Abstract
尽管在头颈部鳞状细胞癌（头颈部鳞癌）进展的认识的进步，五年存活率因局部复发和远处转移仍然很低。一个假设来解释这一复发是呈现固有化疗和放射抗性癌干细胞样细胞（CSCs的）的存在。为了开发新的治疗策略，有必要有验证的靶向治疗的有效性的实验模型，因此具有用于肿瘤干细胞的鉴定和分离的可靠方法。为此，我们提出了一个协议，用于的CSCs的从人HNSCC细胞系依赖于通过荧光激活细胞进行的两个连续细胞分类法分选（FACS）的组合的隔离。第一种是基于的CSCs的属性以过表达的ATP结合盒（ABC）转运蛋白，从而排除除其他外，重要的DNA染料例如Hoechst的33342的细胞进行排序与第是方法被标识为一个“侧群”（SP）。作为SP细胞代表低百分比的亲代细胞的（<5％），越来越相是必要的，以便在第二细胞分选之前增加其数量。下一步允许该拥有另外两个头颈部鳞癌干细胞的特性即细胞表面标志物CD44（CD44 高 ）和乙醛脱氢酶的过表达（ALDH 高 ）的高表达细胞的选择。因为使用单个标记的具有许多局限性和缺陷对于CSCs的，SP的组合的分离，CD44和ALDH标记将提供来隔离为需要的活细胞进一步分析和功能分析的CSCs的有用工具。的CSCs的干细胞样特征终于在体外通过tumorispheres的形成和β连环蛋白的表达进行验证。
Introduction
头颈部鳞状细胞癌（头颈部鳞癌）是全球常见的恶性肿瘤之一，尽管在目前的治疗进展，晚期患者预后较差。患者的总的5年存活率为30％左右，尽管的治疗方法包括手术，化疗放疗和靶向疗法的组合。最近的研究属性局部复发和远处转移癌干细胞样细胞的抗癌如下1疗法的生存（CSCS）。。有越来越多的证据支持细胞呈递的各种实体肿瘤，包括乳腺癌，脑癌，前列腺癌，肺癌，结肠癌，胰腺癌，肝和皮肤2-干细胞特性（未分化的状态，自我更新和分化的能力，和端粒酶活性）的存在10。但是，肿瘤干细胞的起源仍不清楚11,12。它们可能会导致从正常干细胞3,13或dedifferen的恶性转化该收购的CSC样的功能14,15肿瘤细胞的tiation。因此，了解有关肿瘤干细胞独特的途径将提供深入了解早期诊断和治疗性头颈部鳞癌。
已经提出了肿瘤干细胞也具有该躲避标准化疗和放疗抗性表型，导致肿瘤复发相比大块肿瘤细胞16-19的和被本地化为低氧龛20。多种因素已被提出来解释的CSCs的这些电阻，如倾向静止，增强DNA修复，上调细胞周期控制机制，和自由基清除21。此外，一些癌基因的分子途径可以具体在的CSCs 17激活。为了改善的CSCs进一步靶向疗法的知识，我们需要确定和的CSCs的隔离可靠的方法，因为干细胞相关的标记物中的异质各种癌症22。
在头颈部鳞癌，干细胞样肿瘤起始细胞已经从初级的肿瘤患者通过排序表达不同的生物标志物CSC（如药物转运蛋白的表达23，CD44 高 ，CD24 CD133 低 高的c-Met +表型10,24细胞中分离出来， 25，或ALDH活性高 26）或原发性培养的肿瘤病人，形成具有CSC性质squamospheres。尽管如此，squamospheres的第二代后显着降低，从而使作进一步鉴定一个小样本研究27。因此， 在体外测定从良好建立的细胞系开始是一个更简单的解决方案，以提高的CSCs的知识来设计的实验。
