Abstract
Apesar dos avanços na compreensão da cabeça e pescoço progressão carcinomas de células escamosas (CECP), a taxa de sobrevivência de cinco anos permanece baixa devido à recorrência local e metástases à distância. Uma hipótese para explicar esta recorrência é a presença de câncer de células estaminais-like (CSCs) que apresentam quimioterapia inerente e radio-resistência. A fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas, é necessário dispor de modelos experimentais que validam a eficácia dos tratamentos específicos e, por conseguinte, dispor de métodos fiáveis para a identificação e isolamento das CSCs. Para este fim, é apresentado um protocolo para o isolamento de linhas CSCs de células de carcinoma epidermóide humano que assenta na combinação de duas células sucessivas ordenações realizadas por células activadas por fluorescência (FACS). O primeiro é baseado na propriedade de CSCs para superexpressão ATP de Ligação a cassete (ABC) proteínas transportadoras e, portanto, excluir, entre outros, corantes de ADN vitais como a Hoechst 33342. As células classificadas com thé método são identificados como um "side population" (SP). À medida que as células SP representa uma percentagem baixa (<5%) de células parentais, uma fase de crescimento é necessária, a fim de aumentar o seu número, antes da segunda separação de células. O próximo passo permite a selecção de células que possuem outras duas características de células estaminais HNSCC ie alto nível do marcador da superfície celular CD44 (CD44 alto) e o-expressão através de aldeído desidrogenase (ALDH alta) expressão. Uma vez que a utilização de um único marcador tem numerosas limitações e armadilhas para o isolamento de CSCs, a combinação de SP, CD44 e marcadores ALDH fornecerá uma ferramenta útil para isolar CSCs para mais ensaios analíticos e funcionais que necessitam de células viáveis. As características estaminais semelhante de CSCs finalmente foi validado in vitro pela formação de tumorispheres e a expressão de β-catenina.
Introduction
carcinoma da cabeça e pescoço de células escamosas (CECP) é um tumor maligno comum em todo o mundo e apesar dos progressos em tratamentos atuais, os pacientes com doença avançada têm um mau prognóstico. A taxa de sobrevivência de cinco anos geral do paciente é de cerca de 30%, apesar da combinação de abordagens terapêuticas, incluindo cirurgia, radioterapia e quimioterapia-segmentados terapias. Estudos recentes atribuem recorrência local e metástases à distância para a sobrevivência de câncer de células estaminais-like (CSCs) após terapias anticâncer 1. Existem provas acumuladas de apoiar a existência de células que apresentam propriedades de células estaminais (capacidades de estado indiferenciado, auto-renovação e diferenciação e actividade de telomerase) em diversos tumores sólidos incluindo cancro da mama, do cérebro, da próstata, do pulmão, do cólon, do pâncreas, do fígado e da pele 2- 10. No entanto, a origem de CSCs permanece obscuro 11,12. Eles podem resultar da transformação maligna de células-tronco normais 3,13 ou dedifferenciação de células tumorais que adquirem CSCs-como características 14,15. Portanto, a compreensão percursos distintos relacionados com CSCs irá fornecer informações sobre diagnóstico e tratamento de HNSCC resistentes cedo.
Tem sido proposto que os CSCs também possuem fenótipos resistentes que contornam a quimioterapia e radioterapia padrão, resultando em recidiva tumoral em comparação com a maior parte das células tumorais 16-19 e estão localizadas em nichos 20 hipóxico. Numerosos factores têm sido propostos para explicar estas resistências de CSCs, tais como a propensão para a quiescência, reparação melhorada de ADN, sobre-regulada mecanismos de controlo do ciclo celular, e de eliminação de radicais livres 21. Além disso, várias vias moleculares oncogénicos podem ser especificamente activado em CSCs 17. A fim de melhorar o conhecimento dos CSCs para-terapias-alvo ainda mais, precisamos de métodos confiáveis para a identificação e isolamento de CSCs, devido à heterogeneidade dos marcadores relacionados com células-tronco emvários tipos de cânceres 22.
