Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تمديد الوقت الفاصل بين حيوي داخلي تصوير في الوقت الحقيقي متعددة الخلايا حيوية في المكروية ورم

Published: June 12, 2016 doi: 10.3791/54042
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,3, 1,3,4, 1,3,4
1Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Radiology, Albert Einstein College of Medicine, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام المجهر multiphoton لأداء الموسعة الوقت الفاصل بين التصوير من التفاعلات متعددة الخلايا في الوقت الحقيقي، في الجسم الحي في قرار خلية واحدة.

Introduction

وقد تبين أن نشر الخلايا السرطانية من الورم الثديية الأساسي لإشراك الخلايا السرطانية فحسب، ولكن الخلايا المضيفة اللحمية بما في ذلك الضامة والخلايا البطانية. وعلاوة على ذلك، ورم الأوعية الدموية غير طبيعي مع زيادة نفاذية 1. وبالتالي، تحديد كيفية الخلايا السرطانية، الضامة، والخلايا البطانية تتفاعل التوسط نفاذية الأوعية الدموية ودخول الوعاء الخلايا السرطانية في المكروية الورم الرئيسي المهم لورم خبيث التفاهم. يمكن فهم حركية نفاذية الأوعية الدموية، دخول الوعاء الخلايا السرطانية وآلية الإشارات الكامنة للتفاعلات متعددة الخلايا في الورم المكروية تقديم معلومات حاسمة في تطوير وإدارة العلاجات المضادة للسرطان.

وكانت الوسيلة الأساسية لدراسة الورم نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي قياس الأصباغ خارج الأوعية مثل ايفانز الزرقاء 2، وارتفاع dextrans الوزن الجزيئي (155 كيلو دالتون)3 وfluorophore أو البروتينات المشع مترافق (بما في ذلك الزلال) 4 في نقطة زمنية محددة بعد حقن الصبغة. التطورات في المجهر، وقد مكنت النماذج الحيوانية والأصباغ الفلورية التصور من العمليات الخلوية ونفاذية الأوعية الدموية في الحيوانات الحية من خلال intravital المجهري 5.

التصوير الحيوانات الحية مع الحصول على صور ثابتة، أو تسلسل قصيرة مرور الزمن على مدى عدة نقاط الوقت لا يسمح لفهم كامل لأحداث ديناميكية في المكروية الورم 6،7. في الواقع، أظهرت ثابت الحصول على الصور على مدار 24 ساعة أن الورم الأوعية الدموية هو المتسرب، ولكن ديناميات نفاذية الأوعية الدموية لم يكن لوحظ 6. وبالتالي، تمديد التصوير المستمر مرور الزمن تصل إلى 12 ساعة يلتقط حركية الأحداث ديناميكية في المكروية الورم.

يصف هذا البروتوكول استخدام الموسعة multiphot الوقت الفاصلعلى intravital المجهري لدراسة أحداث متعددة الخلايا الحيوية في المكروية الورم. وصفت أنواع خلايا متعددة في المكروية الورم مع الأصباغ عن طريق الحقن أو عن طريق استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية. عن طريق الوريد القسطرة ذيل الأصباغ الأوعية الدموية أو البروتينات يمكن حقن بعد بدء التصوير للحصول على البيانات الحركية من أحداث متعددة الخلايا في المكروية الورم. لتصوير الخلايا الحية يتعرض الورم الثديية من خلال إعداد الجراحي رفرف الجلد. يتم الحصول على الصور لمدة تصل إلى 12 ساعة باستخدام مجهر multiphoton مجهزة متعددة أنابيب مضخم (PMT) للكشف عن 8. باستخدام الفلاتر المناسبة، خوارزمية الطرح تمكن 4 أجهزة كشف PMT للحصول على 5 إشارات الفلورسنت في المكروية الورم في وقت واحد 9. عالية الدقة multiphoton حيوي داخلي المجهر يلتقط احد قرار خلية التصوير من التفاعلات ورم سدى في المكروية الورم، مما يؤدي إلى أفضل شnderstanding من نفاذية الأوعية الدموية وورم الخلايا دخول الوعاء 10-13. على وجه التحديد، ممتدة التصوير حيوي داخلي كشفت محلية شديدة، عابرة أحداث نفاذية الأوعية الدموية التي تحدث بشكل انتقائي في مواقع التفاعل بين الخلايا السرطانية، والبلاعم والخلايا البطانية (كما هو موضح المكروية ورم من ورم خبيث، TMEM 14) (13). وعلاوة على ذلك، يحدث دخول الوعاء الخلايا السرطانية فقط في TMEM ومكانيا وزمانيا ترتبط مع نفاذية الأوعية الدموية 13. وقدم قرار خلية واحدة من القوى المحركة لهذه الأحداث من الممكن من خلال استخدام موسع الوقت الفاصل بين multiphoton المجهري للخلايا fluorescently المسمى في المكروية الورم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح لاستخدام الحيوانات الفقارية، بما في ذلك موافقة مسبقة من كلية ألبرت أينشتاين للطب المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. توليد Fluorescently الأورام إعتبر والضامة المرتبطة ورم

