Summary
Ce protocole décrit l'utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer prolongée imagerie time-lapse d'interactions multicellulaires en temps réel, in vivo à la résolution d'une seule cellule.
Introduction
Dissémination des cellules tumorales de la tumeur mammaire primaire a été montré que des cellules tumorales implique non seulement, mais les cellules hôtes stromales, y compris les macrophages et les cellules endothéliales. En outre, le système vasculaire tumoral est anormale avec une augmentation de la perméabilité. Ainsi, la détermination de la façon dont les cellules tumorales, les macrophages et les cellules endotheliales interagissent pour médier la perméabilité vasculaire et intravasculaire de cellules tumorales dans le microenvironnement de la tumeur primaire est importante pour la compréhension des métastases. La compréhension de la cinétique de la perméabilité vasculaire, intravasculaire de cellules tumorales et le mécanisme de signalisation sous-jacente des interactions multicellulaires dans le microenvironnement tumoral peut fournir des informations cruciales dans le développement et l'administration des traitements anti-cancéreux.
Le moyen principal de l' étude de la perméabilité vasculaire tumorale in vivo a été la mesure des colorants extravasculaires tels que le bleu d' Evans 2, les dextrans de haut poids moléculaire (155 kDa)3 et fluorophore ou des protéines de radiotraceurs conjugués (y compris l' albumine) 4 en des points fixes de temps après l' injection du colorant. Les progrès de la microscopie, des modèles animaux et des colorants fluorescents ont permis la visualisation des processus cellulaires et la perméabilité vasculaire chez les animaux vivants par microscopie intravitale 5.
Imagerie animale en direct avec l'acquisition d'images statiques ou de courtes séquences time-lapse sur plusieurs points de temps ne permet pas à la compréhension complète des événements dynamiques dans le microenvironnement de la tumeur 6,7. En effet, l' acquisition d'image statique au cours de 24 heures a montré que le système vasculaire tumoral est non étanche, mais la dynamique de la perméabilité vasculaire n'a pas été observée 6. Ainsi, l'imagerie en continu prolongé le temps écoulé jusqu'à 12 heures capture la cinétique d'événements dynamiques dans le microenvironnement tumoral.
Ce protocole décrit l'utilisation de longue time-lapse multiphotla microscopie intravitale pour étudier les événements dynamiques multicellulaires dans le microenvironnement tumoral. plusieurs types de cellules dans le microenvironnement tumoral sont marquées avec des colorants injectables ou en utilisant des animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes. Au moyen d'un cathéter veine de la queue des colorants ou des protéines vasculaires peuvent être injectées après le début de formation d'image pour acquérir des données d'événements cinétique multicellulaires dans le microenvironnement tumoral. Pour l'imagerie des cellules vivantes de la tumeur mammaire est exposée à travers la préparation chirurgicale d'un lambeau de peau. Les images sont acquises jusqu'à 12 heures en utilisant un microscope multiphoton équipé de tubes photomultiplicateurs multiples (PMT) détecteurs 8. À l'aide de filtres appropriés, un algorithme de soustraction permet de 4 détecteurs pour acquérir PMT 5 signaux fluorescents dans le microenvironnement tumoral simultanément 9. La microscopie à haute résolution multiphotonique intravitale capture seule résolution cellulaire imagerie des interactions tumeur-stroma dans le microenvironnement de la tumeur, ce qui conduit à une meilleure uCOMPRENDRE de la perméabilité vasculaire et des cellules tumorales intravasation 10-13. Plus précisément, l' imagerie intravitale révélés très localisés, les accidents vasculaires transitoires étendues de perméabilité sélective qui se produisent au niveau des sites d'interaction entre une cellule tumorale, un macrophage et une cellule endothéliale (défini comme le microenvironnement tumoral des métastases, TMEM 14) 13. En outre, intravasculaire de cellules tumorales se produit uniquement à TMEM et est spatialement et temporellement corrélée avec la perméabilité vasculaire 13. résolution cellulaire unique de la dynamique de ces événements a été rendue possible grâce à l'utilisation de longue time-lapse multiphoton microscopique des cellules marquées par fluorescence dans le microenvironnement de la tumeur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures décrites doivent être effectuées conformément aux directives et réglementations relatives à l'utilisation des animaux vertébrés, y compris l'approbation préalable de l'Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care et utilisation Comité.
