머리와 목 편평​​ 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

요약

종양 재발과 치료에 대한 내성에서 암 줄기 세포의 역할을 이해하는 것은 지난 10년 동안 큰 관심사가 되었습니다. 이 논문은 두경부 편평 암종 세포주(HNSCC)에서 암 줄기 유사 세포의 하위 집단의 분리 및 특성화에 대해 설명합니다.

초록

두경부 편평 상피 세포 암 (HNSCC) 진행에 대한 이해의 진보에도 불구하고, 5 년 생존율 인해 국소 재발 및 원격 전이 낮은 유지된다. 이러한 재발을 설명하기위한 하나의 가설은 고유의 화학 치료 및 전파 저항을 제시 암 줄기 유사 세포 (CSC 추가)의 존재이다. 새로운 치료 전략을 개발하기 위하여, 표적 치료의 효과를 검증 실험 모델을 가지고 있으므로 된 CSC의 동정 및 분리를위한 신뢰성있는 방법이 필요하다. 이를 위해 정렬 형광 활성화 된 세포에 의해 수행되는 연속 된 두 셀 sortings (FACS)의 조합에 의존 HNSCC 인간 세포주에서 CSC 추가의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 첫 번째는 다른 사람의 사이에서 제외 따라서 카세트 (ABC) 트랜스 포터 단백질을 ATP가-바인딩 및 과발현하는 암줄 기세포의 특성을 기반으로, 같은 헥스 33342. 세포 같은 중요한 DNA 염료 번째로 정렬방법은 "측면 인구"(SP)로 식별됩니다. SP에 세포가 낮은 비율 부​​모 세포 (<5 %)을 나타내는 바와 같이, 성장 단계는 제 2 셀 정렬 전에 수를 증가시키기 위해 필요하다. 다음 단계는 두 HNSCC 줄기 세포 특성은 세포 표면 마커 CD44 ^(고 CD44) 및 알데히드 탈수소 효소의 과발현 (ALDH ^높음)의 높은 발현 수준을, 즉 보유 세포의 선택을 허용한다. 단일 마커의 사용 된 CSC, SP의 조합의 분리 수많은 제한 및 함정을 갖기 때문에, CD44 및 ALDH 마커는 생존 세포를 필요로 상기 분석 및 기능 분석을위한 된 CSC를 분리하는 유용한 도구를 제공 할 것이다. 암줄 기세포의 줄기 같은 특성은 마지막으로 tumorispheres의 형성과 β-catenin의 발현에 의해 시험 관내에서 확인되었다.

서론

머리와 목 편평​​ 세포 암 (HNSCC)는 전 세계 공통의 악성 종양이며, 현재 치료의 발전에도 불구하고, 고급 질환 환자는 예후가있다. 환자의 전체 5 년 생존율은 수술, 화학 - 방사선 요법 - 및 대상을 포함한 치료 적 접근법의 조합에도 불구하고 약 30 %이다. 최근의 연구는 항암 치료 ^한 다음 암 줄기 같은 세포의 생존 (암줄 기세포)에 국소 재발과 원격 전이 때문이다. 유방, 뇌, 전립선, 폐, 결장, 췌장, 간, 피부 ^2- 등 다양한 고형 종양 줄기 세포 특성 (미분화 상태,자가 재생과 분화 능력 및 텔로 머라 제 활성)을 제시 세포의 존재를지지 축적 증거가있다 ^10. 그러나, 암줄 기세포의 기원은 ^{11, 12} 불분명 남아 있습니다. 그들은 정상적인 줄기 세포 ^3,13 또는 dedifferen의 악성 변환으로 인해 발생할 수있는암줄 기세포와 같은 기능 ^{14, 15를} 취득 종양 세포의 tiation. 따라서 암줄 기세포에 관한 독특한 경로를 이해하는 것은 조기 진단과 저항 HNSCC의 치료에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다.

된 CSC는 종양 세포 ^16-19의 부피에 비해 종양의 재발을 초래....

프로토콜

모든 동물 절차는 동물 보호의 로컬 가이드 라인에 따라 수행 하였다. 이 연구의 모든 세부 사항은 CECCAPP, 프랑스 윤리위원회에 의해 승인되었다.