  1. توليد الخلايا السرطانية التي fluorescently المسمى عبور الأصليين، والماوس وراثيا نموذج عفوية، الثديية السرطان حيث الماوس الثدي فيروس الورم محطة الطويلة تكرار يدفع التورام منتصف تي مستضد (MMTV-PyMT) مع الفئران المعدلة وراثيا مع الصحفيين الفلورسنت [أي، وتعزيز الفلورية الخضراء بروتين (EGFP)، وتعزيز البروتين سماوي فلوري (ECFP) أو Dendra2] 8،9.
  2. الضامة التسمية Fluorescently في الحيوانات PyMT مع fluorescently المسمى الخلايا السرطانية عن طريق عبور نماذج الماوس المعدلة وراثيا مع الصحفيين الفلورسنت محدد myeloid- وmacrophage- [أي MacGrالتابعين 15 أو الفئران MacBlue Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16].
  3. بدلا من ذلك، تولد fluorescently المسمى الأورام من خلال زرع مثلي الخلايا fluorescently المسمى PyMT الورم (مسانج)، وخطوط خلايا سرطان الثدي البشرية أو الأورام الأولية المريض حقوق الإنسان مستمد (xenografts) 11،17.
    1. زرع fluorescently المسمى الخلايا السرطانية في الفئران PyMT مسانج مع خلايا الدم النخاعي الفلورسنت المسمى بروتين لتوليد الحيوانات مع fluorescently المسمى الخلايا السرطانية وخلايا الدم النخاعي 13.
  4. ضخ 100 ميكرولتر من 10 ملغ / كغ الفلورسنت 70 كيلو دالتون ديكستران من الوريد (IV) الوريد الذيل إلى شديد الفئران جنبا إلى جنب نقص المناعة المكتسب (SCID) مع الأورام طعم أجنبي من خطوط الخلايا البشرية أو الأورام الأولية المستمدة من المريض إلى الضامة تسمية fluorescently السابقة 2 ساعة على بداية التصوير حيوي داخلي.

2. إعداد مجهر وإعداد التصوير

ملاحظة: يصف هذا الإجراء مجموعة المتابعةللتصوير حيوي داخلي على المجهر multiphoton 8.

  1. بدوره على جميع مكونات المجهر والليزر بما في ذلك أشعة الليزر ثنائي الفوتون وكشف عن.
  2. بدوره على مربع التدفئة إلى 30 درجة مئوية إلى ما قبل الحارة المرحلة. هذه خطوة حاسمة للحفاظ على درجة حرارة الفسيولوجية للحيوان.
  3. للاستخدام على مكان مجهر مقلوب حسب الطلب المرحلة إدراج على المسرح المجهر. إدراج المخصص هو ورقة من 1/8 "الألومنيوم سميكة تشكيله لتناسب في الفضاء مرحلة إدراج ومع 1" قطر من خلال ثقب في مركز للتصوير.
    1. مسح مرحلة المجهر وإدراج المسرح مع 70٪ من الإيثانول والهواء الجاف.
    2. وضع قطرة ماء كبيرة على الهدف المجهر NA 20X، 1.05 في البقاء على اتصال بصري مع غطاء زجاجي.
    3. مكان غطاء زجاجي (# 1.5 سمك) عبر منفذ التصوير على إدراج المسرح المجهر. تأمين في مكان مع الشريط المختبر.
    4. استخدام لكمة ثقب لكمة 2 سم × 2 سم حفرةفي وسادة مطاطية مرنة ووضع وسادة مطاطية على المسرح المجهر مع ثقب في لوحة تتماشى مع ثقب في إدراج مرحلة المخصصة.

3. إعداد الذيل الوريد القسطرة والكواشف لحقن أثناء التصوير

  1. قطع طول 30 سم من البولي إثيلين (PE) أنابيب.
  2. باستخدام ملقط، نقل إبرة معدنية من 31 إبرة G ذهابا وإيابا حتى تقطع من تركيب البلاستيك.
  3. باستخدام ملقط، إدراج نهاية حادة من الإبرة منفصلة في أنابيب البولي ايثيلين.
  4. إدراج 31 G الإبرة في الطرف الآخر من الأنبوب PE.
  5. حقنة ملء 1 سم مكعب مع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) وأدخله في إبرة G 31 وطرد كل الهواء من الأنبوب والإبرة مع برنامج تلفزيوني. يستخدم برنامج تلفزيوني للحفاظ على ترطيب والأسمولية الدم 9،18، ويمكن أيضا أن تستخدم المالحة لكن متساوي التوتر.
  6. حقنة ملء 1 سم مكعب مع 200 ميكرولتر من 3 ملغم / كغم 155 كيلو دالتون ديكستران-tetramethylrhodamine (TMR) أو النقاط الكمومية لوضع العلامات الأوعية الدموية.
  7. إعداد أي البروتينات عن طريق الحقن الأخرى مثل الإسوي حمض أميني 165 من نمو بطانة الأوعية الدموية عامل ألف (VEGFA 165) في حقنة 1 سم مكعب ومكان على الجليد. ضخ 0.2 ملغ / كغ VEGFA 165 19 في تركيز 0.05 ملغ / مل.