1. Génération de fluorescence Tumeurs Labellisées et Macrophages associés aux tumeurs
- Générer des cellules tumorales marquées par fluorescence en traversant le autochthonous modèle spontané, une souris transgénique mammaire cancer , où le virus de la tumeur longue répétition terminale mammaire de la souris entraîne l'antigène polyome du milieu T (MMTV PyMT) avec des souris transgéniques avec des rapporteurs fluorescents [ à savoir, une meilleure fluorescente verte protéines (EGFP), amélioré la protéine fluorescente cyan (ECFP) ou Dendra2] 8,9.
- Macrophages de l' étiquette par fluorescence chez les animaux PyMT avec marquées par fluorescence des cellules tumorales par le croisement des modèles de souris génétiquement modifiées avec des journalistes fluorescents spécifiques myeloid- et macrophages [ie, MacGreen 15 ou souris MacBlue CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16].
- En variante, de générer des tumeurs marquées par fluorescence par la transplantation orthotopique de cellules marquées par fluorescence (PyMT tumorales syngéniques), de lignées cellulaires de cancer du sein humain ou de tumeurs primaires patient humain dérivées (11,17) xénogreffes.
- Implant marqué par fluorescence des cellules tumorales dans des souris syngéniques PyMT avec des cellules myéloïdes de la protéine marquée par fluorescence pour générer des animaux avec des cellules tumorales marquées par fluorescence et les cellules myéloïdes 13.
- Injecter 100 ul de 10 mg / kg fluorescent 70 kDa dextran par voie intraveineuse (iv) veine de la queue des souris déficit immunitaire combiné sévère (SCID) avec des tumeurs de xénogreffes de lignées cellulaires humaines ou de tumeurs primaires provenant de patients à macrophages d'étiquettes par fluorescence 2 heures avant le début de l'imagerie intravitale.
2. Installation de Microscope et imagerie Préparation
Remarque: Cette procédure décrit la mise en placepour l' imagerie intravitale sur un microscope multiphoton 8.
- Allumez tous microscope laser et composants, y compris les lasers à deux photons et les détecteurs.
- Mettre en marche le moteur de chauffage à 30 ° C pour préchauffer la scène. Cette étape est essentielle pour le maintien de la température physiologique de l'animal.
- Pour une utilisation sur un microscope inversé lieu l'insert de scène sur mesure sur la platine du microscope. L'insert personnalisé est une feuille de 1/8 "aluminium épais usiné pour tenir dans l'espace d'insertion de la scène et avec un diamètre de 1" trou traversant dans le centre d'imagerie.
- Essuyez la platine du microscope et l'insert de scène avec 70% d'éthanol et de l'air sec.
- Placez une grosse goutte d'eau sur le NA objectif 20X, 1,05 microscope pour maintenir le contact optique avec le verre de protection.
- verre Lieu de couverture (# 1.5 d'épaisseur) sur le port d'imagerie sur l'insert de platine du microscope. Fixez en place avec du ruban adhésif de laboratoire.
- Utilisez un poinçon pour percer un trou x 2 cm 2 cmdans un tampon de caoutchouc flexible et placez le coussin en caoutchouc sur la platine du microscope avec le trou dans le tampon aligné avec le trou dans l'insert de scène personnalisée.
3. Préparation de la veine de la queue Catheter et réactifs pour injection lors de l'imagerie
- Couper une longueur de 30 cm de polyéthylène (PE) tubes.
- En utilisant des pinces, déplacer l'aiguille métallique d'un G aiguille 31 avant et en arrière jusqu'à ce qu'il se détache du raccord en plastique.
- En utilisant des pinces, insérer l'extrémité émoussée de l'aiguille détaché dans le tube PE.
- Insérer une aiguille de calibre 31 dans l'autre extrémité du tuyau en PE.
