Abstract
Nonostante i progressi nella comprensione della testa e del collo progressione carcinomi a cellule squamose (HNSCC), il tasso di sopravvivenza a cinque anni rimane basso a causa di recidive locali e metastasi a distanza. Una ipotesi per spiegare questo recidiva è la presenza di cellule staminali simil-tumorali (CSC) che presentano chemio intrinseca e radio-resistenza. Per sviluppare nuove strategie terapeutiche, è necessario disporre di modelli sperimentali che convalidano l'efficacia dei trattamenti mirati e quindi avere metodi affidabili per l'identificazione e l'isolamento di CSC. A tal fine, presentiamo un protocollo per l'isolamento di CSC da linee cellulari umane HNSCC che si basa sulla combinazione di due cernite successive cellulari eseguite da cellule attivate a fluorescenza (FACS). Il primo si basa sulla proprietà di CSC per overexpress ATP-binding cassette (ABC) proteine di trasporto e quindi di escludere, tra gli altri, i coloranti DNA vitali come Hoechst 33342. Le celle ordinate con °è il metodo sono identificati come "popolazione side" (SP). Come le cellule SP rappresentano una bassa percentuale (<5%) di cellule parentali, una fase di crescita è necessaria al fine di aumentare il loro numero prima della seconda separazione delle cellule. Il passaggio successivo consente la selezione di cellule che possiedono due altre caratteristiche di cellule staminali HNSCC esempio alto livello di espressione del marcatore di superficie cellulare CD44 (CD44 alto) e la sovraespressione di aldeide deidrogenasi (ALDH alto). Poiché l'uso di un singolo marcatore ha numerose limitazioni e trappole per l'isolamento del CSC, la combinazione di SP, CD44 e marcatori ALDH fornirà uno strumento utile per isolare CSC di ulteriori test analitici e funzionali richiedono cellule vitali. Le caratteristiche staminali-come CSC è stato finalmente validati in vitro dalla formazione di tumorispheres e l'espressione di β-catenina.
Introduction
Testa e del collo a cellule squamose di carcinoma (HNSCC) è un tumore comune in tutto il mondo e nonostante i progressi nei trattamenti attuali, i pazienti con malattia avanzata hanno una prognosi sfavorevole. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni generale del paziente è di circa il 30%, nonostante la combinazione di approcci terapeutici tra cui la chirurgia, chemio-radioterapia e-terapie mirate. Recenti studi attribuiscono recidive locali e metastasi a distanza per la sopravvivenza delle cellule staminali simil-tumorali (CSC) a seguito di terapie antitumorali 1. Ci sono prove a sostegno accumulando l'esistenza di cellule che presentano cellule staminali proprietà (capacità di stato indifferenziato, auto-rinnovamento e differenziazione, e l'attività della telomerasi) in vari tumori solidi, tra cui seno, del cervello, della prostata, del polmone, del colon, del pancreas, del fegato e della pelle 2- 10. Tuttavia, l'origine della CSC rimane poco chiaro 11,12. Essi possono derivare dalla trasformazione maligna delle cellule staminali normali 3,13 o dedifferenziazione delle cellule tumorali che acquisiscono CSC-come caratteristiche 14,15. Pertanto, la comprensione percorsi distintivi relativi a CSC fornirà spaccato la diagnosi precoce e il trattamento di HNSCC resistenti.
E 'stato proposto che CSC possiedono anche fenotipi resistenti che eludono chemioterapia standard e radioterapia, con conseguente ricaduta del tumore rispetto alla massa di cellule tumorali 16-19 e sono localizzate in ipossico nicchie 20. Numerosi fattori sono stati proposti per spiegare queste resistenze di CSC, come la propensione al quiescenza, migliorato di riparazione del DNA, up-regolati meccanismi di controllo del ciclo cellulare, Kärcher radicali liberi 21. Inoltre, diversi percorsi molecolari oncogeni possono essere attivati in modo specifico CSC 17. Al fine di migliorare la conoscenza della CSC per ulteriori mirate terapie, abbiamo bisogno di metodi affidabili per l'identificazione e l'isolamento di CSC, a causa della eterogeneità dei marcatori di cellule staminali nel legativari tipi di tumori 22.