4. الإدراج في ذيل سكنى الوريد قسطرة

  1. وضع الحيوان تحت التخدير باستخدام غرفة الاستقراء مع 5٪ الأيزوفلورين مع O 2 مثل الغاز الناقل.
  2. نقل الماوس إلى منصة الجراحية بمجرد تخدير بشكل كامل ولا يستجيب لقرصة أخمص قدميه.
  3. فتح خط التخدير الأيزوفلورين إلى منصة الجراحية، إغلاق خط التخدير إلى غرفة الاستقراء ووضع مخروط الأنف على خطم الحيوان. تقليل الأيزوفلورين من 5٪ إلى 2.5٪.
  4. تطبيق مرهم للعين للعيون من الماوس لمنع جفاف أثناء التخدير.
  5. حرارة الحيوان تحت مصباح التدفئةل2 دقيقة إضافية لزيادة الدورة الدموية في الذيل مع تباطؤ دوران مع التخدير العميق.
  6. تعقيم الوريد الذيل الفأر مع الايثانول 70٪.
  7. إدراج غيض من إبرة G 31 من القسطرة التي شيدت في القسم 3 في الوريد الذيل الأفقي للحيوان، ودفع الإبرة في 2-3 ملم.
  8. سحب على حقنة لرؤية الدم، وضمان القسطرة يتم وضعها في الوريد الذيل.
  9. استخدام طول 1 سم من الشريط مختبر وضعت على الإبرة لعقد إبرة في مكان مواز إلى الوريد على طول الذيل.

5. الجلد رفرف إجراء جراحة لفضح ورم ثدي

  1. مع الحيوان على منصة الجراحية مسحة الورم والسطح البطني مع الايثانول 70٪. ملاحظة: كما وصفها، لا يتم تنفيذ هذا الإجراء جو معقم و مطهر تماما. لجلسات التصوير الطويلة حيث العدوى يمكن أن تصبح عامل التباس، فمن المستحسن استخدام تقنية العقيم المناسبة.
  2. باستخدام ستيريملقط جنيه، ورفع الجلد البطني ومع مقص العقيمة جعل شق تحت الجلد على طول خط الوسط بطني حوالي 1 سم في الطول. تجنب ثقب الغشاء البريتوني خلال شق.
  3. خفض بلطف النسيج الضام ربط الغدة الثديية وورم بعيدا عن الصفاق لفضح ورم الثدي.
  4. باستخدام مقص وملقط، وإزالة بلطف وقطع لفافة والدهون من سطح مكشوف من الورم مع المحافظة على سلامة الأوعية الدموية للورم وتقليل النزيف. هذه الخطوة حاسمة في الحفاظ على العمارة الورم والأوعية الدموية العرض من الورم.

6. إعداد الحيوان للفحص المجهري

  1. نقل الحيوان إلى مرحلة التصوير قبل تحسنت مع الورم يتعرض ضعها على ساترة على إدراج المرحلة على الهدف المجهر للتصوير. الحرص على نقل قسطرة الوريد الذيل برفق مع الحيوان حتى لا طرد الإبرة.
  2. المركز الرابعه التخدير مخروط الأنف على خطم الحيوان للحفاظ على مجموعة التخدير إلى 3٪ الأيزوفلورين.
  3. وضع الحيوان بحيث يقوم الورم في ثقب في وسادة مطاطية ويجعل الاتصال مع ساترة الزجاج.
  4. استخدام اثنين من منصات المطاط لعقد بلطف الورم في مكان واصلاحها إلى مرحلة المجهر مع الشريط مختبر للحد من الحركة خلال الحصول على الصور.
  5. تملأ الغرفة من وسادة مطاطية مع برنامج تلفزيوني للحفاظ على النسيج المائية والحفاظ على اتصال بصري مع ساترة.
  6. بدء مراقبة العلامات الحيوية للحيوان مع التحقيق الذي تجريه نبض مقياس التأكسج. نعلق جهاز استشعار كليب في الفخذ من الحيوان. بدلا من ذلك طوق الذي تم تكوينه لتناسب حول الرقبة يمكن استخدامها.
  7. وضع مربع التدفئة أكثر من الحيوان للحفاظ على 30 ° C 20.
  8. ببطء خفض مستوى الأيزوفلورين إلى 0.5-1٪ للحفاظ على التخدير والحفاظ على تدفق الدم.