- Remplir une seringue de 1 cc avec du phosphate stérile saline tamponnée (PBS) et l'insérer dans le G aiguille 31 et rincer tout l'air du tube et de l'aiguille avec du PBS. PBS est utilisé pour maintenir l' hydratation et l' osmolarité du sang 9,18, une solution saline isotonique , mais peut également être utilisé.
- Remplir une seringue de 1 ml avec 200 ul de 3 mg / kg 155 kDa dextrane tétraméthylrhodamine (TMR) Ou des points quantiques pour l'étiquetage vasculaire.
- Préparer toutes les autres protéines injectables tel qu'un isoforme de 165 acides aminés de facteur de croissance de l' endothélium vasculaire A (VEGFA 165) dans une seringue de 1 ml et placer sur de la glace. Injecter 0,2 mg / kg VEGFA 19 165 à une concentration de 0,05 mg / ml.
4. Insertion de la queue Indwelling Vein Catheter
- Placer l'animal sous anesthésie à l' aide d' une chambre d'induction avec 5% d' isoflurane avec O 2 en tant que gaz porteur.
- Transférer la souris pour la plate-forme chirurgicale une fois qu'il est complètement anesthésié et ne répond pas à une pincée d'orteil.
- Ligne ouverte de l'isoflurane à la plate-forme chirurgicale, fermer la ligne d'anesthésie à la chambre d'induction et placez le cône de nez sur le museau de l'animal. Réduire l'isoflurane de 5% à 2,5%.
- Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie.
- Chauffer l'animal sous la lampe chauffantependant 2 min pour augmenter la circulation dans la queue que la circulation ralentit avec l'anesthésie profonde.
- Stériliser la souris veine de la queue avec 70% d'éthanol.
- Insérer la pointe du G aiguille du cathéter construit dans la section 3 dans la veine caudale latérale de l'animal 31 et pousser l'aiguille dans 2-3 mm.
- Tirez sur la seringue pour voir le sang, assurant le cathéter est placé dans la veine de la queue.
- Utilisez une longueur de 1 cm de ruban de laboratoire placé sur l'aiguille pour maintenir l'aiguille en place parallèlement à la veine le long de la longueur de la queue.
5. Flap de la peau Procédure chirurgicale pour exposer la tumeur mammaire
- Avec l'animal sur la plate-forme chirurgicale tamponner la tumeur et la surface ventrale avec 70% d'éthanol. Remarque: Comme indiqué, ce procédé n'a pas été complètement exécutée de manière aseptique. Pour les sessions d'imagerie longues où l'infection peut devenir un facteur de confusion, il est recommandé d'utiliser une technique aseptique appropriée.
- Utilisation de steriLe forceps, soulever la peau ventrale et avec des ciseaux stériles faire une incision sous-cutanée le long de la ligne médiane ventrale d'environ 1 cm de longueur. Évitez de perforer le péritoine lors de l'incision.
- couper en douceur le tissu conjonctif fixation de la glande mammaire et la tumeur loin du péritoine pour exposer la tumeur mammaire.
- Avec des ciseaux et des pinces, retirez délicatement et couper le fascia et la graisse de la surface exposée de la tumeur tout en préservant l'intégrité de la vascularisation de la tumeur et de minimiser les saignements. Cette étape est essentielle pour le maintien de l'architecture de la tumeur et le système vasculaire d'alimentation de la tumeur.
6. Préparation des animaux pour Microscopie
- Transférer l'animal au stade d'imagerie préchauffée avec la tumeur exposée placée sur la lamelle couvre-objet sur l'insert de phase au-dessus de l'objectif du microscope pour l'imagerie. Prenez soin de transférer le cathéter dans la veine caudale doucement avec l'animal afin de ne pas déloger l'aiguille.
- La place enez e anesthésie cône sur le museau de l'animal pour maintenir ensemble l'anesthésie à 3% d'isoflurane.
- Positionner l'animal de telle sorte que la tumeur repose dans le trou de la garniture en caoutchouc et en contact avec la lamelle couvre-objet en verre.
- Utilisez deux tampons en caoutchouc pour tenir doucement la tumeur en place et les fixer à la platine du microscope avec du ruban de laboratoire pour réduire le mouvement lors de l'acquisition d'image.