本文的目的是提出使用多参数流式细胞仪分析来隔离HNSCC细胞系的CSCs的方法第二细胞分选。 CD44在相关的几个CSCs的属性，包括ALDH活性的表达，侧群（SP）的表型，球体形成的能力和致瘤性被用来分离和鉴定的CSC的该亚群。 CD44，细胞表面糖蛋白，是参与细胞粘附和迁移。 CD44在许多实体瘤中高度表达的CSCs 28，包括头部和颈部癌症模型29-31。此外，CD44 高细胞可在体内产生肿瘤的异质性，而CD44 低细胞不能10。在SP测定是基于细胞的差动电位通过ATP结合盒（ABC）家族的CSC膜内过表达转运蛋白的向外排的Hoechst的染料22。此法包括使用ABC转运抑制剂如控制样品中维拉帕米。醛脱氢酶（ALDH）是参与转换视黄醇与沤胞内酶早期干细胞分化过程中25,26酸inoic。显示出在头颈部鳞癌26日高点 ALDH活性秀干细胞样细胞的行为和ALDH 高细胞的极少数细胞能够在体内 26,32产生肿瘤。
这些标记和属性的组合物成功地用于由贝特朗（E T）人研究在体外和这些的CSCs的体内光子和碳离子辐射19的电阻。其结果清楚地表明，不同的细胞标记和属性的组合是用在HNSCC的CSCs种群比单标记的方法有用的研究更多的选择性。
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Protocol
根据对动物保健当地指南进行所有动物的程序。这项研究的所有细节是由CECCAPP，法国伦理委员会批准。
1.由赫斯特染料流出试验选择侧群（SP）的
- 染色50000000细胞用Hoechst 33342染料。
- 准备两个15毫升锥底无菌试管：一管标记为“赫斯特”，一个标有“赫斯特和维拉帕米”。制备的10ml无菌水中的5mM盐酸维拉帕米溶液。制备用于干细胞的培养基（CM）。
- 以制备用于CSC（CM-CSC）是CM，结合以下内容：Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）：F12（1：3，体积比），胎牛血清为5％（FCS），0.04毫克/升氢化可的松，100U / ml青霉素，0.1克/链霉素的L和20微克/升表皮生长因子（EGFR）的。
- 在层流罩，trypsinize细胞。取出介质，其中s洗terile磷酸盐缓冲盐水（PBS），并加入1 ml胰蛋白酶 - EDTA（0.5克/升）为75平方厘米的烧瓶中。孵育在37℃下3分钟。停止通过添加用于亲代细胞系培养基中的反应。计数使用细胞计数器细胞的数目。
- 为了制备用于亲代细胞系（CM-P）的是CM，有10％FCS，0.4毫克/氢化可的松L，100U / ml青霉素和0.1 g / L的链霉素）补充的DMEM。
- 稀释在步骤1.1.2获得，以获得在CM-P 10 7个细胞/ ml的细胞悬浮液。分裂中制备的2管中的细胞悬浮液：将100微升（10 6个细胞）在管“的Hoechst和维拉帕米”和4毫升（4×10 7个细胞）在管“Hoechst公司”。
- 在样本“赫斯特和维拉帕米”，加入10微升5毫米盐酸维拉帕米溶液（终浓度：0.5毫米），轻轻混匀。添加1克/升的Hoechst溶液5微升（最终浓度：0.1克/升）。在样品＆＃34;赫斯特“，加入1克5微升/升赫斯特每106 个细胞溶液（200μl总）从今以后，继续使用铝箔直接光线照射的保护样本。
- 孵育在水浴所有试管在37℃下为1小时30分钟。轻轻混匀，每次15分钟，以防止细胞沉淀下来。
- 离心管，在250×g离心在4℃下5分钟。除去上清，悬浮颗粒每用2毫升1X PBS的。
- 离心管，在250×g离心在4℃下5分钟。除去上清液。在PBS中稀释悬浮“的Hoechst和维拉帕米”粒料在500微升5毫克/升的碘化丙啶（PI）的缓冲液和4毫升5毫克/升的PI在PBS缓冲液中稀释“Hoechst的”颗粒。
- 通过一个70微米的细胞滤网转移样品溶液到在流式细胞仪除去团粒，收集的单个细胞在试管样品摄取。保持冰样本，并利用铝箔直接光照保护。
