные антитела смываются.
В заключение отметим , что методология FISH описанная здесь может быть использован для обнаружения как во всю длину и усеченные эктопические L1 ретротранспозиции события и могут быть применены к другим векторам ретротранспозиции с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве индикатора ретротранспозиции кассеты. Несмотря на то, полная длина L1 инсерций может быть определено с помощью этой методики, она не будет распознавать новые эндогенные усеченные вставки из - за количества срезанных L1 s внутри генома. Доступность зонда также может быть ограничено путем образования Увеличение гетерохроматина 16,24. Тем не менее, включение МШУ в FISH зондов могут быть использованы для усиления зонда отжига. Обнаружение SNeo будет присвоен после полного цикла ретротранспозиции и вставок меньше зонда / удаления могут быть пропущены.
Подробное описание экспериментов в whicч использование этих векторов и экспрессию L1 белков и ретротранспозиции характеризуются, пожалуйста , обратитесь к опубликованных работ 12,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют нет потенциальных конкурирующих интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
- Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
- Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87, 905-916 (1996).
- Clements, A. P., Singer, M. F. The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).
- Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).
- Khazina, E., et al. Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition. Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).
- Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).
- Martin, S. L. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).
- Hohjoh, H., Singer, M. F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639 (1996).
- Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).
- Szak, S. T., et al. Molecular archeology of L1 insertions in the human genome. Genome Biol. 3, (2002).
- Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).
- Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1. Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).
- Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell. 40, 491-500 (1985).
- Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses. PNAS. 85, 2219-2223 (1988).
- Moran, J. V., et al. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87, 917-927 (1996).
- Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13. Genomics. 104, 96-104 (2014).
- Rozen, S., et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Nature. 423, 873-876 (2003).
- Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. How the gene content of human sex chromosomes evolved. Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).
- Leem, Y. E., et al. Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators. Mol Cell. 30, 98-107 (2008).
- Guo, Y., Levin, H. L. High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe. Genome Res. 20, 239-248 (2010).
- Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin. Mol Cell. 27, 289-299 (2007).
- McClintock, C. B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).
- Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine. Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).
- Garcia-Perez, J. L., et al. Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells. Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).
- Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma. Nat Med. 21 (9), (2015).