Em HNSCC, caule-como células de iniciação do tumor foram isoladas a partir de tumores primários do paciente por células que expressam diferentes biomarcadores CSC (tais como transportadores de efluxo de drogas expressão 23, CD44 alto, CD24 low CD133 alta, c-Met + fenótipo 10,24 triagem, 25, ou uma elevada actividade de ALDH 26) ou cultivar tumor primário paciente para formar squamospheres que têm propriedades CSC. No entanto, o número de squamospheres diminui dramaticamente após duas passagens, proporcionando, assim, um pequeno tamanho de amostra para caracterização adicional 27 estuda. Portanto, ensaios in vitro a partir de linhas celulares bem estabelecidas é uma solução mais fácil para projetar experiências, a fim de melhorar o conhecimento dos CSCs.
O objetivo deste artigo é propor um método para isolar CSCs de linhas celulares CECP usando citometria de fluxo multiparamétrica análise de umnd separação de células. A expressão de CD44 em correlação com várias propriedades, incluindo a actividade de ALDH CSCs, lateral População (SP) fenótipo, a capacidade de formação de esferóides e tumorigenicidade são usados para isolar e caracterizar esta sub-população de CCC. CD44, uma glicoproteína de superfície celular, está envolvido na adesão celular e migração. CD44 é altamente expressa em muitos tumores sólidos CSCs 28, inclusive em modelos de câncer de cabeça e pescoço 29-31. Além disso, células de alta CD44 pode gerar in vivo um tumor heterogêneo enquanto que as células CD44 baixas não pode 10. O ensaio SP baseia-se na diferença de potencial das células ef luxar o corante Hoechst 22 através da família de cassete de ligação a ATP (ABC) de proteínas transportadoras sobre-expressas na membrana CSC. Este ensaio inclui o uso de inibidores de transportadores ABC tais como verapamil em amostras de controlo. Aldeído desidrogenase (ALDH) é uma enzima intracelular que está envolvido na conversão de retinol para retácido inoic durante a diferenciação de células-tronco cedo 25,26. As células que exibem um comportamento de alta ALDH atividade show de haste-como células em HNSCC 26 e um número muito poucos de células de alta ALDH são capazes de gerar tumores in vivo 26,32.
A combinação destes marcadores e propriedades foi utilizada com sucesso por Bertrand e t al., Para estudar a resistência in vitro e in vivo destes CSCs de fotões e de iões de carbono radiação 19. Os resultados mostraram claramente que a combinação de vários marcadores de células e propriedades são mais seletivos para estudos úteis sobre as populações HNSCC CSCs do que as abordagens-marcador único.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes locais sobre cuidados com animais. Todos os detalhes deste estudo foram aprovados pelo CECCAPP, uma comissão de ética francesa.
1. Selecção de uma População lateral (SP) pelo corante Hoechst efluxo Ensaio
- A coloração 50 milhões de células com corante Hoechst 33342.
- Preparar dois tubos de 15 ml estéreis com um fundo cônico: um tubo rotulado "Hoechst" e um marcado "Hoechst e Verapamil". Preparar 10 ml de uma solução 5 mM de cloridrato de verapamil em água estéril. Prepara-se o meio de cultura (CM) de células estaminais.
- Para preparar CM para CSC (CM-CSC), combinar o seguinte: meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM): F12 (1: 3, v: v), 5% de soro fetal de vitelo (FCS), 0,04 mg / L de hidrocortisona , 100 U / ml de penicilina, 0,1 g / L de estreptomicina, e 20 ug / L do factor de Crescimento epidérmico (EGFR).
- Sob uma capela de fluxo laminar, trypsinize células. Remova a mídia, lavar com sterile fosfato tamponado salino (PBS) e adicionar 1 ml de tripsina-EDTA (0,5 g / l) para um frasco de 75 cm. Incubar 3 min a 37 ° C. Parar a reacção pela adição de meio de cultura utilizado para a linha de célula parental. Contar o número de células utilizando um contador de células.
- Para preparar CM para a linha celular parental (CM-P), complementar DMEM com 10% de FCS, 0,4 mg / L de hidrocortisona, 100 U / ml de penicilina e 0,1 g / L de estreptomicina).