- 准备两个15毫升锥底无菌试管：一管标记为“赫斯特”，一个标有“赫斯特和维拉帕米”。制备的10ml无菌水中的5mM盐酸维拉帕米溶液。制备用于干细胞的培养基（CM）。
- 一世侧群通过细胞分选剔除赫斯特染料的染料溶液。
- 上术分拣机的流用下列参数进行Hoechst的阴性细胞分离：紫外激光（355纳米），2个检测器，蓝色的赫斯特（450/50 BP）和红色的Hoechst（610/20 BP）滤波器的紫外激光路径上，并且2收藏家。
- 首先，分析在作为用于染色和流式细胞仪建立的阳性对照样品“Hoechst公司”。
- 使用流式细胞仪软件，对“环球表”窗口中，点击“点图”（第五顶部右图），并创建全球工作表上的图表。在纵坐标，用鼠标右键，选择FSC-A（前向散射）和横坐标，SSC-A（侧散射）（ 图1A）。以同样的方式，创建一个SSC-W与SCC-H点图。在这第二点图，创造出P1区域，单击“多边形门”（第十四右上图）（ 图1B）33。
注：P1地区将包括单细胞和辨别双峰。 - 可选：通过创建FSC-A与PI门上P1排除PI阳性细胞。在这个散点图中，选择PI人口负（P2）排除PI阳性死细胞。
- 使用流式细胞仪软件，对“环球表”窗口中，点击“点图”，创造了全球工作表上的图表。在纵坐标，用鼠标右键，选择蓝色的Hoechst-A和横坐标，红赫斯特-A。随着人口右击，选择“显示人口”和P1。在这点图，创建一个区域（P2）选择出现作为细胞的主要群体（ 图1C）左侧的侧臂负赫司特染料侧群（SP）细胞。
- 分析样品“赫斯特”，并收集10000个事件。以确保该门的P2，其代表的SP的人口，处于有利位置，分析样品“的Hoechst和维拉帕米”（10,000个事件）观察SP人口（ 图1D）的消失。
- 收集在含有1ml的CM-CSC在1.1.1.1制备15毫升管中的SP的Hoechst染料阴性细胞。
- 在细胞分选结束后，离心分离机，在250×g离心5分钟将细胞悬浮液，取出上清液并用1ml的CM-CSC的悬浮颗粒。计数使用细胞计数器分选的细胞的数量和转移的细胞的适当数量的培养瓶（ 见表1）。添加CM-CSC和在37℃和5％的CO 2气氛中孵育。
- 保持为最大的2次传代在相同条件下培养的细胞，直到有一个至少5×10 7个细胞（参见步骤3，“细胞培养法”）的。
- 上术分拣机的流用下列参数进行Hoechst的阴性细胞分离：紫外激光（355纳米），2个检测器，蓝色的赫斯特（450/50 BP）和红色的Hoechst（610/20 BP）滤波器的紫外激光路径上，并且2收藏家。
2. CD44 高 / 高 ALDH在侧群分类子群体的选择
- 染色50000000 SP细胞的ALDH检测试剂盒和CD44抗体。
- 预备七15毫升标记无菌试管如下：“未染色的”（管一），“CD44-APC”（管b）中，“的IgG1-APC”（管c）中，“ALDH”（管d）中，“ALDH和DEAB “（管五），”ALDH和CD44-APC“（管F），”ALDH，DEAB和CD44-APC“（管克）。保留所有试管和试剂在4℃染色过程中。
- 准备缓冲液A 4.5毫升缓冲1（包含在套件中）和45微升CD44-APC（别藻蓝蛋白）抗体（稀释1：100）。用100μl缓冲液1和的IgG1-APC抗体的1微升（：100稀释1）制备的缓冲液B。制备缓冲液C用4ml缓冲液1和20μl试剂盒的试剂。
- 以10 7个细胞/ ml制备预先分选的细胞（步骤1.2.5）的细胞悬浮液。添加细胞悬浮液的100微升（10 6个细胞）至铝管a，b和c和4毫升（4×10 7个细胞）至管F。暂时不要把细胞管D，E和g。
- 离心含有在250 xg离心细胞5分钟的管中。除去上清液，并在管的a，b和c在100μl缓冲液1的悬浮粒料添加5微升二乙基氨基的苯甲酮（DEAB），的ALDH抑制剂管e和g。