7. الحصول على الصور وحقن Fluorescوالأنف والحنجرة الأصباغ وحقن البروتينات

  1. عن طريق التركيز المجهر العدسة على الخلايا السرطانية الفلورسنت على سطح الورم.
  2. تحديد مساحة من الاهتمام من خلال ايجاد مناطق مع تدفق الأوعية الدموية. اختيار مساحة من الاهتمام مع تدفق الأوعية الدموية أمر بالغ الأهمية لتقييم ورم الأوعية الدموية.
  3. مرة واحدة وقد تم اختيار المنطقة ذات الاهتمام تبديل المجهر في وضع التصوير multiphoton.
  4. تعيين الحدود العليا والدنيا للض سلسلة. تعيين الحد الأعلى للض سلسلة باستخدام الضابط التركيز لتحريك الهدف إلى الموقع بداية المطلوب والنقر على زر Z موقف "الأعلى". تحديد الحد الأعلى للض سلسلة من خلال وضع تصور شبكة الألياف الكولاجين في سطح الورم في قناة الجيل الثاني التوافقي (SHG) ومراقبة عند أي خلايا ولكن فقط ألياف الكولاجين مرئية.
    1. تعيين الحد الأدنى للض سلسلة عن طريق تحريك الهدف إلى عمق التصوير المطلوب (typicaLLY 50-150 ميكرون)، والنقر على موقف Z زر "أسفل".
    2. تعيين حجم الخطوة عن طريق كتابة القيمة المطلوبة في حقل حجم الخطوة. تحديد حجم الخطوة بناء على اعتبارات لقرار واكتساب الوقت (عادة ما تستخدم 2 ميكرون عالية الدقة إعادة الإعمار 3D و 5 ميكرون خلاف ذلك).
  5. تعيين الفاصل الزمني الفاصل بين طريق التحول إلى لوحة الوقت الفاصل بين ودخول الفاصل الزمني المطلوب في حقل الوقت الفاصل بين. لقرار الزمني الأمثل تعيين الفاصل الزمني إلى 0 ثانية عن التصوير المستمر. ملاحظة: للحصول الطويل الوقت الفاصل بين التصوير فمن المستحسن تعيين الفاصل الزمني إلى 10 ثانية بين الاستحواذ لتجديد السائل الغمر موضوعي.
  6. مرة واحدة وقد تم تحديد المعلمات للتصوير، حقن ببطء 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR.
    1. إزالة المحاقن مع برنامج تلفزيوني في القسطرة الوريد الذيل واستبدالها مع حقنة تحتوي على 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات في لىشمال شرق.
    2. حقن ببطء 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR في الماوس، مع الحد الأقصى لحجم 200 ميكرولتر، واستبدال المحاقن مع حقنة تحتوي على برنامج تلفزيوني. خطوة حاسمة: إجراء الحقن ببطء واتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب الحصول على حل خارج الوريد.
  7. بدء الاستحواذ على Z كومة الوقت الفاصل بين التصوير من خلال النقر على Z-ستاك وأزرار الوقت الفاصل بين لخفض لهم ومن ثم النقر على زر التسجيل.
  8. إن أعدت dextrans الفلورسنت أخرى، أي ثيوسيانات 10 كيلو دالتون ديكستران-فلوريسئين (FITC)، أو البروتينات، أي VEGFA 165، مقدما، ضخها بعد بدء الحصول على الصور لفي = 0 بداية دقيقة.
    1. إزالة المحاقن مع برنامج تلفزيوني في الوريد القسطرة الذيل واستبدال مع حقنة تحتوي على 10 كيلو دالتون ديكستران-FITC أو VEGFA 165 مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات في الخط.
    2. حقن ببطء عن طريق الحقن في الماوس عن طريق القسطرة الوريد الذيلواستبدال الحقنة مع حقنة تحتوي على برنامج تلفزيوني.
  9. كل 30-45 دقيقة، وضخ ببطء 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني أو المالحة للحفاظ على الماء للحيوان.

8. القتل الرحيم

  1. عند انتهاء الحصول على الصور، الموت ببطء الحيوان.
    1. زيادة الأيزوفلورين إلى 5٪.
    2. حفاظ على الحيوانات أقل من 5٪ الأيزوفلورين حتى 30 ثانية بعد أن يتوقف عن التنفس وإزالة الحيوان من المرحلة.
    3. أداء خلع عنق الرحم للتأكد من القتل الرحيم الكامل.