In HNSCC, staminali simil-cellule tumorali-inizio sono stati isolati da tumori di pazienti primario di classificare cellule che esprimono diversi biomarcatori CSC (come ad esempio l'efflusso di droga trasportatori espressione 23, CD44 alto, alto CD24 basso CD133, c-Met + fenotipo 10,24, 25, o ALDH alta attività 26) o la coltivazione di tumore primario del paziente in modo da formare squamospheres che hanno proprietà CSC. Tuttavia, il numero di squamospheres diminuisce drasticamente dopo due passaggi, dando così un campione di dimensioni piccole per un'ulteriore caratterizzazione studi 27. Pertanto, test in vitro a partire da linee cellulari ben consolidata è una soluzione più facile da progettare esperimenti, al fine di migliorare la conoscenza della CSC.
Lo scopo di questo articolo è quello di proporre un metodo per isolare CSC da linee cellulari HNSCC utilizzando multiparametrica citometria a flusso di analisi di unND cellule di smistamento. L'espressione di CD44 in correlazione con diverse proprietà CSC compresa l'attività ALDH, laterale della popolazione (SP) fenotipo, capacità formazione sferoide e tumorigenicità sono utilizzati per isolare e caratterizzare questa sotto-popolazione di CSC. CD44, una glicoproteina sulla superficie cellulare, è coinvolto nella adesione cellulare e la migrazione. CD44 è altamente espresso in molti tumori solidi CSC 28, anche nel cancro della testa e del collo modelli 29-31. Inoltre, alti cellule CD44 possono generare in vivo un tumore eterogeneo, mentre CD44 bassi cellule non possono 10. Il saggio SP si basa sul potenziale differenziale delle cellule per efflusso il colorante Hoechst 22 attraverso la famiglia ATP-binding cassette (ABC) del trasportatore proteine overexpressed all'interno della membrana CSC. Questo test prevede l'uso di inibitori del trasportatore ABC come verapamil in campioni di controllo. Deidrogenasi (ALDH) è un enzima intracellulare che è coinvolto nella conversione di retinolo a macerareL'acido inoic durante staminali precoce differenziazione delle cellule 25,26. Le cellule che presentano l'attività spettacolo staminali come il comportamento delle cellule di alta ALDH in HNSCC 26 e pochissimi numero di alta cellule ALDH sono in grado di generare tumori in vivo 26,32.
La combinazione di questi marcatori e proprietà è stato usato con successo da Bertrand e t al. Per studiare la resistenza in vitro e in vivo di questi CSC PHOTON e ioni di carbonio radiazioni 19. I loro risultati hanno mostrato chiaramente che la combinazione di vari marcatori e le proprietà delle cellule sono più selettivi per gli studi sulle popolazioni utili HNSCC CSC di approcci singolo marcatore.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida locali sulla cura degli animali. Tutti i dettagli di questo studio sono stati approvati dal CECCAPP, un comitato etico francese.
1. Selezione di una popolazione Side (SP) dalla Hoechst Dye Efflux Assay
- Colorazione 50 milioni di cellule con colorante Hoechst 33342.
- Preparare due 15 ml provette sterili con fondo conico: un tubo con l'etichetta "Hoechst" e uno con l'etichetta "Hoechst e Verapamil". Preparare 10 ml di soluzione di cloridrato 5 mM Verapamil in acqua sterile. Preparare il terreno di coltura (CM) per le cellule staminali.
- Per preparare CM per CSC (CM-CSC), combinare il seguente: mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM): F12 (1: 3, v: v), 5% di siero fetale bovino (FCS), 0,04 mg / L di idrocortisone , 100 U / ml di penicillina, 0,1 g / L di streptomicina, e 20 ug / L del fattore di crescita epidermico (EGFR).
- Sotto una cappa a flusso laminare, trypsinize cellule. Rimuovere i supporti, lavare con sterile tampone fosfato salino (PBS) e aggiungere 1 ml di tripsina-EDTA (0,5 g / L) per un pallone da 75 cm². Incubare 3 minuti a 37 ° C. Arrestare la reazione aggiungendo mezzo di coltura utilizzati per la linea cellulare parentale. Contare il numero di cellule utilizzando un contaglobuli.
- Per preparare CM per linea cellulare parentale (CM-P), integrare DMEM con 10% FCS, 0,4 mg / L di idrocortisone, 100 U / ml di penicillina e 0,1 g / L di streptomicina).
- Diluire la sospensione cellulare ottenuta nello stadio 1.1.2 per ottenere 10 7 cellule / ml in CM-P. Dividere la sospensione cellulare nelle 2 provette preparate: mettere 100 microlitri (10 6 cellule) nel tubo "Hoechst e Verapamil" e 4 ml (4 x 10 7 cellule) nel tubo "Hoechst".
- Nel campione "Hoechst e Verapamil", aggiungere 10 ml di soluzione di cloridrato 5 mM Verapamil (concentrazione finale: 0.5 mm) e mescolare delicatamente. Aggiungere 5 ml di 1 g / L soluzione Hoechst (concentrazione finale: 0,1 g / L). Nel campione # &34; Hoechst ", aggiungere 5 ml di 1 g / L Hoechst soluzione per 10 6 cellule (200 ml totale) D'ora in poi, mantenere i campioni al riparo dalla luce diretta utilizzando un foglio di alluminio..
- Incubare tutte le provette a bagnomaria a 37 ° C per 1 ora e 30 min. Mescolare delicatamente ogni 15 minuti per evitare che le cellule da stabilirsi.
- Tubi centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet con 2 ml di PBS 1x.
- Tubi centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Risospendere "Hoechst e Verapamil" pellet in 500 ml di 5 mg / L ioduro di propidio (PI) diluito in tampone PBS e il pellet "Hoechst" in 4 ml di 5 mg / L PI diluito in tampone PBS.
- Trasferire soluzioni campione attraverso un colino 70 micron cella per rimuovere aggregati e raccogliere le cellule singole in tubi per la captazione campione sul citofluorimetro. I campioni sul ghiaccio e al riparo dalla luce diretta utilizzando un foglio di alluminio.
- Preparare due 15 ml provette sterili con fondo conico: un tubo con l'etichetta "Hoechst" e uno con l'etichetta "Hoechst e Verapamil". Preparare 10 ml di soluzione di cloridrato 5 mM Verapamil in acqua sterile. Preparare il terreno di coltura (CM) per le cellule staminali.
- iosolation della popolazione Side Escludendo colorante Hoechst da Cell Sorting.
- Eseguire Hoechst separazione cellulare negativa su una citometria a flusso sorter con i seguenti parametri: laser UV (355 nm), 2 rivelatori sul percorso del laser UV con il blu Hoechst (450/50 BP) e rosso Hoechst (610/20 BP) filtri e 2 collettori.
- In primo luogo, analizzare campione "Hoechst" che funge da controllo positivo per la colorazione e citofluorimetro set-up.
- Utilizzando il software citometro, sulla finestra "Global foglio di lavoro", clicca su "Dot Plot" (quinta foto in alto a destra) e creare un grafico nel foglio di lavoro globale. Su ordinata, con un clic destro, selezionare FSC-A (forward scatter) e sulla ascisse, SSC-A (lato dispersione) (Figura 1A). Allo stesso modo, creare un SSC-W contro SCC-H diagramma a punti. Su questa seconda dot plot, per creare una regione P1, fai clic su "Polygon gate" (quattordicesima alto foto a destra) (Figura 1B) 33.
Nota: La regione P1comprendere le singole cellule e discriminare doppiette. - Opzionale: Escludere PI cellule positive con la creazione di un FSC-A rispetto a PI gated su P1. Su questa trama di punti, selezionare la popolazione negativo PI (P2) di escludere le cellule morte PI positivi.
- Utilizzando il software citometro, sulla finestra "Global foglio di lavoro", cliccare su "Dot Plot" e creare un grafico nel foglio di lavoro globale. Su ordinata, con un clic destro, selezionare blu Hoechst-A e ascisse, rosso Hoechst-A. Con un clic destro sulla popolazione, selezionare "Mostra della popolazione" e P1. Su questo diagramma a punti, creare una regione (P2) per selezionare le celle negativo Hoechst popolazione lato colorante (SP) che appaiono come un braccio laterale sulla sinistra della principale popolazione di cellule (Figura 1C).
- Analizzare il campione "Hoechst" e raccogliere 10.000 eventi. Per garantire che il P2 cancello, che rappresenta la popolazione SP, è ben posizionata, analizzare il campione "Hoechst e Verapamil" (10.000 eventi)per osservare la scomparsa della popolazione SP (Figura 1D).