- 悬浮细胞在管F用4ml试剂C，并立即转移100μl的成管d，e和克孵育在水浴所有试管在37℃下30分钟，并使用铝箔从直接曝光保护。 15分钟后，轻轻地混合细胞悬液涡旋，以防止细胞沉淀。
- 从这一刻起，保持在冰上管，并使用铝箔直接光线照射的保护。离心机在4℃以250×g离心5分钟，所有管去除上清。
- 在4毫升和管b和g用100微升缓冲液A重悬管的C 100微升缓冲B.要在另一管，悬浮管F加入100微升缓冲液1孵育10分钟，在4℃;C。
- 离心机在4℃以250×g离心5分钟，所有管去除上清。在250 xg离心再次用1ml缓冲液1（4毫升管f）和离心机冲洗一次，在4℃5分钟。去除上清。重悬在4毫升，并在1毫升缓冲液1的所有其它管管F沉淀。
- 通过70微米的细胞过滤后将样品解决方案，在流式细胞仪除去团粒，收集的单细胞在试管适当样品吸收。
- 在CD44 高 / 高 ALDH细胞荧光人口的分离激活细胞分选。
- 执行CD44 高 / ALDH 高细胞上流式细胞分选仪的流动具有以下参数排序：用FITC过滤器（530/30）1蓝色激光路径上蓝激光（488纳米）和红激光（633纳米），1检测器探测器的APC滤波器（二十○分之六百六）和2收藏家红色激光路径上。
- 使用流式细胞仪软件，点击“点普罗T“（第五右上图），如第1.2.1.2所述创建FSC-A与SSC-A点图，以检查细胞形态，并选择一个带SSC-W与SSC-H的单细胞组成的群体点图。
- 使用流式细胞仪软件，对“环球表”窗口中，点击“点图”，创造了全球工作表上的图表。在纵坐标，用右键点击，以选择双染人群选择APC-A和横坐标，FITC-A。用管D和E选择ALDH 高细胞（ 图2A）创建一个门。注：阳性细胞与DEAB（ 图2B）处理管É消失。
- 在同一图中，用管b和c以选择CD44 高细胞（ 图2C和2D）创建第二栅极。阳性细胞消失含有的IgG1-APC管。分析管f和g，并创建第三个门，其中包括CD44 高 / ALDH <SUP>高细胞（ 图2E和2F）。
注意：如果阳性细胞存在于含的IgG1-APC（ 图2D）的管中，细胞和APC染色抗体之间的相互作用是不特定。
- 在同一图中，用管b和c以选择CD44 高细胞（ 图2C和2D）创建第二栅极。阳性细胞消失含有的IgG1-APC管。分析管f和g，并创建第三个门，其中包括CD44 高 / ALDH <SUP>高细胞（ 图2E和2F）。
- 收集CD44 高 / 高 ALDH细胞进入有1ml CM-CSC的15毫升管。还低收集CD44 低 / ALDH成含有1ml的CM 19的15毫升管。注意：如步骤1.1.1.1说明准备CM-CSC。
- 离心细胞悬浮液在250×g离心5分钟，去除上清，并用1ml的CM-CSC的悬浮颗粒。计数排序细胞的数目。
3.细胞培养法
- 如上所述细胞的双分选后，板已排序的细胞进入一个合适的培养瓶（ 表1）与CM-CSC在37℃，5％的CO 2。经过18-24小时，检查，如果细胞已粘附和改变培养基。改变培养基每3天，直到扩张菌落大于50％汇合更大。
- 使用胰蛋白酶为0.5g / L的适当体积- EDTA（ 表1），从培养瓶中trypsinize细胞。孵育细胞3至5分钟，在37℃。添加CM-CSC（ 表1）的适当体积以停止胰蛋白酶的作用。
- 计数得到的细胞和板4×10 5个细胞在与CM-CSC 175平方厘米培养瓶中的数量。在37℃和5％的CO 2。在这一集中，24小时的倍增时间细胞就会7天70％汇合。
- 它们经历了3代之前使用的CSCs 在体外 或体内实验。