- Remplir la chambre du coussin en caoutchouc avec du PBS pour maintenir le tissu hydraté et maintenir le contact optique avec la lamelle.
- Commencez à surveiller les signes vitaux de l'animal avec une sonde d'oxymètre de pouls. Fixer un capteur à pince à la cuisse de l'animal. En variante, un collier qui est configuré pour s'adapter autour du cou peut être utilisé.
- Placer la boîte de chauffage au- dessus de l'animal pour maintenir 30 ° C 20.
- diminuer progressivement le niveau de l'isoflurane à 0,5-1% pour maintenir l'anesthésie et de maintenir le flux sanguin.
Acquisition et Injection de Fluoresc 7. imageent Colorants et protéines injectables
- Mise au point à l'aide du microscope oculaire sur les cellules tumorales fluorescentes sur la surface de la tumeur.
- Sélectionnez une zone d'intérêt en trouvant des zones où affluent les vaisseaux sanguins. La sélection d'une zone d'intérêt avec écoulement des vaisseaux sanguins est essentielle pour l'évaluation de la vascularisation tumorale.
- Une fois qu'une région d'intérêt a été sélectionné commuter le microscope en mode multiphotonique d'imagerie.
- Fixer les limites supérieure et inférieure d'une série Z. Régler la limite supérieure de la z-série en utilisant le réglage de mise au point pour déplacer l'objectif à l'emplacement de départ souhaité et en cliquant sur le bouton de position Z "Top". Déterminer la limite supérieure de la série Z en visualisant le réseau de fibres de collagène à la surface de la tumeur dans le canal de génération de second harmonique (SHG) et en observant en l'absence de cellules, mais seules les fibres de collagène sont visibles.
- Réglez la limite inférieure de la z-série en déplaçant l'objectif à la profondeur d'imagerie désirée (typically 50-150 um) et en cliquant sur la position Z bouton "Bas".
- Définissez la taille de l'étape en tapant la valeur souhaitée dans le champ de taille de pas. Déterminer la taille de l'étape fondée sur des considérations de résolution et le temps d'acquisition (généralement de 2 pm est utilisé pour la reconstruction 3D de haute résolution et 5 um autrement).
- Définissez l'intervalle time-lapse par le passage à l'écran Time-Lapse et en entrant le temps écoulé désiré dans le champ Time-Lapse. Pour une résolution temporelle optimale définir l'intervalle de temps de 0 sec pour l'imagerie en continu. Remarque: Pour une longue imagerie time-lapse il est recommandé de définir l'intervalle de temps de 10 secondes entre les acquisitions pour reconstituer le liquide d'immersion objectif.
- Une fois les paramètres pour l'imagerie ont été déterminés, injecter lentement 155 kDa dextran-TMR.
- Retirez la seringue avec du PBS dans le cathéter veine de la queue et le remplacer par la seringue contenant 155 kDa dextran-TMR en prenant soin de ne pas introduire de bulles dans le line.
- Lentement injecter 155 kDa dextran-TMR dans la souris, avec un volume maximum de 200 pi, et remplacer la seringue avec une seringue contenant du PBS. ÉTAPE CRITIQUE: Effectuer l'injection lentement et prendre des précautions pour éviter d'avoir une solution en dehors de la veine.
- Démarrer l'acquisition de la Z-stack imagerie time-lapse en cliquant sur les boutons Time-Lapse Z-Stack et de les appuyer et puis en cliquant sur le bouton d'enregistrement.
- Si d' autres dextranes fluorescents, à savoir, isothiocyanate 10 kDa dextran-fluorescéine (FITC), ou des protéines, à savoir, VEGFA 165, ont été préparés à l' avance, les injecter après le début de l' acquisition d'images pour au = 0 min début.
- Retirez la seringue avec du PBS dans la veine cathéter de queue et le remplacer par la seringue contenant 10 kDa dextran-FITC ou VEGFA 165 en prenant soin de ne pas introduire de bulles dans la ligne.
- Injecter lentement injectables dans la souris à travers le cathéter dans la veine caudaleet remplacer la seringue avec une seringue contenant du PBS.
- Chaque 30 à 45 minutes, injecter lentement 50 ul de PBS ou de solution saline pour maintenir l'hydratation de l'animal.
8. euthanasie
- A la fin de l'acquisition d'images, euthanasier l'animal.
- Augmenter le isoflurane à 5%.
- Gardez l'animal de moins de 5% d'isoflurane jusqu'au 30 sec après qu'il cesse de respirer et enlever l'animal de la scène.
- Effectuer la dislocation cervicale pour assurer l'euthanasie complète.
Traitement 9. Image
- Acquérir des images à des fichiers TIFF 16 bits pour chaque canal individuel à chaque point de temps et économiser de manière séquentielle.
- Effectuer la séparation de chevauchement spectral (c. -à- GFP et PCP), l' élimination de la dérive xy et la génération de films à partir de séquences de time-lapse en utilisant des méthodes établies dans ImageJ 9. Effectuer 3D reconstructions de surface des images à haute résolution 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La microscopie Extended time-lapse intravitale permet seule résolution cellulaire imagerie des processus multicellulaires dans le microenvironnement de la tumeur. Par les cellules tumorales marquage par fluorescence, les macrophages, l'espace vasculaire et de visualiser le réseau de fibres de collagène en utilisant le deuxième signal de génération d'harmoniques, de multiples compartiments dans le microenvironnement tumoral sont simultanément suivis au cours de l'imagerie. Les cellules tumorales marquées avec des protéines fluorescentes peuvent être générés chez des souris transgéniques comme cela a été fait chez la souris MMTV-PyMT Dendra2, avec des cellules tumorales mammaires marquées avec Dendra2 (figure 1A). En croisant ces souris transgéniques avec des souris CSF1R -GAL4VP16 / UAS ECFP, qui ont des macrophages marqués avec ECFP, les cellules tumorales et les macrophages sont marqués chez les souris MMTV PyMT. Avec la stratégie des cellules tumorales et des macrophages à double marquage, l'interaction directe des deux types de cellules peut être visualisée en temps réel (figure 1A). De plus, le cancer du sein, des lignées cellulaires humaines ou des cellules tumorales dérivées de patients transduites avec la GFP peut être utilisée pour marquer les cellules tumorales. Les macrophages peuvent être marquées à l' aide de 70 kDa marquée par fluorescence dextran qui accumule dans les macrophages phagocytaires (figure 1B). Ces méthodes ont favorisé l'étude des événements multicellulaires dynamiques telles que des cellules tumorales-macrophage en streaming la motilité, la perméabilité vasculaire et intravasation des cellules tumorales. Pour visualiser les changements dans vasculaire de la tumeur perméabilité, un dextran marqué par fluorescence élevée de poids moléculaire (155 kDa ou plus est recommandé 9,13,21,22) ou les points quantiques sont utilisés pour étiqueter l'espace vasculaire (figure 1). 155 kDa dextran ou points quantiques sont assez grands qu'ils ne diffusent pas facilement à travers les espaces interendothéliales 23.
Continue imagerie à haute résolution facilite la capture des événements de perméabilité vasculaire et laquantification de la cinétique d'extravasation dextran et de la clairance à TMEM (Figure 2 et Movie 1). Depuis l'espace vasculaire est facilement définie par la 155 kDa dextran au début de la séquence time-lapse (comme dans 0 'de la figure 2) dextran fluorescent extravasculaire peut être quantifiée dans chaque trame de la séquence time-lapse. Figure 2 et Movie 1 démontrer l'extravasation de 155 kDa dextran-TMR injecté par un cathéter dans la veine caudale dans un MMTV-PyMT-Dendra2; Souris CSF1R-CFP. les cellules tumorales marquées Dendra2 (vert) et les macrophages marqués PCP (cyan) sont utilisés pour identifier TMEM d'animaux vivants. La structure de TMEM au niveau du site de la perméabilité vasculaire est décrite dans une zone blanche. L'espace vasculaire est marqué avec 155 kDa dextran-TMR (rouge) pour visualiser la vascularisation et l'extravasation des matières vasculaires circulant pendant les événements de la perméabilité vasculaire. Le pic de 155 kDa dextran-TMR extravasationla figure 2 est vu entre 29 'et 34'. dextran extravasculaire est vu à la pointe de flèche blanche dans les panneaux supérieurs et à la pointe de flèche rouge sur les panneaux inférieurs, ne montrant que le canal de 155 kDa dextran TMR. Le 155 kDa dextran-TMR efface du tissu et est considéré comme une diminution du signal extravasculaire TMR comme on le voit à 97 ' de la figure 2. Après la compilation de la séquence time-lapse dans ImageJ dextran extravasculaire est quantifiée.
Outre l'observation des événements spontanés dans le microenvironnement tumoral, il est important d'étudier le mécanisme moléculaire sous-jacente des phénomènes identifiés. Injecter des colorants ou des protéines pour induire la perméabilité vasculaire peut donner un aperçu des événements de signalisation régulant la perméabilité vasculaire vasculaires supplémentaires. Figure 3 montre la différence de extravasation de 10 kDa dextran-FITC (vert) et 155 kDa dextran-TMR (rouge).haut poids moléculaire 155 kDa dextran-TMR est administré immédiatement avant le début de l'imagerie time-lapse. Cinq Z-piles sont acquises dans la séquence time-lapse pour définir une ligne de base avant 10 kDa dextran-FITC est injecté. Après l' acquisition de la 5 e Z-stack 10 kDa dextran-FITC est administré par la veine de la queue cathéter sans interrompre l' acquisition d'images. Le dextran-FITC est vu entrer dans la vascularisation avec extravasation immédiat tandis que le 155 kDa dextran-TMR reste confinée à l'espace vasculaire (figure 3, 0 'et 6'). 10 kDa dextran-FITC extravasates complètement le vaisseau sanguin et sort à partir des tissus en laissant le dextran 155 kDa-TMR dans le vaisseau sanguin (figure 3 comme on le voit en 56 'et film 2). L' utilisation d' un point à partir avant l' injection de temps, la cinétique de 10 kDa dextran-FITC extravasation peuvent être facilement comparés à 155 kDa dextran-TMR 13. L'extravasation immédiate de 10 kDa dextrune FITC après l' injection est significativement différente de la rétention de 155 kDa dextrane-TMR dans le système vasculaire et les événements spontanés de perméabilité vasculaire 13. Contrôles expérimentaux supplémentaires peuvent être effectuées , y compris l' induction de la perméabilité vasculaire à travers la rupture mécanique de l'endothélium ou par VEGFA 165 perméabilité médiée 13. La cinétique de l'extravasation de 155 kDa dextrane-TMR des événements spontanés de perméabilité peuvent être comparées aux 10 kDa de dextran et d'autres moyens d'induction de la perméabilité vasculaire à comprendre les événements et les signaux impliqués dans des événements de perméabilité vasculaire dans le microenvironnement tumoral.