- Dilui-se a suspensão de células obtida na etapa 1.1.2 para se obter 10 7 células / mL em CM-P. Dividir a suspensão de células em tubos preparados os 2: colocar 100 ul (10 6 células) no tubo "Hoechst e Verapamil" e 4 ml (4 x 10 7 células) no tubo "Hoechst".
- Na amostra "Hoechst e Verapamil", adicione 10 ml de 5 solução de cloridrato de Verapamil mM (concentração final: 0,5 mM) e misture delicadamente. Adicionar 5 uL de 1 g / L a Hoechst solução (concentração final: 0,1 g / L). Na amostra # &34; Hoechst ", adicionar 5 mL de 1 g / L Hoechst solução por 10 6 células (200 ul total) Daí em diante, manter as amostras protegidas da exposição à luz directa usando papel alumínio..
- Incubar todos os tubos em um banho de água a 37 ° C durante 1 hora e 30 minutos. Misture suavemente a cada 15 min para evitar que as células de se estabelecer.
- tubos de centrifugação a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender cada sedimento com 2 mL de PBS 1x.
- tubos de centrifugação a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. Ressuspender "Hoechst e Verapamil" sedimento em 500 ul de 5 mg / l de iodeto de propídio (PI) diluído em tampão PBS e "Hoechst" sedimento em 4 ml de 5 mg / L de PI diluído em tampão PBS.
- A transferência das soluções amostra através de um filtro de 70 | iM de células para remover agregados e recolher células individuais em tubos de amostra para a absorção no citómetro de fluxo. Manter as amostras em gelo e proteger da exposição à luz directa usando papel alumínio.
- Preparar dois tubos de 15 ml estéreis com um fundo cônico: um tubo rotulado "Hoechst" e um marcado "Hoechst e Verapamil". Preparar 10 ml de uma solução 5 mM de cloridrato de verapamil em água estéril. Prepara-se o meio de cultura (CM) de células estaminais.
- Eusolation da População Side Excluindo Hoechst corante classificando celular.
- Realizar a separação celular negativa Hoechst em uma citometria de fluxo classificador com os seguintes parâmetros: laser UV (355 nm), 2 detectores no caminho laser UV com Hoechst azul (450/50 BP) e Hoechst vermelho (610/20 BP) filtros e 2 colecionadores.
- Em primeiro lugar, analisar amostra "Hoechst" que serve como um controlo positivo para a coloração de citometria de fluxo e set-up.
- Usando o software citômetro, na janela "Global de Planilha", clique em "Dot Plot" (quinto topo imagem da direita) e criar um gráfico na planilha global. Em ordenada, com um clique direito, selecione FSC-A (dispersão para a frente) e em abcissas, SSC-A (dispersão lateral) (Figura 1A). Da mesma forma, criar um CSC-W contra gráfico de pontos SCC-H. Nesta segunda gráfico de pontos, para criar uma região P1, clique em "Polígono gate" (XIV topo direito de imagem) (Figura 1B) 33.
Nota: A região P1abrangem células individuais e discriminar dupletos. - Opcional: Excluir PI células positivas criando um FSC-A versus PI fechado em P1. Nesta gráfico de pontos, selecione a população negativa PI (P2) para excluir as células mortas positivos PI.
- Usando o software citômetro, na janela "Global de Planilha", clique em "Dot Plot" e criar um gráfico na planilha global. Em ordenada, com um clique direito, selecione azul Hoechst-A e na abscissa, vermelho Hoechst-A. Com um clique direito sobre a população, selecione "Mostrar população" e P1. Nesta gráfico de pontos, criar uma região (P2) para seleccionar as células Hoechst população lado corante negativo (SP) que aparece como um braço lateral do lado esquerdo da população principal de células (Figura 1C).
- Analisar a amostra "Hoechst" e recolher 10.000 eventos. Para garantir que o P2 portão, que representa a população SP, está bem posicionado, analisar a amostra "Hoechst e Verapamil" (10.000 eventos)observar o desaparecimento da população SP (Figura 1D).
- Recolher as células negativas SP corante Hoechst em um tubo de 15 ml contendo 1 ml de CM-CSC preparados em 1.1.1.1.