- Raccogliere le cellule negative colorante SP Hoechst in un tubo da 15 ml contenente 1 ml di CM-CSC preparati in 1.1.1.1.
- Al termine della selezione cellulare, centrifugare la sospensione cellulare a 250 xg per 5 minuti, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet con 1 ml di CM-CSC. Contare il numero di cellule filtrate usando un contatore cellulare e trasferire il numero appropriato di cellule in un pallone di coltura (vedi Tabella 1). Aggiungere CM-CSC e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 nell'atmosfera.
- Mantenere cellule in coltura nelle stesse condizioni per un massimo di 2 passaggi fino a quando c'è un minimo di 5 x 10 7 cellule (vedere il passaggio 3, "metodo di coltura cellulare").
- Eseguire Hoechst separazione cellulare negativa su una citometria a flusso sorter con i seguenti parametri: laser UV (355 nm), 2 rivelatori sul percorso del laser UV con il blu Hoechst (450/50 BP) e rosso Hoechst (610/20 BP) filtri e 2 collettori.
2. Selezione del CD44 alta / ALDH alta sub-popolazione nella popolazione Side Sorted
- Colorazione 50 milioni di celle SP con il Detection Kit ALDH e CD44 anticorpo.
- Preparare sette 15 ml provette sterili evidenziate nel modo seguente: "senza macchia" (tubo a), "CD44-APC" (tubo b), "IgG1-APC" (tubo c), "ALDH" (tubo d), "ALDH e DEAB "(tubo e)," ALDH e CD44-APC "(tubo f)," ALDH, DEAB e CD44-APC "(tubo g). Mantenere tutte le provette e reagenti a 4 ° C durante la colorazione.
- Preparare tampone A con 4,5 ml di tampone 1 (contenuto nel kit) e 45 microlitri di CD44-APC (Allophycocyanin) anticorpi (diluizione 1: 100). Preparare tampone B con 100 ml di buffer di 1 e 1 ml di anticorpi IgG1-APC (diluizione 1: 100). Preparare tampone C con 4 ml di tampone 1 e 20 ml di reagente del kit.
- Preparare una sospensione cellulare delle cellule precedentemente filtrate (passo 1.2.5) a 10 7 cellule / ml. Aggiungere 100 microlitri (10 6 cellule) della sospensione cellulare ai tubi a, b, c, e 4 ml (4 x 10 7 cellule) per tubo f. Per il momento non mettere cellule in tubi d, e, e g.
- Centrifugare le provette contenenti le cellule a 250 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in tubi a, bec in 100 microlitri di tampone 1. Aggiungere 5 ml di dietilaminobenzaldehide (DEAB), un inibitore ALDH per tubi e g.
- Risospendere le cellule in provetta F con 4 ml di reagente C e trasferire immediatamente 100 ml in tubi d, E e G. Incubare tutte le provette a bagnomaria a 37 ° C per 30 min e proteggere dalla luce diretta usando un foglio di alluminio. Mescolare la sospensione cellulare gentilmente con vortex dopo 15 minuti per evitare che le cellule da stabilirsi.
- Da questo momento, mantenere i tubi in ghiaccio e al riparo dalla luce diretta utilizzando un foglio di alluminio. Centrifugare tutte le provette a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
- tubo Risospendere f in 4 ml e tubi be g con 100 ml di tampone A. Risospendere tubo c con 100 ml di tampone B. Per gli altri tubi, aggiungere 100 ml di tampone 1. Incubare 10 minuti a 4 °; C.
- Centrifugare tutte le provette a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Risciacquare una volta con 1 ml di tampone 1 (4 ml per tubo f) e centrifugare di nuovo a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Risospendere tubo f pellet in 4 ml e tutti gli altri tubi in 1 ml di tampone 1.
- Trasferire le soluzioni campione attraverso 70 filtri cellulari micron per rimuovere aggregati e raccogliere le cellule singole in tubi appropriati per l'assorbimento del campione sul citofluorimetro.
- Isolamento del CD44 alta / alta ALDH cellulare Popolazione per Fluorescence Activated di separazione delle cellule.
- Eseguire CD44 alta / ALDH alta cell sorting su un citofluorimetro sorter con i seguenti parametri: laser blu (488 nm) e laser rosso (633 nm), 1 rivelatore sul percorso laser blu con un filtro FITC (530/30), 1 rivelatore sul percorso laser rosso con un filtro APC (660/20) e di 2 collettori.
- Utilizzando il software citometro, clicca su "Dot Plo(Quinta foto in alto a destra) t "per creare un FSC-A vs SSC-A dot plot come descritto nella sezione 1.2.1.2, per controllare la morfologia cellulare e selezionare una popolazione composta di singole cellule con un SSC-W contro SSC-H dot plot.
- Utilizzando il software citometro, sulla finestra "Global foglio di lavoro", cliccare su "Dot Plot" e creare un grafico nel foglio di lavoro globale. In ordinata, con un clic destro, selezionare APC-A e ascisse, FITC-A al fine di selezionare la popolazione doppia macchiato. Creare un cancello con tubi d ed e per selezionare alti cellule ALDH (Figura 2A). Nota: le cellule positive scompaiono in tubo e trattati con DEAB (Figura 2B).
- Nella stessa tabella, creare una seconda porta usando b ec tubi per selezionare elevati cellule CD44 (Figura 2C e 2D). cellule positive scompaiono nel tubo contenente IgG1-APC. Analizzare i tubi F e G e creare una terza porta che comprende CD44 alta / ALDH <sup> cellule di alta (Figura 2E e 2F).
Nota: Se le cellule positive sono presenti nel tubo contenente IgG1-APC (Figura 2D), l'interazione tra cellule e l'anticorpo APC-tinto non è specifico.
- Nella stessa tabella, creare una seconda porta usando b ec tubi per selezionare elevati cellule CD44 (Figura 2C e 2D). cellule positive scompaiono nel tubo contenente IgG1-APC. Analizzare i tubi F e G e creare una terza porta che comprende CD44 alta / ALDH <sup> cellule di alta (Figura 2E e 2F).
- Raccogliere CD44 alta / ALDH cellule di alta in una provetta da 15 ml contenente 1 ml di CM-CSC. Raccogliere anche CD44 basso / ALDH bassa in un tubo da 15 ml contenente 1 ml di CM 19. Nota: Preparare CM-CSC come descritto al punto 1.1.1.1.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 250 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con 1 ml di CM-CSC. Contare il numero di cellule ordinati.
3. Metodo cellulare Cultura
- Dopo il doppio ordinamento delle cellule come descritto sopra, piastra celle ordinate in un pallone di coltura appropriato (Tabella 1) con CM-CSC a 37 ° C con 5% di CO 2. Dopo 18-24 ore,verificare se le cellule hanno aderito e cambiare il terreno di coltura. Cambiare il terreno di coltura ogni 3 giorni fino a quando le colonie espansione sono superiori al 50% confluenti.
- Utilizzare il volume appropriato di tripsina 0,5 g / L - EDTA (Tabella 1) per trypsinize cellule dal pallone di coltura. Incubare le cellule da 3 a 5 min a 37 ° C. Aggiungere il volume appropriato di CM-CSC (Tabella 1) per fermare l'azione di tripsina.
- Contare il numero di cellule ottenute e la piastra 4 x 10 5 cellule in un pallone di coltura 175 cm² con CM-CSC. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2. A questa concentrazione, le cellule con un tempo di raddoppio di 24 ore sarà al 70% confluenti in 7 giorni.
- Utilizzare CSC per in vitro o in vivo prima di aver subito 3 passaggi.
4. Conferma di tumore potenziale e CSC Caratteristiche
- Tumore Sphere Formazione per confermare il potenziale tumore della CD44 alta / ALDHalti cellule.
- Trypsinize cellule come descritto al punto 3.2. Aggiungere 1 x 10 6 cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare a 250 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un DMEM: F12 (3: 1) FCS medie libero, 20 ng / ml di rhEGF, 4 mg / L di eparina e 1x B27. Incubare le cellule in un pallone di coltura 6 così bassa piastre di ancoraggio a 37 ° C e 5% CO 2.
Nota: Uso DMEM: F12 (3: 1) medium contenente il 5% di FCS, 20 ng / ml di rhEGF, 4 mg / L di eparina e 1x B27 se la cella non crescere senza FCS. - Osservare la formazione sfera tumore con un microscopio ottico da 4 a 10 giorni dopo la semina (Figura 3A).
Nota: Tumor diametro della sfera deve essere superiore a 35 micron. Alti / alti cellule CD44 ALDH mostreranno un tumore formazione più veloce e più avanzata sfera in termini di numero e di dimensioni rispetto a CD44 basso / ALDH basso.
- Trypsinize cellule come descritto al punto 3.2. Aggiungere 1 x 10 6 cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare a 250 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un DMEM: F12 (3: 1) FCS medie libero, 20 ng / ml di rhEGF, 4 mg / L di eparina e 1x B27. Incubare le cellule in un pallone di coltura 6 così bassa piastre di ancoraggio a 37 ° C e 5% CO 2.
- La valutazione di In Vivo tumorigenicity DopoL'iniezione sottocutanea di CD44 alti / alti ALDH cellule in topi NOD-SCID.
- Dopo la cernita, risospendere le cellule in PBS a tre diverse concentrazioni (10 4 cellule / ml, 10 5 cellule / ml, e 10 6 cellule / ml). Iniettare per via sottocutanea 100 pl di 10 4 cellule / ml (10 3 cellule) nella regione fianco destro di 6 topi. Fare lo stesso per 10 5 cellule / ml (10 4 cellule), e 10 6 cellule / ml (10 5 cellule).
Nota: Lower diluizione di 10 3 cellule possono essere testati. - Iniettare la stessa concentrazione di CD44 bassi / ALDH basse cellule nella regione fianco sinistro. Topi Monitor iniettata per un massimo di 10 settimane per vedere la progressione del tumore 19.
- Dopo la cernita, risospendere le cellule in PBS a tre diverse concentrazioni (10 4 cellule / ml, 10 5 cellule / ml, e 10 6 cellule / ml). Iniettare per via sottocutanea 100 pl di 10 4 cellule / ml (10 3 cellule) nella regione fianco destro di 6 topi. Fare lo stesso per 10 5 cellule / ml (10 4 cellule), e 10 6 cellule / ml (10 5 cellule).
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Representative Results
L'isolamento di CSC da linee cellulari HNSCC richiesto due successive di smistamento a causa della bassissima percentuale di CSC nella linea cellulare dei genitori. La prima cernita era basato sulla capacità di CSC di escludere il colorante Hoechst causa di trasportatori di efflusso droga. Ciò ha comportato l'acquisizione del 1-5% della popolazione totale di cellule filtrate (Figura 1). Durante il colorante Hoechst ordinamento cellulare negativa, controllare la dimensione e granulazione delle cellule ordinati, cercando in FSC-A vs SSC-A dot plot (Figura 1A). Poi, discriminare doppiette e cellule frammenti utilizzando la SSC-W contro SSC-H dot plot e selezionando la P1 popolazione (Figura 1B). Su questa popolazione P1, creare un Hoechst Red-A contro Hoechst Blu-A dot-plot. Con il tubo etichetta "Hoechst", la SP appare come un braccio laterale sinistra dal cellule principale popolazione (Figura 1C). Questa popolazione deve scomparire quando si are trattati con Verapamil (Figura 1D), un inibitore dei trasportatori ABC. La colorazione PI consente l'esclusione di cellule morte PI-positivo perché questa popolazione è sotto scala sul Hoechst Red-A scala (Figura 1C e 1D, ellissi blu).
La seconda separazione delle cellule era basata sulla elevata espressione del recettore e alta ALDH attività enzimatica CD44 che ha permesso l'acquisizione di 0,5-2% dalle cellule SP precedentemente filtrate (Figura 2). Prima di smistamento, sono stati utilizzati vari controlli. I primi sono i "ALDH" ei tubi "ALDH + DEAB" necessari per posizionare il primo cancello a cellule di alta FITC (figure 2A e 2B): cellule di alta ALDH stati gated sul FITC-A rispetto APC-A dot grafico usando il "ALDH" tubo (Figura 2A). La buona posizione della porta è stata controllata utilizzando il "ALDH + DEAB "tubo:.. Come DEAB inibisce ALDH, cellule positive devono scomparire dal cancello (Figura 2B) In caso contrario, cambiano le condizioni di reazione (aumentando la quantità di DEAB per esempio) Il secondo controllo è il" CD44-APC "e" tubi IgG1-APC ", che hanno permesso di posizionare il secondo cancello sulla alti cellule APC (figure 2C e 2D) utilizzando le cellule colorate con l'anticorpo CD44-APC (Figura 2C). Questa popolazione deve scomparire con il tubo di controllo che conteneva le cellule IgG1-APC (Figura 2D). in caso contrario, il legame con l'anticorpo non è specifico e BSA 0,5% deve essere aggiunto nel buffer 1 dal kit di rilevamento ALDH durante la reazione anticorpale. Infine, la terza controllo riguarda la "ALDH e CD44-APC" tubo e "ALDH, DEAB e CD44-APC" tubi (figure 2E, 2F, 2G e 2H). il doppio STAining ALDH tubo / CD44 viene utilizzato per posizionare l'ultima porta sulle cellule doppio positive (figura 2E) e lo stesso tubo trattato con DEAB è un controllo per verificare che le alte cellule ALDH scompaiono (Figura 2F).
Questo protocollo è utilizzato per ordinare CSC dal SQ20B e le linee cellulari Fadu. Quando l'ordinamento viene fatto per la prima volta su una nuova linea cellulare, al fine di garantire che le cellule ordinamento hanno cellule staminali come proprietà, è necessario confermare la loro potenziale tumorale. Una delle proprietà delle cellule staminali come è la sua capacità di formare tumorspheres in vitro in un mezzo privo di FSC. In questa condizione, le cellule staminali solo il cancro-come possono sopravvivere e proliferare (Figura 3A). Inoltre, esperimenti qPCR mostrano una elevata espressione di β-catenina (marcatore di caratteristica stem-like) in alta alta cellule CD44 / ALDH (Figura 3B), così come Bmi-1 e Notch 19 </ Sup>. Infine, alto / ALDH cellule di alta CD44 sono anche in grado di formare tumori quando iniettate in piccole quantità rispetto a CD44 bassi / ALDH bassi cellule 19.
Figura 1: L'isolamento di una popolazione lato escludendo il colorante Hoechst (A) FSC-A vs SSC-A dot-plot.. (B) SSC-W contro SSC-H dot plot. (C, D) Hoechst Red-A contro Hoechst Blu-diagramma bidimensionale utilizzando il tubo "Hoechst" (C) o con il tubo "Hoechst e Verapamil" (D). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Così rting di alte / ALDH alti cellule CD44 da cellule negative colorante Hoechst. FITC-A contro APC-diagramma bidimensionale utilizzando il tubo "ALDH" (A), il tubo "ALDH + DEAB" (B), il "CD44-APC" tubo (C), il tubo "IgG1-APC" (D), il "ALDH e CD44-APC" tubo (e e G) o il tubo "ALDH, DEAB e CD44-APC" (F e H). Figure A, B, C, D, E e F sono stati ottenuti usando la linea cellulare SQ20B. Le figure G e H ottenuti utilizzando linea cellulare Fadu. Il colore verde indica CD44 basso / ALDH basse cellule (3T); blu scuro indica CD44 basso / alto ALDH cellule (1T); viola indica alta CD44 / ALDH basse cellule (4T); azzurro indica alte cellule di alta CD44 / ALDH (2T)._upload / 53958 / 53958fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. La conferma del potenziale del tumore di alta alta cellule CD44 / ALDH alti alti cellule ordinati CD44 / ALDH sono stati in grado di formare tumorspheres in vitro (A) in un supporto povero-FCS. barra della scala, 25 micron. Inoltre, CD44 alta / alta ALDH iperespressione di β-catenina, un marker di tumorigenicity (B). Questa quantificazione è stata eseguita da qPCR e barre di errore rappresentano SD. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Numero di celleordinato | Cultura tipo pallone | Tripsina Volume (ml) | Cultura Volume Tecnica (ml) |
| 10,000-200,000 | 1 e di un 6-pozzetti o una capsula di Petri cm 3,5 | 0.5 | 2 |
| 200,000-1,000,000 | pallone di coltura 1 T25 | 1 | 4 |
| > 1.000.000 | pallone di coltura 1 T75 | 2 | 10 |
Tabella 1: Culture Tipo beuta da utilizzare in funzione del numero di cellule filtrate particolari del formato pallone di coltura per numero approssimativo di cellule filtrate sono dati.. sono anche previste Il volume di tripsina e volume del mezzo richiesto per il tipo di pallone di coltura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo affidabile per l'isolamento successo di CSC da una linea cellulare specifica che è applicabile ad altre linee cellulari HNSCC. Isolati testa e del collo CSC sono quindi adatte per l'ulteriore caratterizzazione molecolare in vitro e validazione funzionale da trapianto in topi immunodeficienti 19. Tuttavia, alcune modifiche possono essere testate seconda popolazione lato o le alte percentuali alta / ALDH CD44 presenti nella linea cellulare parentale. Ad esempio, se la percentuale di cellule nella popolazione lato è troppo basso in una linea cellulare particolare, l'elevato / ALDH alta smistamento CD44 può essere effettuata direttamente. I marcatori utilizzati in questo studio possono essere sostituiti da altri marcatori appropriati per la linea cellulare studiato come CD133 alta 34 o CD10 alta 35.