Figure 1. Stratégies pour le marquage des cellules et le système vasculaire dans le microenvironnement tumoral. (A) de la souris transgénique MMTV PyMT avec des cellules tumorales marquées avec Dendra2 (MMTV-CIFR / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-PyMT) et les macrophages marqués avec PCP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Tumeur vascularisation est marqué avec 155 kDa dextran-TMR administré par cathéter veine de la queue. (B) provenant de patients xénogreffes de tumeurs TN1-GFP avec les macrophages marqués avec 70 kDa dextran-Texas Red et vasculature marqués avec des points quantiques en utilisant le cathéter dans la veine caudale. Barre d'échelle, 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Visualisation de la perméabilité vasculaire transitoire. (A) la microscopie intravitale (IVM) time-lapse de 155 kDa dextran-TMR (rouge) extravasation et cellules tumorales intravasation à TMEM (boîte blanche). Les cellules tumorales marquées avec Dendra2 (vert, TC), des macrophages avec ECFP (cyan, M) et blood navires avec 155 kDa dextran-TMR (rouge, BV). les sites navire de perméabilité du sang (pointe de flèche blanche). (B) isolé de canal 155 kDa dextran-TMR. Les flèches rouges marquent extravasation dextran (blanc). Barre d'échelle, 50 pm. Film de la microscopie time-lapse dans Movie 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Visualisation multiples dextranes marqués par fluorescence. IVM time-lapse de la différence dans l' extravasation de 155 kDa dextran-TMR (rouge) et 10 kDa dextran-FITC (vert). Macrophages sont étiquetés avec ECFP (cyan) et de collagène en bleu (SHG). La superposition de rouge 155 kDa dextran-TMR et vert 10 kDa dextran-FITC dans la vasculature est jaune. extravasation rapide de vert 10 kDa dextran-FITC pic est à 6 min. Scale bar, 50 pm. Film de la microscopie time-lapse dans Movie 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1. Visualisation de la perméabilité vasculaire transitoire spontanée avec time-lapse IVM. Vidéomicroscopie (comme on le voit sur la figure 2) de transitoire la perméabilité des vaisseaux sanguins visualisées dans une souris MMTV-PyMT transgénique avec des cellules tumorales marquées avec Dendra2 (MMTV-CIFR / CAGCAT -Dendra2 / MMTV-PyMT) et les macrophages marqués avec PCP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Extravasation de 155 kDa dextran-TMR extravasation (rouge dans le panneau gauche, panneau blanc à droite) est observée au point de vaisseau sanguin de la tumeur de la branche. Plocation cliquez ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)
Film 2. Visualisation extravasation de plusieurs dextranes marqués par fluorescence par time-lapse IVM. Vidéomicroscopie (comme on le voit sur la figure 3) de l' extravasation de 155 kDa dextran-TMR (rouge) et 10 kDa dextran-FITC (vert) dans un transgénique souris MMTV-PyMT avec les macrophages marqués avec PCP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP). SHG de collagène est marqué en bleu. Rouge 155 kDa dextran-TMR reste dans la vascularisation de la tumeur pendant toute la durée du time-lapse tandis que le vert 10 kDa dextran-FITC extravasates rapidement et efface des vaisseaux sanguins et les tissus. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
les interactions cellulaires qui se produisent spontanément dans le microenvironnement tumoral peut conduire à des modifications de la motilité des cellules tumorales et intravasculaire. Haute résolution intravitale imagerie du tissu tumoral en temps réel permet de visualiser la dynamique multicellulaire qui peut être très 10,13,24 transitoire. Point final dans des essais in vivo ou images time-lapse acquises avec des points de temps discrets peuvent fournir des informations essentielles sur les mécanismes moléculaires des processus dans le microenvironnement de la tumeur. Des études d'imagerie intravitale ont été utilisées pour étudier les processus dans le microenvironnement tumoral qui se produisent au cours de plusieurs jours, en générant de nouvelles connaissances sur l' angiogenèse, la migration des cellules tumorales et la réponse à un traitement médicamenteux 25 à 30. Cependant, ces essais pourraient ne pas saisir la cinétique d'événements transitoires dans le microenvironnement de la tumeur en raison de l'échelle de temps des processus à l'étude 7,31. Distinguer multiples événements transitoires des processus constants est une annonce importantevue de la microscopie intravitale.
La technique d'imagerie intravitale décrites dans ce protocole permet la visualisation directe de la dynamique cellulaire dans le microenvironnement tumoral par marquage par fluorescence de multiples lignées cellulaires et des structures. La microscopie multiphotonique permet une plus grande profondeur de l' imagerie sur photon unique microscopie confocale avec des profondeurs de 300 um en routine 24. Acquisition de Z piles de 50 à 100 um à 2 um étapes est de résolution suffisamment élevée pour générer la reconstruction 3D d'interactions cellulaires, y compris les protubérances qui font des cellules lors de leur extension vers chacune 13 vasculaires et d' autres structures dans le microenvironnement tumoral. Films et reconstructions 3D de time-lapse séquences d'images permettent la quantification de la motilité cellulaire (vitesse et directionnalité) et, en utilisant des changements dans l'intensité du signal fluorescent des colorants injectables, la perméabilité vasculaire.