- No fim da separação de células, centrifugação da suspensão de células a 250 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante e ressuspender o pellet com 1 ml de CM-CSC. Contar o número de células classificadas usando um contador de células e transferir número adequado de células para um frasco de cultura (ver Tabela 1). Adicionar CM-CSC e incubar a 37 ° C e atmosfera de 5% de CO 2.
- Manter as células em cultura sob as mesmas condições para um máximo de 2 passagens até que haja um mínimo de 5 x 10 7 células (ver passo 3, "método de cultura celular").
- Realizar a separação celular negativa Hoechst em uma citometria de fluxo classificador com os seguintes parâmetros: laser UV (355 nm), 2 detectores no caminho laser UV com Hoechst azul (450/50 BP) e Hoechst vermelho (610/20 BP) filtros e 2 colecionadores.
2. Seleção do alto / ALDH alta Sub-população CD44 na lateral População Ordenado
- Coloração 50 milhões de células SP com a Detecção Kit ALDH e CD44 de anticorpo.
- Prepare sete 15 ml tubos estéreis rotulados como segue: "Unstained" (tubo a) ", CD44-APC" (tubo b), "IgG1-APC" (Tubo c), "ALDH" (Tubo d), "ALDH e DEAB "(tubo e)", ALDH e CD44-APC "(tubo f)," ALDH, DEAB e CD44-APC "(Tubo g). Mantenha todos os tubos e reagentes a 4 ° C durante a coloração.
- Preparar tampão A com 4,5 ml de tampão 1 (contida no kit) e 45 uL de CD44-APC (aloficocianina) anticorpo (diluição 1: 100). Preparar tampão B com 100 ul de tampão 1 e 1 ul de anticorpo de IgG1-APC (diluição 1: 100). Preparar tampão C com 4 ml de tampão 1 e 20 ul de reagente do kit.
- Prepara-se uma suspensão de células das células previamente ordenadas (passo 1.2.5) em 10 7 células / ml. Adicionar 100 mL (10 6 células) da suspensão de células para tubos, b e c, e 4 ml (4 x 10 7 células) ao tubo f. Para o momento não colocar as células em tubos de d, e, g.
- Centrifugar os tubos contendo as células a 250 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as pastilhas em tubos A, B e C em 100 ul de tampão 1. Adicionar 5 uL de dietilaminobenzaldeído (deab), um inibidor da ALDH para tubos e e g.
- Ressuspender as células em tubos de f com 4 ml de reagente C e imediatamente transferir 100? l em tubos de d, e, g. Incubar todos os tubos em um banho de água a 37 ° C durante 30 min e proteger da exposição à luz directa utilizando folha de alumínio. Misture a suspensão de células suavemente em vórtex após 15 min para evitar que as células de decantação.
- A partir deste momento, manter os tubos em gelo e protegida da exposição à luz directa utilizando folha de alumínio. Centrifugar todos os tubos a 250 xg durante 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.
- Ressuspender tubo f em 4 mL e os tubos B e G com 100 ul de tampão A. Ressuspender tubo C com 100 ul de tampão B. Para os outros tubos, adicionar 100 ul de tampão 1. Incubar 10 min a 4 °; C.
- Centrifugar todos os tubos a 250 xg durante 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Lavar uma vez com 1 ml de tampão 1 (4 ml) para o tubo f e centrifugar novamente a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. Re-suspender tubo f sedimento em 4 ml e todos os outros tubos em 1 ml de tampão 1.
- Transfira as soluções de amostra através de 70 filtros celulares mm para remover agregados e recolher células individuais em tubos apropriados para a absorção de exemplo no citômetro de fluxo.
- Isolamento da alta / ALDH alta celular População CD44 por fluorescência Activated Seleção Cell.
- Realizar alta CD44 / ALDH elevada separação de células em um separador de citometria de fluxo com os parâmetros seguintes: a laser azul (488 nm) e o laser vermelho (633 nm), um detector de acordo com o caminho do laser azul com um filtro FITC (530/30), 1 detector no caminho de laser vermelho com um filtro de APC (660/20) e 2 coletores.