Questo protocollo si basa su due cernite cellulari. Tre colori di smistamento con SP + CD44 + ALDH non era possible con le linee cellulari testate. In primo luogo, le linee di cellule parentali testati qui presenti meno del 5% di SP e meno del 10% alta / ALDH elevati cellule CD44 nel SP. Pertanto, SP / CD44 alta / alta ALDH rappresentano meno dello 0,5% della linea cellulare dei genitori. Quindi, una prima cernita SP è necessaria per arricchire la popolazione CD44 cellule di alta e / o ALDH elevati. In secondo luogo, per ordinare 1% della linea cellulare parentale, ci vogliono 5 ore per ottenere circa 300.000 cellule. Pertanto, se un ordinamento delle cellule 3 colori è intrapresa, la quantità di cellule raccolte sarà molto bassa. Inoltre, più l'ordinamento non è raccomandato in quanto potrebbe influenzare la vitalità delle cellule.
A causa della selettività di questo protocollo isolamento, la principale limitazione è il piccolo numero di CSCs ottenute. Questo potrebbe essere problematico effettuare ulteriori esperimenti, poiché non è consigliabile usarli dopo 3 passaggi a causa della rapida perdita di CD44 e Amarcatori LDH. Inoltre, prima di ogni nuovo esperimento, la percentuale di alte cellule di alta / ALDH CD44 ancora presenti nella sospensione cellulare deve essere testato per verificare il numero di CSC che ha differenziate.
È indispensabile preparare soluzione di cloridrato di Verapamil e terreno di coltura contenente EGF appena prima dell'uso come queste molecole sono molto instabili. Una soluzione madre di EGF a 20 mg / l è stabile per tre mesi a -20 ° C. Variazioni del protocollo Hoechst esistono, ma la concentrazione di colorante finale comunemente utilizzato è 5 mg / ml. Inoltre, nel corso del primo smistamento, diverse composizioni di coltura dovrebbero essere testati in base alla linea cellulare utilizzato. Una volta che le condizioni di smistamento vengono convalidati, è necessario controllare le proprietà della popolazione cellulare ordinato utilizzando diversi metodi (sezione 4).
marcatori di superficie cellulare, l'attività ALDH e la capacità di efflusso coloranti vitali sono stati già utilizzati individually nella letteratura per isolare CSC da HNSCC. Tuttavia, il protocollo qui descritto ha il vantaggio unico di utilizzare combinazioni di vari marcatori per conseguire un'elevata specificità isolatamente CSC da linee cellulari HNSCC. Inoltre, il CD44 ordinamento può essere realizzata con un anticorpo anti-CD44 coniugato con magnetici microsfere e filtrate con una colonna magnetica 36, ma questo metodo è applicabile solo a marcatori di superficie cellulare e non può essere utilizzato per un ordinamento ALDH, impedendo doppia cernita . Un altro metodo utilizzato per ottenere CSC è la cultura tumorsphere da tumori primari 37 o xenotrapianti 38. Tuttavia, l'acquisizione di questi tumori primari o xenotrapianti sono associati a limitazioni etiche.
Poiché questo metodo di isolare CSC HNSCC vitali, possono essere utilizzati (dopo aver verificato la loro tumorigenicità) in una serie di esperimenti che misurano la funzione fisiologica di queste cellule. Esso consente pertanto la valutazione del comportamentodi CSC in seguito diversi approcci terapeutici (radioterapia, chemioterapia). Consente inoltre lo studio dei vari parametri biologici quali la migrazione / invasione, la riparazione del DNA, segnalazione cellulare, ecc. Quindi, ottenendo CSC da diverse linee cellulari è una scelta interessante per indagare CSC proprietà.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
References
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