Afin de capturer sples événements cellulaires ontaneous le nombre d'images individuelles capturées en une seule séquence doivent être optimisées pour permettre une vitesse d'acquisition d'image qui capture la cinétique de l'événement, mais couvre également un espace physique suffisante pour augmenter la probabilité de capturer n'importe quel événement individuel au cours une séquence time-lapse unique. Les paramètres d'imagerie spatiales qui doivent être pris en considération comprennent; le nombre de tranches dans un Z-stack, le nombre de champs de vue avec Z-piles acquises et la distance axiale entre les tranches individuelles dans un Z-stack. Par conséquent, la définition de ces paramètres avant de commencer l'acquisition d'image est une étape critique dans le protocole. Utilisation du microscope multiphoton, l'acquisition de 30 images (500 um x 500 um) dans un z-série est d'environ 60 secondes. Comme la durée de observée intravasation des cellules tumorales peut être de l'ordre de 13 minutes, capturant plusieurs Z-piles pour la reconstruction 3D de intravasation, le temps d'acquisition d'un Z-pile a été limitée to 60 sec. Par conséquent, un seul champ de vision avec un maximum de 30 tranches dans une pile en Z a été acquise. En outre, étant donné que la reconstruction 3D de cellules a été souhaité, l'étape axiale entre Z-tranches a été fixé à 2 pm. Cela permet de suffisamment d'informations sur les volumes de cellules pour permettre la reconstruction 3D. Ces paramètres doivent être optimisés pour tout logiciel de microscope et d'imagerie utilisé basé sur la cinétique des événements en direct à l'étude.
La modification de la garniture en caoutchouc sur la platine du microscope et la veine de la queue de cathéter intraveineux ont tous deux permis une augmentation significative du temps de formation d'image. Les formes de tampon en caoutchouc un puits pour permettre l'hydratation maintenue de la tumeur tout en minimisant la dérive XY sur la lamelle de verre. La combinaison de la chambre de chauffage avec l'administration de PBS maintient l'hydratation et de la température physiologique des animaux. Ces conditions combinées maintenir la perfusion vasculaire et du flux sanguin pour permettre une imagerie prolongée d'événements cellulaires dans le canal déférent de tumeursculature y compris la perméabilité vasculaire et intravasculaire de cellules tumorales.
Une limitation de cette technique est le nombre de marqueurs fluorescents qui peuvent être utilisés pour visualiser les cellules dans le microenvironnement tumoral. Génération de souris transgéniques avec d' autres types de cellules ( par exemple, les cellules endothéliales, des fibroblastes ou péricytes) contenant la protéine fluorescente peut être difficile et prend du temps. Cependant, les applications potentielles futures pourraient utiliser une combinaison de fluorescence marquage des protéines de types de cellules du stroma avec des cellules tumorales implantées et 70 kDa marquage des macrophages dextran. En utilisant une combinaison de ces stratégies d'étiquetage et en croisant des souris transgéniques nouvelles combinaisons de marqueurs cellulaires peuvent être générés pour évaluer le mouvement et les événements cellulaires dans le microenvironnement tumoral.
Contrairement point final expériences basées sur immunofluorescence, microscopie à haute résolution intravitale permet de visualiser spontanée et transitoiredes événements dans le microenvironnement tumoral. La procédure d'imagerie intravitale décrit ici révèle de nouveaux événements et les interactions cellulaires dans le microenvironnement de la tumeur qui ne peut être déchiffré à partir d'images statiques. Avec des informations inédites sur les types ou les processus de cellules en interaction, et la cinétique de ces événements, les hypothèses peuvent être générées pour enquêter sur les voies de signalisation qui conduisent ces interactions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par le programme d'imagerie intégrée Programme de recherche sur le cancer du sein Département de la Défense sous le numéro d'attribution (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, CA100324 PPG, et.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 ml |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 ml syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 x 50 mm |
| PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors | Kent Scientific | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch |
References
- Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
- Wang, H. -L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
- Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
- Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
- Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
- Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
- Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
- Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J.
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
- Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
- Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790 (2013).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).