- Usando o software citômetro, clique em "Dot Plot "(o quinto imagem canto superior direito) para criar um FSC-A versus SSC-A gráfico de pontos, como descrito no ponto 1.2.1.2, para verificar a morfologia das células e escolha uma população composta de células individuais com um SSC-W contra o SSC-H gráfico de pontos.
- Usando o software citômetro, na janela "Global de Planilha", clique em "Dot Plot" e criar um gráfico na planilha global. Em ordenada, com um clique direito, selecione APC-A e na abscissa, FITC-A, a fim de selecionar a população manchado de casal. Criar um portão utilizando tubos d e e para seleccionar células de alta ALDH (Figura 2A). Nota: As células positivas desaparecer no tubo e tratada com DEAB (Figura 2B).
- Na mesma carta, criar um segundo portão utilizando tubos b e c, a fim de seleccionar células de alta CD44 (Figura 2C e 2D). As células positivas desaparecer no tubo contendo IgG1-APC. Analisar tubos F e G e criar um terceiro portão que inclui CD44 alta / ALDH <sup> células de alta (Figura 2E e 2F).
Nota: Se as células positivas estão presentes no tubo contendo IgG1-APC (Figura 2D), a interacção entre as células e o anticorpo de APC-coradas não é específica.
- Na mesma carta, criar um segundo portão utilizando tubos b e c, a fim de seleccionar células de alta CD44 (Figura 2C e 2D). As células positivas desaparecer no tubo contendo IgG1-APC. Analisar tubos F e G e criar um terceiro portão que inclui CD44 alta / ALDH <sup> células de alta (Figura 2E e 2F).
- Recolhe alta CD44 / ALDH células elevados para um tubo de 15 ml contendo 1 ml de CM-CSC. Recolha também CD44 baixo / ALDH baixo em um tubo de 15 ml contendo 1 ml de CM 19. Nota: Preparar CM-CSC tal como descrito no passo 1.1.1.1.
- Centrifugar a suspensão de células a 250 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante e ressuspender o pellet com 1 ml de CM-CSC. Contar o número de células separadas.
3. celular Método Cultura
- Após a dupla ordenação das células, tal como descrito acima, a chapa células classificadas em um frasco de cultura apropriado (Tabela 1) com CM-CSC a 37 ° C com 5% de CO 2. Depois de 18-24 horas,verificar se as células aderiram e alterar o meio de cultura. Mudar o meio de cultura a cada 3 dias até as colónias em expansão são maiores do que 50% confluentes.
- Usar o volume apropriado de tripsina 0,5 g / L - EDTA (Tabela 1) para trypsinize células a partir do balão de cultura. Incubar as células 3 a 5 min a 37 ° C. Adicionar o volume apropriado de CM-CSC (Tabela 1) para parar a acção da tripsina.
- Contar o número de células obtidas e placa 4 x 10 5 células em uma garrafa de cultura de 175 cm² com CM-CSC. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. A esta concentração, as células com um tempo de duplicação de 24 horas será de 70% confluentes em 7 dias.
- Use CSCs para in vitro ou in vivo antes de terem sido submetidos a 3 passagens.
4. Confirmação de potencial de um tumor e CSC Características
- Tumor Formação Sphere para confirmam o potencial tumor do CD44 alta / ALDHaltas células.
- Trypsinize células como descrito no ponto 3.2. Adicionar 1 x 10 6 células para um tubo de 15 ml e centrifugar a 250 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um DMEM: F12 (3: 1) meio isento de FCS, 20 ng / ml de rhEGF, 4 mg / L de heparina e 1x B27. Incubar as células num frasco de cultura de 6 poços baixo placas de fixação a 37 ° C e 5% de CO 2.
Nota: O uso de DMEM: F12 (3: 1) meio contendo 5% de FCS, 20 ng / ml de rhEGF, 4 mg / L de heparina e 1x B27 se células não crescem sem FCS. - Observar a formação de tumor esfera com um microscópio óptico a partir de 4 a 10 dias após a sementeira (Figura 3A).
Nota: O tumor esfera diâmetro deve ser superior a 35 um. As células CD44 altas / ALDH altos irá mostrar uma esfera formação mais rápida e mais reforçada tumor em termos de número e de tamanho em comparação com CD44 baixo / ALDH baixa.
- Trypsinize células como descrito no ponto 3.2. Adicionar 1 x 10 6 células para um tubo de 15 ml e centrifugar a 250 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um DMEM: F12 (3: 1) meio isento de FCS, 20 ng / ml de rhEGF, 4 mg / L de heparina e 1x B27. Incubar as células num frasco de cultura de 6 poços baixo placas de fixação a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Avaliação In Vivo de tumorigenicidade DepoisA injecção subcutânea de CD44 alta / alta Cells ALDH em camundongos NOD-SCID.
- Após separação, as células re-suspender em PBS em três concentrações diferentes (10 4 culas / ml, 10 5 culas / ml, e 10 6 células / ml). Injectar por via subcutânea 100 ul de 10 4 culas / ml (3 10 células) no flanco direito região de 6 ratinhos. Fazer o mesmo durante 10 5 culas / ml (10 células), 4 e 10 6 células / ml (10 5 células).
Nota: diluição inferior a 10 três células pode ser testada. - Injectar a mesma concentração de células CD44 de baixo Baixo / ALDH na região do flanco esquerdo. Ratos do Monitor injetado por até 10 semanas para ver a progressão do tumor 19.
- Após separação, as células re-suspender em PBS em três concentrações diferentes (10 4 culas / ml, 10 5 culas / ml, e 10 6 células / ml). Injectar por via subcutânea 100 ul de 10 4 culas / ml (3 10 células) no flanco direito região de 6 ratinhos. Fazer o mesmo durante 10 5 culas / ml (10 células), 4 e 10 6 células / ml (10 5 células).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O isolamento de CSCs de linhas celulares CECP necessários dois triagem sucessiva por causa da percentagem muito baixa de CSCs na linha de células parental. A primeira classificação baseou-se na capacidade das CSCs de excluir o corante Hoechst devido a transportadores de efluxo de drogas. Isto resultou na aquisição de 1-5% da população total de células classificadas (Figura 1). Durante a separação de células negativa Hoechst corante, verifique o tamanho e granulação de células classificadas por olhar para o FSC-A versus SSC-A gráfico de pontos (Figura 1A). Em seguida, discriminar dupletos e fragmentos de células, utilizando o SSC-W contra gráfico de pontos de SSC-H e seleccionando a população P1 (Figura 1B). Nesta população P1, criar um Hoechst Vermelho-A versus Hoechst azul-A gráfico de pontos. Com o tubo rotulado "Hoechst", a SP aparece como um braço lateral do lado esquerdo da principal população de células (Figura 1C). Esta população deve desaparecer quando eles ARe tratou-se com verapamil (Figura 1D), um inibidor de transportadores ABC. A coloração PI permite a exclusão de células mortas da PI-positivas, porque esta população está abaixo escala na Hoechst Red-A escala (Figura 1C e 1D, elipses azuis).
A segunda classificação de células baseou-se na expressão elevada da actividade enzimática do receptor e alta ALDH CD44 que permitiu a obtenção de 0,5-2% de células SP previamente ordenadas (Figura 2). Antes da triagem, foram utilizados vários controles. Os primeiros são o "ALDH" e os tubos "ALDH + deab" necessários, a fim de colocar a primeira porta em células de alta FITC (Figuras 2A e 2B): células de alta ALDH foram fechado sobre o FITC-A versus APC-Um ponto lote utilizando o "ALDH" tubo (Figura 2A). A boa posição do portão foi verificada usando o "ALDH + DEAB "tubo:.. Como DEAB inibe ALDH, células positivas devem desaparecer a partir do portão (Figura 2B) Se não, alterar as condições de reação (através do aumento da quantidade de DEAB por exemplo) O segundo controle é o" CD44-APC ", e os" tubos de IgG1-APC "o que permitiu a posicionar a segunda porta em células de alta APC (Figuras 2C e 2D) utilizando as células coradas com o anticorpo CD44-APC (Figura 2C). Esta população deve desaparecer com o tubo de controlo que continha células IgG1-APC (Figura 2D). Se isso não acontecer, o vínculo com o anticorpo não é específico e BSA 0,5% deve ser adicionado em tampão 1 do kit de detecção de ALDH durante a reação de anticorpos. Finalmente, o terceiro controle refere-se à "ALDH e CD44-APC" tubo e "ALDH, DEAB e CD44-APC" tubos (Figuras 2E, 2F, 2G e 2H). a sta duplaining ALDH tubo / CD44 é utilizado para posicionar o último portão sobre as células duplamente positivas (Figura 2E) e o mesmo tubo tratado com DEAB é um controlo para verificar se células de alta ALDH desaparecer (Figura 2F).