تجهيز 9. صورة

  1. الحصول على صور في ملفات TIFF 16 بت لكل قناة على حدة في كل نقطة زمنية وحفظ بالتتابع.
  2. أداء فصل التداخل الطيفي (أي GFP وCFP)، والقضاء على الانحراف س ص وجيل من افلام من متواليات الوقت الفاصل بين استخدام أساليب أنشئت في ImageJ 9. أداء إعادة بناء سطح 3D من الصور عالية الدقة 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تمديد الوقت الفاصل بين حيوي داخلي المجهري تمكن واحد قرار خلية التصوير من عمليات متعددة الخلايا في المكروية الورم. بواسطة خلايا fluorescently وضع العلامات الورم، الضامة، ومساحة الأوعية الدموية، وتصور شبكة الألياف الكولاجين باستخدام الثانية إشارة الجيل التوافقي، يتم تعقب حجرات متعددة في وقت واحد المكروية الورم أثناء التصوير. الخلايا السرطانية المسمى مع البروتينات الفلورية يمكن أن تتولد في الفئران المعدلة وراثيا على غرار ما حدث في الفئران MMTV-PyMT-Dendra2، مع الخلايا السرطانية الثديية المسمى مع Dendra2 (الشكل 1A). عن طريق عبور هذه الفئران المعدلة وراثيا مع الفئران Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP، التي لديها الضامة المسمى مع ECFP، وصفت كلا الخلايا السرطانية والضامة في الفئران MMTV-PyMT. مع استراتيجية العلامات المزدوجة من الخلايا السرطانية والضامة، والتفاعل المباشر للخلايا النوعين يمكن تصور في الوقت الحقيقي (الشكل 1A). بالإضافة إلى ذلك، وسرطان الثدي خلايا خطوط الإنسان أو الخلايا السرطانية المشتقة من المريض transduced مع GFP يمكن استخدامها لتسمية الخلايا السرطانية. يمكن أن توصف الضامة باستخدام fluorescently المسمى 70 كيلو دالتون ديكستران الذي يتراكم في الضامة البلعمة (الشكل 1B). وقد عززت هذه الأساليب دراسة أحداث متعددة الخلايا الحيوية مثل ورم خلايا البلاعم تدفق الحركة، نفاذية الأوعية الدموية ودخول الوعاء الخلايا السرطانية. لرؤية التغييرات في نفاذية الأوعية الدموية السرطانية، (ويوصى 155 كيلو دالتون أو أعلى 9،13،21،22) وfluorescently المسمى عالية الوزن الجزيئي ديكستران أو تستخدم النقاط الكمومية لتسمية مساحة الأوعية الدموية (الشكل 1). 155 كيلو دالتون ديكستران أو الكم النقاط هي كبيرة بما فيه الكفاية أنها لا تنتشر بسهولة من خلال المساحات interendothelial 23.

المستمر عالية الدقة التصوير يسهل التقاط الأحداث نفاذية الأوعية الدموية والكمي لحركية تسرب ديكستران والتخليص في TMEM (الشكل 2 وفيلم 1). منذ يتم تعريف مساحة الأوعية الدموية بسهولة من قبل كيلو دالتون ديكستران 155 في بدء تسلسل الوقت الفاصل بين (كما هو الحال في 0 الصورة من الشكل 2) ديكستران الفلورسنت خارج الأوعية يمكن قياسها في كل إطار من التسلسل الزمني الفاصل بين الشكل 2 و السينما 1 إثبات التسرب من 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR حقن عن طريق قسطرة الوريد الذيل إلى MMTV-PyMT-Dendra2. Csf1r-CFP الماوس. تستخدم الخلايا المسمى Dendra2 الورم (الخضراء) والضامة المسمى CFP (السماوي) لتحديد TMEM في الحيوانات الحية. ويرد هيكل TMEM في موقع نفاذية الأوعية الدموية في مربع أبيض. وصفت مساحة الأوعية الدموية مع 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR (أحمر) لتصور تدفق الأوعية الدموية والتسرب من محتويات الأوعية الدموية خلال أحداث نفاذية الأوعية الدموية. ذروة 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR التسربفي الشكل وينظر 2 بين 29 'و 34'. وينظر ديكستران خارج الأوعية في رأس السهم الأبيض في لوحات أعلى وفي رأس السهم الأحمر في لوحات أقل، مما يدل فقط على قناة من 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR. 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR يزيل من الأنسجة ويعتبر انخفاض في إشارة TMR خارج الأوعية كما رأينا في 97 'في الشكل 2. بعد كميا تجميع للتسلسل الوقت الفاصل في ImageJ ديكستران خارج الأوعية.