훽스트 (Hoechst) 염료 유출 분석에 의한 측면 인구 (SP) 1. 선택

1. 훽스트 33342 염료로 5 천만 세포를 염색.
   1. 한 "훽스트 (Hoechst)"라는 레이블이 붙은 튜브와 "훽스트 및 베라파밀"로 표시 한 두 개의 15 ml의에게 원뿔 바닥 멸균 튜브를 준비합니다. 멸균 5mm의 베라파밀 히드로 클로라이드 용액 10 ㎖를 준비한다. 줄기 세포 배양 배지 (CM)을 준비한다.
      1. 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) : F12 (1 : 3, V : V) 하이드로 코르티손의 소 태아 혈청, 5 % (FCS), 0.04 ㎎ / ℓ CSC (CM-CSC)에 대한 CM을 제조하기 위해, 다음과 결합 페니실린 100 U / ㎖, 0.1 g / L의 스트렙토 마이신, 및 표피 성장 인자 (EGFR) 20 μg의 / L.
   2. 층류 후드에서 세포를 Trypsinize. 의 세척, 용지를 제거terile 인산 완충 식염수 (PBS)와 75 cm² 플라스크에 대한 트립신 EDTA 1 ㎖ (0.5 g / L)를 추가합니다. 37 ° C에서 3 ....

결과

HNSCC 셀 라인에서 암줄 기세포의 분리 때문에 부모 세포주에서 암줄 기세포의 매우 낮은 비율의 두 개의 연속 정렬이 필요합니다. 첫 번째 분류는 약물 유출 수송에 의한 훽스트 (Hoechst) 염료를 제외 할 암줄 기세포의 능력에 근거했다. 이 분류 전체 세포 인구 (그림 1) 1-5 %를 인수 결과. 의 Hoechst 염색 부정적인 셀 정렬하는 동안, SSC-A 도트 플롯 (그림 1A) 대 FSC-A를보고 크기와 정렬 세포의 과립을 확인합니다. 그리고, 인구 P1 (도 1b)를 SSC-H 도트 플롯 대 SSC-W를 사용하여 선택하여 이중선 및 세포 파편을 식별. 이 P1 인구에서 훽스트 블루 도트 플롯 대 헥스 레드-A를 만듭니다. "훽스트 (Hoechst)"라는 레이블이 붙은 튜브로, SP는 주요 세포 인구 (그림 1C)에서.......

토론

이 프로토콜은 다른 HNSCC 세포주에 적용되는 특정 세포주에서 CSC 추가의 성공적인 분리를위한 신뢰성있는 방법을 설명한다. 격리 된 머리와 목 암줄 기세포는 면역 결핍 마우스 ^(19)에 이식하여 체외 및 기능 검증에 더 분자 특성화 다음에 적합하다. 그러나 일부 수정 측면 인구 또는 부모 세포주에 존재하는 CD44 ^고 / ALDH ^높은 비율에 따라 테스트 할 수 있습니다. 사이드 인구 세포의 비율이 특정 세포주에서 너무 낮은 경우, 예를 들어, CD44 ^고 / ALDH ^높은 분류를 직접 수행 할 수있다. 본 연구에 사용 된 마커는 CD133 CD10 ^{고 (34)} 또는 ^{(35)로 높은} 세포주에 적합한 다른 마커에 의해 연구 대체 될 수있다.

이 프로토콜은 두 개의 셀 sortings에 기초한다. SP + C.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
태아 송아지 혈청 골드	GE 헬스케어	A15-151
하이드로코르티손 수용성	시그마-알드리치	H0396-100MG
페니실린/스트렙토마이신 100x	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 너트 믹스 (1x) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	용액은 매우 불안정하기 때문에 사용 직전에 준비해야 합니다
Heparin	StemcellTM Technologies	7980
B-27 Supplement (50x), 비타민 A 제외	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	부식성, 급성 독성 (경구, 피부, 흡입) 카테고리 4
베라파밀 염산염	Sigma-Aldrich	V-4629	급성 독성(경구, 진피, 흡입) 범주 3
Propidium	Iodide Sigma-Aldrich	P4170	급성 독성(경구, 진피, 흡입) 범주 4
ALDEFLUOR Kit	Stem Cell	1700
CD44-APC, 인간 항체	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC, 인간 항체	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1 쿨터 입자	벡크만 쿨터	6605698
광학 현미경	올림푸스	CKX31
SQ20B 세포주	존 리틀의 선물 s	Laboratory-FaDu
세포주	ATCC	HTB-43
저 앵커리지 플레이트	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDiva 소프트웨어 v8.0.1	BD Biosciences	-