Abstract
Trods fremskridt i forståelsen af hoved og hals planocellulært karcinom (HNSCC) progression, de fem-års overlevelse fortsat er lav på grund af lokalt recidiv og fjernmetastaser. En hypotese for at forklare denne gentagelse er tilstedeværelsen af cancer stamceller-lignende celler (CSCS), der præsenterer iboende kemo- og radio-resistens. For at udvikle nye terapeutiske strategier, er det nødvendigt at have forsøgsmodeller, der validere effektiviteten af målrettede behandlinger og dermed at have pålidelige metoder til identifikation og isolering af CSCS. Til dette formål præsenterer vi en protokol til isolering af CSCS fra humane HNSCC cellelinier, der bygger på en kombination af to på hinanden følgende celle sorteringer udført af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). Den første er baseret på ejendom CSCS at overudtrykke ATP-bindende kassette (ABC) transportproteiner og dermed udelukke bl.a. vitale DNA farvestoffer såsom Hoechst 33342. Cellerne sorteres med ther metode er identificeret som en "side population" (SP). Da SP-celler udgør en lav procentdel (<5%) af parentale celler, en voksende fase er nødvendig for at øge deres antal, før den anden cellesortering. Det næste trin muliggør selektion af celler, der besidder to andre HNSCC stamcelle egenskaber, dvs. højt ekspressionsniveau af celleoverflademarkør CD44 (CD44 høj) og overekspression af aldehyddehydrogenase (ALDH høj). Da anvendelsen af en enkelt markør har mange begrænsninger og faldgruber til isoleringen af CSCS, kombinationen af SP, vil CD44 og ALDH markører tilvejebringe et nyttigt værktøj til at isolere CSCS for yderligere analytisk og funktionelle assays, der kræver levende celler. Stamme-lignende karakteristika CSCS blev endelig valideret in vitro ved dannelse af tumorispheres og ekspressionen af β-catenin.
Introduction
Hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) er en almindelig malignitet verdensplan og trods fremskridt i de nuværende behandlinger, patienter med fremskreden sygdom har en dårlig prognose. Den samlede fem år overlevelsesraten for patienten er omkring 30% på trods af en kombination af terapeutiske tilgange, herunder kirurgi, kemo-strålebehandling og målrettede-behandlinger. Nylige undersøgelser tilskriver lokalt recidiv og fjernmetastaser til overlevelse cancer stamceller-lignende celler (CSCS) efter anticancer behandlinger 1. Der er akkumulerende beviser for eksistensen af celler der præsenterer stamceller egenskaber (udifferentieret status, selvfornyelse og differentiering kapacitet, og telomerase-aktivitet) i forskellige solide tumorer, herunder bryst-, hjerne, prostata, lunge, tyktarm, bugspytkirtel, lever og hud 2- 10. Men stadig oprindelsen af CSCS uklar 11,12. De kan skyldes den maligne transformation af normale stamceller 3,13 eller dedifferentiation af tumorceller, der erhverver CSCS-lignende funktioner 14,15. Derfor forståelse karakteristiske veje vedrørende CSCS vil give indblik i tidlig diagnosticering og behandling af resistente HNSCC.
Det er blevet foreslået, at CSCS også besidder resistente fænotyper der omgår standard kemoterapi og strålebehandling, resulterer i tumor tilbagefald i forhold til hovedparten af tumorceller 16-19 og er lokaliseret i hypoxisk nicher 20. Talrige faktorer er blevet foreslået til at forklare disse modstande CSCS, såsom tilbøjelighed til hvile, forbedret DNA reparation, up-regulerede cellecyklus kontrol mekanismer, og frie radikaler scavenging 21. Desuden kan flere onkogene molekylære veje aktiveres specifikt i CSCS 17. For at forbedre kendskabet til CSCS for yderligere målrettede-behandlinger, vi har brug for pålidelige metoder til identifikation og isolering af CSCS grund heterogenitet stamcelle-relaterede markørerforskellige typer af kræft 22.
I HNSCC, stængel-lignende tumor-initierende celler er blevet isoleret fra primære patientens tumorer ved at sortere celler, der udtrykker forskellige CSC biomarkører (såsom narkotika effluxtransportører ekspression 23, CD44 høj, CD24 lav CD133 high, c-Met + -fænotypen 10,24, 25, eller ALDH høj aktivitet 26) eller dyrke primære patient tumor til dannelse squamospheres der har CSC egenskaber. Ikke desto mindre er antallet af squamospheres falder drastisk efter to passager, hvilket giver en lille stikprøve af yderligere karakterisering undersøgelser 27. Derfor in vitro assays startende fra veletablerede cellelinjer er en lettere løsning til at designe eksperimenter med henblik på at forbedre kendskabet til CSCS.
Formålet med denne artikel er at foreslå en metode til at isolere CSCS fra HNSCC cellelinjer hjælp multiparametric flowcytometrisk analyse ennd cellesortering. Udtrykket af CD44 i sammenhæng med flere CSCS egenskaber, herunder ALDH aktivitet, er Side Befolkning (SP) fænotype, kugleformet dannelse evne og tumorgenicitet bruges til at isolere og karakterisere denne sub-population af CSCS. CD44, en celle-overflade glycoprotein, er involveret i celleadhæsion og migration. CD44 er stærkt til udtryk i mange solide tumorer CSCS 28, herunder hoved- og halscancer modeller 29-31. Desuden kan CD44 høje celler generere in vivo en heterogen tumor hvorimod CD44 lave celler kan ikke 10. SP assay er baseret på den differentielle potentiale af celler til udstrømning Hoechst farvestof 22 via den ATP-bindende kassette (ABC) familie af transportproteiner overudtrykt i CSC membranen. Dette assay omfatter brug af ABC transporter-inhibitorer, såsom verapamil i kontrolprøver. Aldehyd dehydrogenase (ALDH) er et intracellulært enzym, der er involveret i at konvertere retinol til RETinoic syre i den tidlige stamcelledifferentiering 25,26. Celler, der udviser høj ALDH aktivitet show stamceller-lignende celle adfærd i HNSCC 26 og en meget lille antal ALDH høje celler er i stand til at generere tumorer in vivo 26,32.
Kombinationen af disse markører og egenskaber med succes brugt af Bertrand e t al. For at studere modstanden in vitro og in vivo af disse CSCS at foton og kulstof ion stråling 19. Deres resultater viste klart, at kombinationen af forskellige cellemarkører og egenskaber er mere selektive for nyttige undersøgelser af HNSCC CSCS befolkninger end single-markør tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i henhold til lokale retningslinjer for pasning af dyr. Alle detaljerne i denne undersøgelse blev godkendt af CECCAPP, en fransk etisk komité.
1. Valg af Side Befolkning (SP) af Hoechst Dye efflux Assay
- Farvning 50 millioner celler med Hoechst 33342 farvestof.
- Forbered to 15 ml sterile rør med en konisk bund: et rør mærket "Hoechst" og en mærket "Hoechst og Verapamil". Forbered 10 ml af 5 mM verapamilhydrochlorid opløsning i sterilt vand. Forbered dyrkningsmediet (CM) for stamceller.
- Til fremstilling CM for CSC (CM-CSC), kombinere følgende: Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM): F12 (1: 3, vol: vol), 5% af føtalt kalveserum (FCS), 0,04 mg / l hydrocortison , 100 U / ml penicillin, 0,1 g / l streptomycin og 20 ug / L af epidermal vækstfaktor (EGFR).
- Under en laminær strømning, Trypsinisér cellerne. Fjern medie, vask med sterile phosphatbufret saltvand (PBS) og tilsæt 1 ml trypsin-EDTA (0,5 g / L) for en 75 cm kolbe. Inkuber 3 min ved 37 ° C. Reaktionen standses ved tilsætning af dyrkningsmedium anvendes til den parentale cellelinie. Tæl antallet af celler ved hjælp af en celle tæller.
- Til fremstilling CM for parentale cellelinje (CM-P), supplere DMEM med 10% FCS, 0,4 mg / l af hydrocortison, 100 U / ml penicillin og 0,1 g / l streptomycin).
- Fortynd cellesuspensionen opnået i trin 1.1.2 til opnåelse 10 7 celler / ml i CM-P. Split cellesuspensionen i 2 rør fremstillet: sætte 100 pi (10 6 celler) i røret "Hoechst og Verapamil" og 4 ml (4 x 10 7 celler) i tuben "Hoechst".
- I prøve "Hoechst og Verapamil", tilsættes 10 ul 5 mM Verapamil hydrochloride løsning (slutkoncentration: 0,5 mM) og bland forsigtigt. Tilsæt 5 pi 1 g / L Hoechst-opløsning (slutkoncentration: 0,1 g / l). I prøven & #34, Hoechst ", tilsættes 5 pi 1 g / L Hoechst opløsning pr 10 6 celler (200 pi alt) Fremover holder prøver beskyttet mod direkte lys eksponering ved hjælp aluminiumsfolie..
- Inkubér alle rørene i et vandbad ved 37 ° C i 1 time 30 min. Bland forsigtigt hvert 15. min at forhindre celler i at slå sig ned.
- Centrifugerør ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender hver pellet med 2 ml 1x PBS.
- Centrifugerør ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten. Resuspender "Hoechst og Verapamil" pellet i 500 pi af 5 mg / l propidiumiodid (PI) fortyndet i PBS-buffer og "Hoechst" pellet i 4 ml 5 mg / L PI fortyndet i PBS-buffer.
- Overfør prøve løsninger gennem en 70 um celle si for at fjerne aggregater og indsamle enkelte celler i rør til prøve optagelse på flowcytometeret. Hold prøver på is og beskytter mod direkte lys eksponering ved hjælp aluminiumsfolie.
- Forbered to 15 ml sterile rør med en konisk bund: et rør mærket "Hoechst" og en mærket "Hoechst og Verapamil". Forbered 10 ml af 5 mM verapamilhydrochlorid opløsning i sterilt vand. Forbered dyrkningsmediet (CM) for stamceller.
- jegtrøst af Side Befolkning Eksklusive Hoechst farvestof ved Cell Sorting.
- Udfør Hoechst negativ celle separation på en flowcytometri sorteringsanlæg med følgende parametre: UV-laser (355 nm), 2 detektorer på UV-laser sti med blå Hoechst (450/50 BP) og rød Hoechst (610/20 BP) filtre, og 2 solfangere.
- Først analysere prøven "Hoechst", der tjener som en positiv kontrol for farvning og flowcytometer set-up.
- Brug cytometret softwaren, på "Global Arbejdsark" vinduet, klik på "Dot Plot" (femte øverste højre billede) og oprette et diagram på det globale arbejdsark. På ordinat, med et højreklik, vælg FSC-A (forward scatter) og abscisse, SSC-A (side scatter) (figur 1A). På samme måde, skabe en SSC-W versus SCC-H dot plot. På dette andet dot plot, for at skabe en P1 region, klik på "Polygon gate" (fjortende top højre billede) (figur 1B) 33.
Bemærk: P1 regionen vilomfatte enkelte celler og diskriminere dubletter. - Valgfrit: Udeluk PI positive celler ved at oprette en FSC-A versus PI gated på P1. På denne dot plot, vælg PI negative population (P2) for at udelukke PI positive døde celler.
- Brug cytometret softwaren, på "Global Arbejdsark" vinduet, klik på "Dot Plot" og oprette et diagram på det globale arbejdsark. På ordinat, med et højreklik, vælg blå Hoechst-A og abscisse, rød Hoechst-A. Med et højreklik på befolkningen, vælg "Vis befolkning", og P1. På denne punktdiagram, oprette en region (P2) til at vælge de negative Hoechst farvestof side befolkning (SP) celler, der vises som en sidearm til venstre for den vigtigste population af celler (figur 1C).
- Analyser prøven "Hoechst" og indsamle 10.000 begivenheder. At sikre, at porten P2, som repræsenterer SP befolkning, er godt placeret, analysere prøven "Hoechst og Verapamil" (10.000 hændelser)at observere forsvinden SP population (figur 1D).
- Indsamle SP Hoechst farvestof negative celler i en 15 ml rør indeholdende 1 ml CM-CSC fremstillet i 1.1.1.1.
- Ved afslutningen af cellesortering, centrifugeres cellesuspensionen ved 250 xg i 5 min, supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes med 1 ml CM-CSC. Tæl antallet af sorterede celler under anvendelse af en celletæller og overføre passende antal celler til et dyrkningskolbe (se tabel 1). Tilføj CM-CSC og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2-atmosfære.
- Bevar celler i kultur under de samme betingelser for maksimalt 2 passager, indtil der er et minimum på 5 x 10 7 celler (se trin 3, "cellekultur metoden").
- Udfør Hoechst negativ celle separation på en flowcytometri sorteringsanlæg med følgende parametre: UV-laser (355 nm), 2 detektorer på UV-laser sti med blå Hoechst (450/50 BP) og rød Hoechst (610/20 BP) filtre, og 2 solfangere.
2. Udvælgelse af CD44 høj / ALDH høj Sub-befolkning i Side Befolkning Sorteret
- Farvning 50 millioner af SP Celler med ALDH Detection Kit og CD44-antistof.
- Forbered syv 15 ml sterile rør mærket som følger: "Ufarvet" (Tube a), "CD44-APC" (Tube b), "IgG1-APC" (Tube c), "ALDH" (Tube d), "ALDH og DEAB "(Tube e)," ALDH og CD44-APC "(Tube f)," ALDH, DEAB og CD44-APC "(Tube g). Hold alle rør og reagenser ved 4 ° C under farvning.
- Forbered buffer A med 4,5 ml af bufferen 1 (indeholdt i kittet) og 45 pi af CD44-APC (allophycocyanin) antistof (fortynding 1: 100). Forbered puffer B med 100 pi puffer 1 og 1 pi IgG1-APC-antistof (fortynding 1: 100). Forbered buffer C med 4 ml buffer 1 og 20 pi af reagens af kittet.
- Der fremstilles en cellesuspension af de tidligere sorterede celler (trin 1.2.5) ved 10 7 celler / ml. Tilsæt 100 pi (10 6 celler) af cellesuspensionen til rørene a, b og c, og 4 ml (4 x 10 7 celler) til rør f. For øjeblikket ikke sætte celler i rør d, e og g.
- Centrifuger rørene indeholdende cellerne ved 250 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender pellets i rør a, b og c i 100 ul buffer 1. Tilsæt 5 pi diethylaminobenzaldehyde (DEAB), en ALDH hæmmer til rør e og g.
- Resuspender celler i rør f med 4 ml reagens C og straks overføre 100 pi i rør d, e og g. Inkubér alle rørene i et vandbad ved 37 ° C i 30 minutter og beskytte mod direkte lyseksponering hjælp aluminiumsfolie. Bland cellesuspensionen forsigtigt ved hvirvelblanding efter 15 minutter for at forhindre celler i at sætte sig.
- Fra dette øjeblik, holde rørene på is og beskyttet mod direkte lys eksponering ved hjælp aluminiumsfolie. Centrifuge alle rør ved 250 xg i 5 min ved 4 ° C og supernatanten fjernes.
- Resuspender rør f i 4 ml og rør B og G med 100 ul buffer A. Resuspender rør c med 100 ul buffer B. Til de andre rør, tilsættes 100 ul buffer 1. Inkubér 10 min ved 4 °; C.
- Centrifuge alle rør ved 250 xg i 5 min ved 4 ° C og supernatanten fjernes. Skyl en gang med 1 ml puffer 1 (4 ml til rør f) og centrifugeres igen ved 250 x g i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten. Re-suspendere rør f pellet i 4 ml og alle andre rør i 1 ml buffer 1.
- Overfør prøveopløsningerne gennem 70 um celle sier at fjerne aggregater og indsamle enkelte celler i passende rør til prøve optagelse på flowcytometer.
- Isolering af CD44 høj / ALDH høj cellepopulation ved fluorescensaktiveret cellesortering.
- Udfør CD44 høj / ALDH høj cellesortering på en flowcytometri sorteringsanlæg med følgende parametre: Blå laser (488 nm) og rød laser (633 nm), 1 detektor på den blå laser vej med en FITC-filter (530/30), 1 detektor på den røde laser sti med en APC filter (660/20) og 2 solfangere.
- Brug cytometret software, klik på "Dot Plot "(den femte øverste højre billede) til at oprette en FSC-A versus SSC-A dot plot som beskrevet i afsnit 1.2.1.2, at kontrollere cellemorfologi og vælg en population bestående af enkelte celler med en SSC-W versus SSC-H dot plot.
- Brug cytometret softwaren, på "Global Arbejdsark" vinduet, klik på "Dot Plot" og oprette et diagram på det globale arbejdsark. På ordinat, med et højreklik, vælg APC-A og abscisse, FITC-A for at vælge den dobbelte farvede befolkning. Opret en port ved hjælp rør d og e til at vælge ALDH høje celler (Figur 2A). Bemærk: Positive celler forsvinder i røret e behandlet med DEAB (figur 2B).
- På samme diagram, skal du oprette en anden port ved hjælp rør b og c for at vælge CD44 høje celler (Figur 2C og 2D). Positive celler forsvinder i rør indeholdende IgG1-APC. Analyser rør f og g og skabe en tredje port, der omfatter CD44 høj / ALDH <sup> høje celler (figur 2E og 2F).
Bemærk: Hvis positive celler er til stede i rør indeholdende IgG1-APC (figur 2D), samspillet mellem celler og APC-farvede antistof er ikke specifik.
- På samme diagram, skal du oprette en anden port ved hjælp rør b og c for at vælge CD44 høje celler (Figur 2C og 2D). Positive celler forsvinder i rør indeholdende IgG1-APC. Analyser rør f og g og skabe en tredje port, der omfatter CD44 høj / ALDH <sup> høje celler (figur 2E og 2F).
- Indsamle CD44 høj / ALDH høje celler i et 15 ml rør indeholdende 1 ml CM-CSC. Indsamler også CD44 lav / ALDH lav i et 15 ml rør indeholdende 1 ml CM 19. Bemærk: Forbered CM-CSC som beskrevet i trin 1.1.1.1.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 250 xg i 5 min, supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes med 1 ml CM-CSC. Tæl antallet af sorterede celler.
3. Cell Culture Method
- Efter dobbelt-sortering af cellerne som beskrevet ovenfor, plade de sorterede celler i et passende dyrkningskolbe (tabel 1) med CM-CSC ved 37 ° C med 5% CO2. Efter 18-24 timer,kontrollere, om cellerne er klæbet og ændre dyrkningsmediet. Skift dyrkningsmediet hver 3 dage, indtil de ekspanderende kolonier er større end 50% sammenflydende.
- Brug det passende volumen af trypsin 0,5 g / L - EDTA (tabel 1) for at Trypsinisér cellerne fra kulturen kolben. Inkuber blodlegemer i 3 til 5 min ved 37 ° C. Derpå tilsættes en passende mængde af CM-CSC (tabel 1) for at stoppe virkningen af trypsin.
- Tæl antallet af celler opnået og plade 4 x 10 5 celler i en 175 cm² kultur kolbe med CM-CSC. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2. Ved denne koncentration vil celler med en fordoblingstid på 24 timer være 70% sammenflydende i 7 dage.
- Brug CSCS til in vitro eller in vivo forsøg, før de har gennemgået 3 passager.
4. Bekræftelse af Tumor Potentiale og CSC Kendetegn
- Tumor Sphere Dannelse at Bekræft tumor potentiale af CD44 høj / ALDHhøje celler.
- Trypsinisér celler som beskrevet i 3.2. Tilsæt 1 x 10 6 celler til en 15 ml rør og centrifugeres ved 250 xg i 5 min. Fjern supernatanten og re-suspendere pellet i et DMEM: F12 (3: 1) medium FCS fri, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / l heparin og 1x B27. Cellerne inkuberes i en 6 brønd lav forankringspunkter plader dyrkningskolbe ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: Brug DMEM: F12 (3: 1) medium indeholdende 5% FCS, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / l heparin og 1x B27 hvis celle ikke vokser uden FCS. - Observere tumor sfære formation med et optisk mikroskop fra 4 til 10 dage efter podning (figur 3A).
Bemærk: Tumor kugle diameter bør være mere end 35 um. CD44 høje / ALDH høje celler vil vise en hurtigere og mere forbedret tumor sfære dannelse i antal og størrelse i forhold til CD44 lav / ALDH lav.
- Trypsinisér celler som beskrevet i 3.2. Tilsæt 1 x 10 6 celler til en 15 ml rør og centrifugeres ved 250 xg i 5 min. Fjern supernatanten og re-suspendere pellet i et DMEM: F12 (3: 1) medium FCS fri, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / l heparin og 1x B27. Cellerne inkuberes i en 6 brønd lav forankringspunkter plader dyrkningskolbe ved 37 ° C og 5% CO2.
- Evaluering af In Vivo Tumorigenicitet EfterSubkutan injektion af CD44 høje / ALDH høje Celler i NOD-SCID mus.
- Efter sortering, resuspender celler i PBS ved tre forskellige koncentrationer (10 4 celler / ml, 10 5 celler / ml, og 10 6 celler / ml). Injicer subkutant 100 pi 10 4 celler / ml (10 3 celler) i den højre flanke region 6 mus. Gør det samme for 10 5 celler / ml (10 4 celler), og 10 6 celler / ml (10 5 celler).
Bemærk: Lavere fortynding end 10 3 celler kan testes. - Sprøjt den samme koncentration af CD44 lav / ALDH lave celler i den venstre flanke region. Monitor injicerede mus i op til 10 uger for at se tumor progression 19.
- Efter sortering, resuspender celler i PBS ved tre forskellige koncentrationer (10 4 celler / ml, 10 5 celler / ml, og 10 6 celler / ml). Injicer subkutant 100 pi 10 4 celler / ml (10 3 celler) i den højre flanke region 6 mus. Gør det samme for 10 5 celler / ml (10 4 celler), og 10 6 celler / ml (10 5 celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isoleringen af CSCS fra HNSCC cellelinjer kræves to på hinanden sortering grund af den meget lille procentdel af CSCS i den parentale cellelinie. Den første sortering var baseret på evnen af CSCS at udelukke Hoechst farvestof følge af lægemidlets effluxtransportører. Dette resulterede i erhvervelse af 1-5% af den totale cellepopulation sorteret (figur 1). Under Hoechst farvestof negative cellesortering, kontrollere størrelsen og granulering af sorterede celler ved at se på FSC-A versus SSC-A punktdiagram (figur 1A). Derefter diskriminere dubletter og celler fragmenter ved hjælp af SSC-W versus SSC-H dot plot og vælge befolkningen P1 (figur 1B). På denne P1 befolkning, skabe en Hoechst Rød-A versus Hoechst Blue-En prik plot. Med røret mærket "Hoechst", vises SP som en side arm til venstre fra de vigtigste celler befolkning (figur 1C). Denne population må forsvinde når de pae behandlet med verapamil (figur 1D), en hæmmer af ABC transportører. PI farvning tillader udelukkelsen af PI-positive døde celler, fordi denne befolkningsgruppe er under-skalaen på Hoechst Rød-A skalaen (figur 1C og 1D, blå ellipser).
Den anden celle sortering var baseret på den høje ekspression af CD44-receptoren og høj ALDH enzymaktivitet som tilladt erhvervelsen af 0,5-2% fra SP-celler tidligere ud (figur 2). Før sorteringen blev forskellige kontroller anvendes. De første er "ALDH" og "ALDH + DEAB" rør nødvendige for at placere den første port på FITC høje celler (figur 2A og 2B): ALDH høje celler blev gated på FITC-A versus APC-A prik plot ved hjælp af "ALDH" rør (figur 2A). Den gode placering af porten blev kontrolleret ved hjælp af "ALDH + DEAB "rør:.. Som DEAB hæmmer ALDH, skal positive celler forsvinde fra porten (figur 2B) Hvis de ikke, ændre reaktionsbetingelserne (ved at øge mængden af DEAB for eksempel) Den anden kontrol er" CD44-APC "og" IgG1-APC "rør, som har tilladelse til at placere den anden gate på APC high celler (figur 2C og 2D) under anvendelse af celler farvet med CD44-APC-antistof (figur 2C). Denne population må forsvinde med kontrolrør som indeholdt IgG1-APC-celler (Figur 2D). Hvis den ikke gør, bindingen med antistoffet ikke er specifik og BSA 0,5% bør tilføjes i puffer 1 fra ALDH afsløring kit under antistofreaktion. Endelig er den tredje kontrol vedrører "ALDH og CD44-APC" rør og "ALDH, DEAB og CD44-APC" rør (figur 2E, 2F, 2G og 2H). den dobbelte stalingen ALDH / CD44 røret anvendes til at positionere den sidste gate på de dobbelte positive celler (figur 2E) og det samme rør behandlet med DEAB er en kontrol for at verificere, at ALDH høje celler forsvinder (figur 2F).
Denne protokol bruges til at sortere CSCS fra SQ20B og FaDu cellelinier. Når sorteringen er gjort for første gang på en ny cellelinje, for at sikre, at sorterede celler har stamceller-lignende celler egenskaber, er det nødvendigt at bekræfte deres tumor potentiale. En af stamme-lignende celle egenskab er dens evne til at danne tumorspheres in vitro i en FSC frit medium. Under denne betingelse, kan kun cancer stamceller-lignende celler overleve og proliferere (figur 3A). Desuden qPCR eksperimenter viser en høj ekspression af β-catenin (markør for stamme-lignende karakteristik) i CD44 høje / ALDH høje celler (figur 3B), samt Bmi-1 og Notch 19 </ Sup>. Endelig CD44 høj / ALDH høje celler er også i stand til at danne tumorer, når de injiceres i små mængder sammenlignet med CD44 lav / ALDH lave celler 19.
Figur 1: Isolering af en side population eksklusive Hoechst farvestof (A) FSC-A versus SSC-A punktdiagram.. (B) SSC-W versus SSC-H dot plot. (C, D) Hoechst Rød-A versus Hoechst Blue-En dot-plot ved hjælp af "Hoechst" rør (C) eller med røret "Hoechst og Verapamil" (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Så rting af CD44 høje / ALDH høje celler fra Hoechst farvestof negative celler. FITC-A versus APC-A dot-plot ved hjælp af "ALDH" rør (A), den "ALDH + DEAB" rør (B), den "CD44-APC" rør (C), den "IgG1-APC" rør (D), den "ALDH og CD44-APC" rør (E og G) eller røret "ALDH, DEAB og CD44-APC" (F og H). Tallene A, B, C, D, E og F opnået under anvendelse SQ20B cellelinie. Tal G og H opnået under anvendelse FaDu cellelinie. Grøn angiver CD44 lav / ALDH lave celler (Q3); mørkeblå indikerer CD44 lav / ALDH høje celler (Q1); lilla angiver CD44 høj / ALDH lave celler (Q4); lyseblå indikerer CD44 høj / ALDH høje celler (Q2)._upload / 53.958 / 53958fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Bekræftelse af tumor potentiale CD44 høje / ALDH høje sorteres cellerne CD44 høje / ALDH høje celler var i stand til at danne tumorspheres in vitro (A) i en dårlig FCS medier. Scale bar, 25 um. Endvidere CD44 høj / ALDH høj overekspression β-catenin, en markør for tumorgenicitet (B). Denne kvantificering er blevet udført af qPCR og fejlsøjler repræsenterer SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Antal cellersorteres | Dyrkningskolbe typen | Trypsin Volumen (ml) | Kultur Medium Volumen (ml) |
| 10,000-200,000 | 1 brønd af en 6-brønds plade eller en 3,5 cm petriskål | 0.5 | 2 |
| 200,000-1,000,000 | 1 T25 dyrkningskolbe | 1 | 4 |
| > 1.000.000 | 1 T75 dyrkningskolbe | 2 | 10 |
Tabel 1: dyrkningskolbe type til at bruge i henhold til antallet af celler sorteret Nærmere oplysninger om dyrkningskolbe størrelse for omtrentlige antal celler sorteres gives.. Volumenet af trypsin og mængden af medium kræves til dyrkningskolben typer, er også tilvejebragt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en pålidelig fremgangsmåde til vellykket isolering af CSCS fra en bestemt cellelinie, som kan anvendes til andre HNSCC cellelinier. Isolerede hoved og hals CSCS er derefter egnet til yderligere molekylær karakterisering in vitro og funktionel validering af transplantation i immundefekte mus 19. Dog kan visse modifikationer testes afhængigt af side befolkningen eller CD44 høj / ALDH høje procenter stede i den parentale cellelinie. For eksempel, hvis procentdelen af celler i den side befolkning er for lav i en bestemt cellelinie, CD44 høj / ALDH høj sortering kan udføres direkte. Markørerne anvendt i denne undersøgelse kan erstattes af andre markører egnede til cellelinien studerede såsom CD133 high 34 eller CD10 high 35.
Denne protokol er baseret på to celle sorteringer. Tre farvede sortering med SP + CD44 + ALDH var ikke possible med de testede cellelinier. Første, de parentale cellelinier testet her foreliggende mindre end 5% af SP og mindre end 10% CD44 høj / ALDH høje celler i SP. Derfor SP / CD44 høj / ALDH repræsentere høj mindre end 0,5% af den parentale cellelinje. Derfor en første SP sortering er nødvendig for at berige populationen i CD44 høje og / eller ALDH høje celler. For det andet at sortere 1% af den parentale cellelinie, det tager 5 timer til opnåelse af ca. 300.000 celler. Derfor, hvis en 3 farve celle sortering foretages, vil mængden af celler opsamlet være meget lav. Desuden længere sorteringen ikke anbefales, da det kan påvirke cellernes levedygtighed.
På grund af selektiviteten af denne isolation protokol, den vigtigste begrænsning er det lille antal CSCS opnåede. Dette kunne være problematisk at udføre yderligere forsøg, da det ikke anbefales at bruge dem efter 3 passager på grund af det hurtige tab af CD44 og ALDH markører. Endvidere før hvert nyt eksperiment, procentdelen af CD44 høj / ALDH høje celler stadig er til stede i cellen suspension bør testes for at kontrollere antallet af CSCS der har differentierede.
Det er bydende nødvendigt at forberede Verapamil hydrochloridopløsning og kulturmedium indeholdende EGF lige før brug, da disse molekyler er meget ustabil. En stamopløsning af EGF ved 20 mg / L er stabil i tre måneder ved -20 ° C. Variationer af Hoechst protokol eksisterer, men den endelige farvestofkoncentrationen almindeligt anvendte er 5 ug / ml. Endvidere under den første sortering, forskellige dyrkningsmedier sammensætninger bør afprøves efter den anvendte cellelinie. Når sorteringsbetingelserne valideres, er det nødvendigt at kontrollere egenskaberne for det sorterede cellepopulation under anvendelse af de forskellige metoder (afsnit 4).
Celleoverflademarkører, ALDH aktivitet og evne til udstrømning vitale farvestoffer er allerede brugt individually i litteraturen at isolere CSCS fra HNSCC. Men den her beskrevne protokol har den unikke fordel ved anvendelse af kombinationer af forskellige markører for at opnå høj specificitet i CSCS isolation fra HNSCC cellelinier. Desuden CD44 sortering kunne realiseres med et antistof anti-CD44 konjugeret med magnetiske mikro-perler og sorteret med en magnetisk kolonne 36, men denne metode er kun anvendelig til celleoverflademarkører og kan ikke bruges til en ALDH sortering, forhindrer dobbelt sortering . En anden metode, der anvendes til at opnå CSCS er tumorsphere kultur fra primære tumorer 37 eller xenografter 38. Men købet af disse primære tumorer eller xenografter forbundet med etiske begrænsninger.
Da denne metode isolerer levedygtige HNSCC CSCS, kan de anvendes (efter kontrol deres tumorigenicitet) i en række forsøg, der måler den fysiologiske funktion af disse celler. Den tillader derfor vurdering af adfærdaf CSCS efter forskellige terapeutiske tilgange (strålebehandling, kemoterapi). Det giver også en undersøgelse af forskellige biologiske parametre såsom migration / invasion, DNA-reparation, cellesignalering, osv. Derfor opnå CSCS fra forskellige cellelinjer er et attraktivt valg for at undersøge CSCS egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
References
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
- Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
- Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
- Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
- Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
- Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
- Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
- Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
- Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
- Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
- Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
- Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
- Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
- Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
- Meinelt, E., et al. Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , BD Biosciences. (2012).
- Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
- Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
- Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
- Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