بالإضافة إلى مراقبة الأحداث عفوية في المكروية الورم، فمن المهم لدراسة الآلية الجزيئية الكامنة وراء الظواهر التي تم تحديدها. حقن الأصباغ أو البروتينات للحث على نفوذية الأوعية الدموية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للأحداث يدل تنظيم نفاذية الأوعية الدموية الوعائية إضافية الشكل 3 يوضح الفرق في التسرب من 10 كيلو دالتون ديكستران-FITC (الخضراء) و 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR (الحمراء).يدار عالية الوزن الجزيئي 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR فورا قبل بدء التصوير في الوقت الفاصل بين. يتم الحصول على خمس Z-مداخن في التسلسل الزمني الفاصل بين لتحديد خط الأساس قبل أن يتم حقن 10 كيلو دالتون ديكستران-FITC. بعد الاستحواذ على 5 ال Z-كومة يدار من 10 كيلو دالتون ديكستران-FITC عن طريق الوريد القسطرة الذيل دون انقطاع الحصول على الصور. ويعتبر ديكستران-FITC دخول الأوعية الدموية مع تسرب فوري في حين لا يزال 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR تقتصر على مساحة الأوعية الدموية (الشكل 3، 0 'و 6'). 10 كيلو دالتون ديكستران-FITC extravasates تماما من الأوعية الدموية ويزيل من الأنسجة ترك 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR في الأوعية الدموية (الشكل 3 كما رأينا في 56 'وفيلم 2). باستخدام نقطة زمنية من قبل الحقن، وحركية من 10 كيلو دالتون ديكستران-FITC التسرب يمكن بسهولة مقارنة مع 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR 13. والتسرب المباشر لل10 كيلو دالتون dextrو-FITC بعد حقن يختلف كثيرا عن الإبقاء على 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR في الأوعية الدموية وعفوية الأحداث نفاذية الأوعية الدموية 13. لا يمكن أن يؤديها ضوابط التجريبية إضافية بما في ذلك حمل نفاذية الأوعية الدموية من خلال تعطيل الميكانيكية من البطانة أو من خلال VEGFA 165 بوساطة نفاذية 13. حركية التسرب من 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR الأحداث نفاذية عفوية يمكن مقارنة ب 10 كيلو دالتون ديكستران، وغيرها من وسائل حمل نفوذية الأوعية الدموية لفهم الأحداث والإشارات شاركوا في أحداث نفاذية الأوعية الدموية في المكروية الورم.

شكل 1
الشكل 1. استراتيجيات لوصفها الخلايا والأوعية الدموية في المكروية الورم. (A) المعدلة وراثيا MMTV-PyMT الفأر مع الخلايا السرطانية المسمى مع Dendra2 (MMTV-iCre / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-PyMT) والضامة المسمى مع CFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). وصفت الأوعية الدموية للورم مع 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR بواسطة قسطرة الوريد الذيل يديرها. (ب) المشتقة من المريض الأورام طعم أجنبي، TN1 GFP مع الضامة المسمى مع 70 كيلو دالتون ديكستران تكساس الأحمر والأوعية الدموية المسمى مع نقاط الكم باستخدام قسطرة الوريد الذيل. شريط النطاق، 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تصور نفاذية الأوعية الدموية عابرة. (A) intravital المجهري (IVM) الوقت الفاصل بين 155 كيلو دالتون TMR-ديكستران (الحمراء) التسرب وورم الخلايا دخول الوعاء في TMEM (مربع أبيض). الخلايا السرطانية المسمى مع Dendra2 (الأخضر وTC)، الضامة مع ECFP (السماوي، M) والمفكرهسفن التطوير التنظيمي مع 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR (أحمر، BV). مواقع نفاذية الأوعية الدموية (رأس السهم الأبيض). (ب) عزل قناة 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR. السهام الحمراء علامة تسرب ديكستران (أبيض). شريط النطاق، 50 ميكرون. الفيلم من الوقت الفاصل بين المجهري في الفيلم 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تصور متعددة dextrans fluorescently المسمى. IVM الوقت الفاصل بين الفرق في التسرب من 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR (الأحمر) و 10 كيلو دالتون ديكستران-FITC (الخضراء). وصفت الضامة مع ECFP (السماوي) والكولاجين في الزرقاء (مجموعات المساعدة الذاتية). تراكب من الأحمر 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR والأخضر 10 كيلو دالتون ديكستران-FITC في الأوعية الدموية هو الأصفر. التسرب السريع لالخضراء 10 كيلو دالتون ديكستران-FITC الذروة هو في 6 دقائق. SCALشريط ه، 50 ميكرون. الفيلم من الوقت الفاصل بين المجهري في فيلم 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1
الفيلم 1. تصور عفوية نفاذية الأوعية الدموية عابرة مع IVM مرور الزمن. الوقت الفاصل بين المجهري (كما رأينا في الشكل 2) من عابرة نفاذية الأوعية الدموية تصور في الماوس MMTV-PyMT المعدلة وراثيا مع الخلايا السرطانية المسمى مع Dendra2 (MMTV-iCre / CAGCAT -Dendra2 / MMTV-PyMT) والضامة المسمى مع CFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). لوحظ تسرب من 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR تسرب (الأحمر في اللوحة اليسرى، اللوحة اليمنى البيضاء) عند نقطة فرع من السفينة الورم الدم. Pتأجير انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