4.确认肿瘤潜力和CSC特性
- 肿瘤球形成以确认CD44 高 / ALDH的肿瘤潜力高细胞。
- 在3.2中描述Trypsinize细胞。 1×10 6个细胞添加到15毫升管中并离心，在250×g离心5分钟。除去上清液并重新悬浮在DMEM中沉淀：F12（3:1）培养基无FCS，20纳克/毫升的rhEGF的，肝素和1x B27的4毫克/升。孵育在6孔低锚固板培养瓶中的细胞，在37℃和5％ 的 CO 2。
注意：使用的DMEM：F12（3：1）含有FCS 5％，20纳克/毫升的rhEGF的，4毫克/肝素L的和1x B27，如果细胞不不含FCS生长介质。 - 观察播种（ 图3A）之后的肿瘤球形成具有从4至10天的光学显微镜。
注：肿瘤球体直径应大于35微米。 CD44 高 / ALDH 高细胞将显示数量和大小方面具有更快和更增强的肿瘤球形成相比CD44 低 / ALDH 低 。
- 在3.2中描述Trypsinize细胞。 1×10 6个细胞添加到15毫升管中并离心，在250×g离心5分钟。除去上清液并重新悬浮在DMEM中沉淀：F12（3:1）培养基无FCS，20纳克/毫升的rhEGF的，肝素和1x B27的4毫克/升。孵育在6孔低锚固板培养瓶中的细胞，在37℃和5％ 的 CO 2。
- 体内致瘤性的评估后，在NOD-SCID小鼠CD44 高 / 高 ALDH细胞皮下注射。
- 排序后，在三个不同浓度（10 4个细胞/ ml，10 5个细胞/ ml，和10 6个细胞/ ml）再悬浮细胞于PBS中。注入皮下100微升的10 4个细胞/ ml（10 3个细胞）的6只小鼠的右胁区域。执行相同的10 5个细胞/ ml（10 4个细胞）和10 6细胞/ ml（10 5个细胞）。
注：下稀释比10 3个细胞可以进行测试。 - 注入在左翼区域的CD44 低 / ALDH 低细胞的相同浓度。长达10周监测注射的小鼠看到肿瘤进展19。
- 排序后，在三个不同浓度（10 4个细胞/ ml，10 5个细胞/ ml，和10 6个细胞/ ml）再悬浮细胞于PBS中。注入皮下100微升的10 4个细胞/ ml（10 3个细胞）的6只小鼠的右胁区域。执行相同的10 5个细胞/ ml（10 4个细胞）和10 6细胞/ ml（10 5个细胞）。
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Representative Results
从头颈部鳞癌细胞系肿瘤干细胞的分离必要的，因为肿瘤干细胞的亲本细胞系的比例很低的两个连续排序。第一分类是基于肿瘤干细胞的排除由于药物转运蛋白赫司特染料的能力。这导致获得的排序的总的细胞群体（ 图1）的1-5％。在赫斯特染色阴性细胞分选，通过查看FSC-A与SSC-A散点图（ 图1A）检查大小和排序细胞的肉芽。然后，通过使用SSC-W与SSC-H散点图和选择人口P1（ 图1B）鉴别双峰和细胞碎片。在此P1的人口，创造赫斯特红-A与赫斯特蓝点图。标有“Hoechst的”管中，SP显示为来自主细胞群（ 图1C）的左侧臂。当他们AR这人口必须消失e为维拉帕米（ 图1D），ABC转运抑制剂治疗。在PI染色允许PI阳性死细胞排除，因为这人口下尺度上的Hoechst红的水垢（ 图1C和1D，蓝色椭圆）。
第二细胞分选是基于这使得0.5-2％从先前排序（ 图2）的SP细胞采集的CD44受体与高ALDH酶活性的高表达。排序之前，使用各种控制。首当其冲是“ALDH”，并以放置第一个门上FITC 高细胞（ 图2A和2B）所需的“ALDH + DEAB”管：ALDH 高细胞被门上FITC-A与APC-A点使用“ALDH”管（ 图2A）的情节。大门的有利位置用的是“检查ALDH +的DEAB“管：作为DEAB抑制ALDH阳性细胞必须消失从浇口（ 图2B）如果它们不，改变反应条件（通过增加DEAB例如量）第二控制是在” CD44-APC“和”的IgG1-APC“管这允许定位在使用与CD44-APC抗体（ 图2C）染色的细胞的APC 高细胞（ 图2C和2D）的第二栅极，该人口必须与消失含有的IgG1-APC细胞（ 图2D）控制管。如果没有，与抗体的键是不特定与BSA 0.5％应该添加到来自抗体反应过程中的ALDH检测试剂盒缓冲器1。最后，第三控制涉及“ALDH和CD44-APC”管“ALDH，DEAB和CD44-APC”管（ 图2E，2F，2G和2H）。双站进不去ALDH / CD44管被用于最后的栅极定位在双阳性细胞（ 图2E），并且在同一管DEAB处理是验证ALDH 高细胞消失（ 图2F）的控制。
此协议用于从SQ20B和FADU细胞系的CSCs排序。当排序首次完成上一个新的细胞系，以确保排序细胞具有干细胞样细胞的属性，有必要确认其肿瘤潜力。一项所述的干细胞样细胞特性之一是它能够在体外形成tumorspheres在FSC培养基的能力。在此条件下，唯一的癌症干细胞样细胞能存活并增殖（ 图3A）。此外，定量PCR实验表明在CD44 高 / ALDH 高细胞（ 图3B）β连环蛋白（干细胞样特性的标记物）的高表达，以及BMI-1和Notch 19 </ SUP>。最后，CD44 高 / 高 ALDH细胞也能在低注射量与CD44 低 / 低 ALDH室19时相比，形成肿瘤。
图1：侧群不包括赫斯特染料的分离 （A）FSC-A与SSC-A点图。 （B）SSC-W与SSC-H点图。 （C，D），赫斯特红-A与赫斯特蓝-A采用了“赫斯特”管（C）或使用“赫斯特和维拉帕米”管（D）点图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：所以 从Hoechst染色阴性细胞 CD44 高 / ALDH 高 细胞rting。FITC-A与使用“ALDH”管（A）中，“ALDH + DEAB”管（B）中，“CD44-APC”APC-A点图管（C）中，“的IgG1-APC”管（D）中，“ALDH和CD44-APC”管（E和G）或“ALDH，DEAB和CD44-APC”管（F和H）。图A，使用SQ20B细胞系获得了B，C，D，E和F。图G和H使用法度细胞系获得。绿色表示CD44 低 / 低 ALDH细胞（Q3）;深蓝色表示CD44 低 / 高 ALDH细胞（Q1）;紫色表示CD44 高 / 低 ALDH细胞（Q4）;淡蓝色表示CD44 高 / 高 ALDH细胞（Q2）。_upload / 53958 / 53958fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图 3：排序CD44 高 / 高 ALDH 细胞CD44 高 / 高 ALDH 肿瘤 细胞 潜能的确认能够在一个贫穷的-FCS介质上形成tumorspheres 在体外 （A）。比例尺，25微米。此外，CD44 高 / 高 ALDH过度表达β-catenin的，致瘤性（B）的标志。这种量化已通过qPCR和误差棒进行代表SD。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 细胞数量分类 | 培养瓶型 | 胰蛋白酶量（ml） | 培养基量（ml） |
| 10,000-200,000 | 一个6孔板的1个孔或3.5公分培养皿 | 0.5 | 2 |
| 200,000-1,000,000 | 1 T25培养瓶中 | 1 | 4 |
| > 1,000,000 | 1 T75培养瓶 | 2 | 10 |
表1： 培养烧瓶型根据分选的细胞的数量使用培养烧瓶大小的细则排序给出细胞的近似数量。还提供了胰蛋白酶和用于培养瓶中类型所需介质的体积的体积。
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Discussion
这个协议描述的CSCs的从特定细胞系适用于其它HNSCC细胞系中成功地分离出一种可靠的方法。孤立的头颈部肿瘤干细胞是那么适合在免疫缺陷小鼠19 在体外和功能验证进一步分子表征移植。然而，一些修改可以根据侧群或存在于亲本细胞系的CD44 高 / ALDH 高百分比进行测试。例如，如果细胞在侧人口的百分比太低在特定细胞系中，CD44 高 / ALDH 高排序，可直接执行。在此研究中使用的标记物可以通过适合于该细胞系的其他标记物来代替研究如CD133 高34或CD10 高35。
此协议是基于两个细胞分类法。三色与SP + CD44 + ALDH排序并不possiblË与测试的细胞系。首先，亲代细胞系在这里测试的SP本小于5％和小于10％的CD44 高 / ALDH 高细胞在SP。因此，SP / CD44 高 / ALDH 高代表亲代细胞系的不到0.5％。因此，第一个SP的排序是必要的，以丰富的人口CD44 高和/或ALDH 高细胞。第二，排序的亲代细胞系的1％，这需要5小时，以获得大约300,000细胞。因此，如果有3色细胞分选时进行，收集的细胞的量将非常低。此外，较长的排序不推荐，因为它可能会影响细胞生存力。
由于此隔离协议的选择性，主要的限制是得到的CSCs的小数目。这可能是有问题的执行进一步的实验，因为它不建议之后，因为CD44和A的快速丧失的3代使用它们LDH标记。此外，每一个新的实验之前，CD44 高 / ALDH 高细胞仍然存在于细胞悬浮液的比例应以检查已分化的CSCs的数目进行测试。
当务之急是要准备盐酸维拉帕米解决方案，并在使用前含有EGF，因为这些分子非常不稳定的培养基。在20 mg / L的EGF的原液是在-20°C三个月。在Hoechst的协议的变体存在，但通常使用的最终的染料浓度为5微克/毫升。此外，第一分选过程中，不同的培养基组合物，应根据所使用的细胞系测试。一旦排序条件被验证，需要检查使用不同的方法（第4部分）的排序的细胞群体的性质。
细胞表面标记物，ALDH活性和外排活体染料的能力已经被使用individuaLLY在文献中从HNSCC隔离的CSCs。然而，在这里描述的方案具有使用以各种标记的组合，以实现从HNSCC细胞系中的CSCs隔离高特异性的独特优势。此外，CD44的排序可以用磁微珠偶联并用磁力柱36排序的抗体的抗CD44实现，但这种方法只适用于细胞表面标记物，并且不能被用于的ALDH分拣，防止双分选。用于获取CSCs的另一种方法是从原发肿瘤37或异种移植物38 tumorsphere文化。然而，这些原发肿瘤或异种移植物的采集与道德约束有关。
由于这种方法分离可行HNSCC的CSCs，它们可以被用于在一定数量的测量这些细胞的生理功能的实验（检查其致瘤后）。因此它允许行为的评估肿瘤干细胞的遵循不同的治疗方法（放疗，化疗）。它还允许各种生物参数，例如迁移/侵袭，DNA修复，细胞信号传导等的研究。因此，从不同的细胞系获得肿瘤干细胞是研究肿瘤干细胞特性的有吸引力的选择。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
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