Este protocolo é usado para classificar as CSCs do SQ20B e as linhas de células FaDu. Quando a classificação é feita pela primeira vez, uma nova linha de células, a fim de assegurar que as células ordenadas têm propriedades células estaminais semelhantes, é necessário confirmar a sua potencial de um tumor. Uma das propriedades da célula-tronco-como é a sua capacidade para formar tumorspheres in vitro num meio isento de FSC. Sob esta condição, as células-tronco só o câncer-como pode sobreviver e proliferar (Figura 3A). Além disso, experimentos qPCR mostram uma elevada expressão de β-catenina (marcador de haste característica semelhante) em células CD44 alto / ALDH elevadas (Figura 3B), bem como Bmi-1 e o entalhe 19 </ Sup>. Finalmente, células de alta alta / ALDH CD44 também são capazes de formar tumores quando injectadas em baixas quantidades, em comparação com células CD44 / ALDH baixas 19 de baixo.
Figura 1: O isolamento de uma população lado excluindo o corante Hoechst (A) FSC-SSC-A versus um gráfico de pontos.. (B) SSC-W contra o gráfico de pontos SSC-H. (C, D) Hoechst Vermelho-A versus Hoechst azul-A gráfico de pontos utilizando o tubo "Hoechst" (C), ou com o tubo "Hoechst e Verapamil" (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Então, rting de CD44 de células de alta alto / ALDH de células negativas corante Hoechst. FITC-A versus APC-um gráfico de pontos utilizando o tubo "ALDH" (A), o "ALDH + DEAB" tubo (B), a "CD44-APC" tubo (C), o tubo "IgG1-APC" (D), o "ALDH e CD44-APC" tubo (e e G) ou o tubo de "ALDH, DEAB e CD44-APC" (F e H). Figuras A, B, C, D, E e F foram obtidas utilizando a linha de células SQ20B. Figuras G e H obtidos utilizando linha de células FaDu. O verde indica CD44 baixo / ALDH células de baixa (Q3); azul escuro indica CD44 baixo / ALDH células de alta (Q1); roxo indica CD44 alta / ALDH células de baixa (Q4); azul claro indica células CD44 alta / ALDH altas (Q2)._upload / 53958 / 53958fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Confirmação do potencial de um tumor de células CD44 alto / ALDH elevados As células seleccionadas CD44 alto / ALDH elevados foram capazes de formar tumorspheres in vitro (A) num meio pobre-FCS. Barra de escala, 25 um. Além disso, CD44 alto / ALDH alta sobreexpressam β-catenina, um marcador de tumorigenicidade (B). Esta quantificação foi realizada por qPCR e barras de erro representam SD. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Número de célulasclassificadas | Cultura tipo de balão | Volume de tripsina (ml) | Meio de Cultura Volume (ml) |
| 10,000-200,000 | Um poço de uma placa de 6 poços ou cm uma placa de Petri de 3,5 | 0,5 | 2 |
| 200,000-1,000,000 | garrafa de cultura de 1 T25 | 1 | 4 |
| > 1.000.000 | garrafa de cultura de 1 T75 | 2 | 10 |
Tabela 1: Cultura Tipo de balão para usar de acordo com o número de células classificadas Detalhes da cultura em balão de tamanho de número aproximado de células separadas são dadas.. O volume de tripsina e volume do meio requerido para o tipo de garrafa de cultura são também fornecidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo descreve um método de confiança para o isolamento bem sucedido de CSCs a partir de uma linha celular específica, que é aplicável a outras linhas de células de carcinoma epidermóide. CSCs de cabeça e pescoço isoladas são então adequado para posterior caracterização molecular in vitro e validação funcional por transplante em ratinhos imunodeficientes 19. No entanto, algumas modificações podem ser testados de acordo com a população CD44 lado ou os alta / ALDH percentagens elevadas presentes na linha celular parental. Por exemplo, se a percentagem de células na população lateral é demasiado baixo em uma linha de células particular, o elevado / alta triagem ALDH de CD44 pode ser realizada directamente. Os marcadores usados neste estudo pode ser substituído por outros marcadores apropriados para a linha de células estudados, tais como CD133 alta 34 ou CD10 alta 35.
Este protocolo baseia-se em duas células ordenações. Três cor classificação com SP + CD44 + ALDH não era pose com as linhas de células testadas. Em primeiro lugar, as linhas celulares parentais testada aqui presentes menos de 5% de SP e menos de 10% de células de alta alta / ALDH CD44 no SP. Portanto, SP / CD44 alta / ALDH alta representam menos de 0,5% da linha celular parental. Assim, uma primeira triagem SP é necessário, a fim de enriquecer a população CD44 em células de alta elevadas e / ou ALDH. Em segundo lugar, para classificar a 1% da linha de células parental, leva-se 5 horas para se obter cerca de 300000 células. Portanto, se uma separação de células 3 cores é realizada, a quantidade de células coletadas será muito baixo. Além disso, mais de triagem não é recomendado, pois pode afetar a viabilidade celular.
Devido à selectividade deste protocolo de isolamento, a principal limitação é o pequeno número de CSCs obtidos. Isto pode ser problemático para realizar experiências adicionais, uma vez que não é recomendado para usá-los depois de 3 passagens, devido à rápida perda de CD44 e Amarcadores de LDH. Além disso, antes de cada nova experiência, a percentagem de CD44 alta / ALDH células de alta ainda presentes na suspensão de células devem ser testados, a fim de verificar o número de CSCs que tem diferenciados.
É imperativo para preparar solução de cloridrato de Verapamil e meio de cultura contendo EGF imediatamente antes da utilização como estas moléculas são muito instáveis. Uma solução de estoque de EGF a 20 mg / L é estável durante três meses a -20 ° C. Variações do protocolo de Hoechst existem, mas a concentração final do corante comumente utilizada é de 5 ug / ml. Além disso, durante a primeira triagem, composições diferentes meios de cultura devem ser testados de acordo com a linha celular utilizada. Uma vez que as condições de ordenação são validados, é necessário verificar as propriedades da população de células classificados usando os diferentes métodos (Seção 4).
marcadores de superfície celular, a atividade ALDH e capacidade de efluxo corantes vitais já foram utilizadas individually na literatura para isolar as CSCs do CECP. No entanto, o protocolo aqui descrito tem a vantagem única de utilização de combinações de vários marcadores de modo a alcançar uma elevada especificidade em isolamento CSCs partir de linhas celulares de carcinoma epidermóide. Além disso, o CD44 de triagem pode ser realizada com um anticorpo anti-CD44 conjugado com micro-esferas magnéticas e ordenados com uma coluna magnética 36, mas este método é apenas aplicável a marcadores da superfície celular e não pode ser utilizado para uma triagem da ALDH, evitando dupla triagem . Outro método utilizado para obter os CSCs é a cultura a partir de tumores primários tumorsphere 37 ou 38 xenoenxertos. No entanto, a aquisição destes tumores primários ou xenoenxertos estão associados com restrições éticas.
Uma vez que este método isola CSCs CECP viáveis, que pode ser utilizada (depois de verificar a sua tumorigenicidade) em uma série de experiências que medem a função fisiológica destas células. É, por conseguinte, permite a avaliação do comportamentode CSCs seguindo diferentes abordagens terapêuticas (radioterapia, quimioterapia). Ele também permite o estudo de vários parâmetros biológicos, tais como a migração / invasão, reparo do DNA, sinalização celular, etc. Assim, a obtenção de CSCs de diferentes linhas de células é uma opção atraente para investigar as propriedades CSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
References
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
- Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
- Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
- Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
- Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
- Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
- Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
- Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
- Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
- Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
- Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
- Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
- Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
- Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
- Meinelt, E., et al. Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , BD Biosciences. (2012).
- Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
- Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
- Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
- Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