فيلم 2
فيلم 2. تصور التسرب من عدة dextrans fluorescently المسمى من قبل IVM مرور الزمن. الوقت الفاصل بين المجهري (كما رأينا في الشكل 3) من التسرب من 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR (الأحمر) و 10 كيلو دالتون ديكستران-FITC (الخضراء) في المعدلة وراثيا MMTV-PyMT الفأر مع الضامة المسمى مع CFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). هو المسمى مجموعات المساعدة الذاتية من الكولاجين في الزرقاء. يبقى الأحمر 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR في الأوعية الدموية للورم لمدة من الوقت الفاصل بين حين extravasates الأخضر 10 كيلو دالتون ديكستران-FITC بسرعة ويزيل من الأوعية الدموية والأنسجة. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التفاعلات الخلوية التي تحدث بشكل عفوي في المكروية الورم يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في الحركة الخلايا السرطانية ودخول الوعاء. عالية الدقة حيوي داخلي التصوير من الأنسجة السرطانية الحية يسمح التصور من ديناميات متعددة الخلايا التي يمكن أن تكون 10،13،24 عابرة للغاية. نقطة النهاية في المقايسات فيفو أو الصور الوقت الفاصل بين المكتسبة مع نقاط زمنية منفصلة يمكن أن توفر معلومات أساسية عن الآليات الجزيئية من العمليات في المكروية الورم. وقد استخدمت دراسات التصوير حيوي داخلي لدراسة العمليات في المكروية الورم التي تحدث على مدى عدة أيام، وتوليد الأفكار الجديدة في الأوعية الدموية، والهجرة الخلايا السرطانية والاستجابة للعلاج بالعقاقير 25-30. ومع ذلك، قد هذه المقايسات لا التقاط حركية أحداث عابرة في المكروية الورم بسبب النطاق الزمني للعمليات التي تجري دراستها 7،31. تمييز عدة أحداث عابرة من العمليات المستمرة هو إعلان هامنظر من intravital المجهري.

تقنية التصوير حيوي داخلي الموصوفة في هذا البروتوكول تمكن رؤية مباشرة للديناميات الخلوية في المكروية الورم عن طريق وضع العلامات مضان الأنساب خلايا متعددة والهياكل. يسمح Multiphoton المجهر قدر أكبر من عمق التصوير الإفراط في فوتون واحد متحد البؤر المجهري مع أعماق 300 ميكرون تمارس بشكل روتيني 24. الحصول على Z-أكوام من 50-100 ميكرون مع 2 ميكرون الخطوات هو قرار مرتفع بما فيه الكفاية لتوليد إعادة الإعمار 3D من التفاعلات الخلوية، بما في ذلك نتوءات أن تجعل الخلايا كما أنها تمتد نحو بعضها البعض 13 والأوعية الدموية الهياكل في المكروية الورم. أفلام واعادة البناء 3D من تسلسلات الصور الوقت الفاصل بين تسمح لتحديد الكميات من الحركة الخلوية (سرعة وتوجه) و، وذلك باستخدام التغيرات في كثافة إشارة فلوري الأصباغ عن طريق الحقن، نفاذية الأوعية الدموية.

من أجل القبض على سالأحداث الخلوية ontaneous يجب أن يكون الأمثل عدد من الصور الفردية التي احتلتها في تسلسل واحد للسماح لمعدل الحصول على الصور التي تلتقط حركية الحدث، ولكن الذي يغطي أيضا الحيز المادي الكافي لزيادة احتمال التقاط أي حالة فردية خلال واحد تسلسل الوقت الفاصل. وتشمل المعلمات التصوير المكانية التي تحتاج إلى النظر فيها؛ عدد شرائح في Z المكدس، في عدد من المجالات نظر مع Z-مداخن المكتسبة والمسافة المحورية بين شرائح الفردية في Z-المكدس. لذلك، ووضع هذه المعايير قبل البدء في الحصول على الصور هو خطوة حاسمة في البروتوكول. باستخدام المجهر multiphoton، واقتناء 30 لقطة (500 ميكرون × 500 ميكرون) في زي سلسلة ما يقرب من 60 ثانية. منذ مدة لوحظ دخول الوعاء الخلايا السرطانية يمكن أن يكون بناء على أمر من الدقيقة 13، واستولت على عدة Z-مداخن لإعادة الإعمار 3D من دخول الوعاء، واكتساب الوقت لZ المكدس ور محدودةس 60 ثانية. لذلك، تم الحصول على حقل واحد للعرض مع ما يصل إلى 30 شرائح في Z-المكدس. وعلاوة على ذلك، منذ كان المطلوب إعادة الإعمار 3D من الخلايا، تم تعيين خطوة محورية بين Z-شرائح في 2 ميكرون. وهذا يسمح للحصول على معلومات كافية عن حجم خلية للسماح لإعادة الإعمار 3D. يجب أن يكون الأمثل هذه المعايير لأي المجهر والتصوير البرامج المستخدمة على أساس حركية الأحداث الحية التي تجري دراستها.

تعديل وسادة مطاطية على المسرح المجهر والوريد الذيل الرابع القسطرة على حد سواء سمح لزيادة كبيرة في وقت التصوير. أشكال وسادة مطاطية بئر للسماح لترطيب الحفاظ على الورم وتقليل الانجراف XY على ساترة الزجاج. مزيج من غرفة التدفئة مع إدارة برنامج تلفزيوني يحافظ على ترطيب ودرجة الحرارة الفسيولوجية للحيوانات. هذه الظروف مجتمعة الحفاظ على نضح الأوعية الدموية وتدفق الدم للسماح للتصوير ممتدة من الأحداث الخلوية في وعاء الورمculature بما في ذلك نفاذية الأوعية الدموية ودخول الوعاء الخلايا السرطانية.

وجود قيود على هذا الأسلوب هو عدد العلامات الفلورية التي يمكن استخدامها لتصور الخلايا في المكروية الورم. يمكن توليد الفئران المعدلة وراثيا مع أنواع إضافية خلية (أي الخلايا البطانية، الخلايا الليفية أو pericytes) التي تحتوي على البروتين الفلوري تكون صعبة وتستغرق وقتا طويلا. ومع ذلك، يمكن أن التطبيقات المحتملة في المستقبل الاستفادة من مجموعة من العلامات البروتين الفلوري من أنواع الخلايا اللحمية مع الخلايا السرطانية المزروعة و 70 كيلو دالتون ديكستران وسم الضامة. عن طريق استخدام مزيج من هذه الاستراتيجيات وصفها وعبور الفئران المعدلة وراثيا تركيبات جديدة من بطاقات الخلوية يمكن أن تتولد لتقييم الحركة والأحداث الخلوية في المكروية الورم.

على عكس التجارب نقطة النهاية على أساس تلطيخ المناعي، يسمح عالية الدقة حيوي داخلي المجهري تصور عفوية وعابرةالأحداث في المكروية الورم. إجراء التصوير حيوي داخلي هو موضح هنا يكشف أحداث جديدة والتفاعلات الخلوية في المكروية الورم الذي لا يمكن فك شفرتها من الصور الثابتة. معلومات جديدة عن أنواع الخلايا المتفاعلة أو العمليات، وحركية هذه الأحداث، فرضيات يمكن أن تتولد للتحقيق في مسارات الإشارات التي تدفع هذه التفاعلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل وزارة الدفاع الثدي برنامج أبحاث السرطان تحت رقم جائزة (الرماد، W81XWH-13-1-0010)، المعاهد الوطنية للصحة CA100324، إندستريز CA100324، وبرنامج التصوير المتكاملة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate Sigma Aldrich T1287 reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa dextran-Texas Red Life Technologies D-1830 reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate Sigma Aldrich FD10S reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots Life Technologies Q21561MP Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection
MMTV-PyMT mice Jackson Laboratory 2374
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) Jackson Laboratory 26051
Csf1r-EGFP mice Jackson Laboratory 18549
1x PBS Life Technologies
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 250 ml
Oxygen AirTech
1 ml syringe, tuberculin slip tip BD 309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle BD 305128
Polyethylene micro medical tubing  Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
Microscope coverglass Corning 2980-225 thickness 1.5, 22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors Kent Scientific
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R
soft rubber pad McMaster-Carr 8514K62 Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back
hard rubber pad McMaster-Carr 8568K615 High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer
Microscope Olympus The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens.
7-Punch set McMaster-Carr 3429A12 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
  2. Wang, H. -L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
  3. Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
  4. Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
  5. Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
  6. Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
  7. Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
  8. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  9. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
  10. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
  11. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
  12. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
  13. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  14. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  17. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  18. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
  19. Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
  20. Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J. High-Resolution Multiphoton Imaging of Tumors. In Vivo. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2011).
  21. Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807 (2011).
  22. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  23. Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
  24. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  25. Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
  26. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  27. Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
  28. Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
  29. Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790 (2013).
  30. Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
  31. Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).

Tags

الطب، العدد 112، والتصوير حيوي داخلي، نفاذية الأوعية الدموية، والبروتين الفلوري، ورم المكروية، والوقت الفاصل بين، بيولوجيا السرطان
تمديد الوقت الفاصل بين حيوي داخلي تصوير في الوقت الحقيقي متعددة الخلايا حيوية في المكروية ورم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis,… More

Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (112), e54042, doi:10.3791/54042 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter