Summary
Denne protokollen beskriver bruken av multiphoton mikroskopi for å utføre forlenget time-lapse avbildning av flercellede vekselvirkninger i sanntid, in vivo ved enkelt celle oppløsning.
Introduction
Spredning av tumorceller fra den primære brysttumor har vist seg å medføre ikke bare tumorceller, men vert stromale celler innbefattende makrofager og endotelceller. Videre er tumorvaskulatur unormal med økt permeabilitet 1. Således bestemmer hvor tumorceller, makrofager og endotelceller interagere for å mediere vaskulær permeabilitet og tumorcelle intravasation i den primære svulsten mikromiljøet er viktig for forståelse metastasering. Forstå kinetikk vaskulær permeabilitet, tumorcelle intravasation og den underliggende signal mekanismen av flercellede interaksjoner i svulsten mikromiljøet kan gi viktig informasjon i utvikling og forvaltning av anti-kreft terapi.
Det primære middel for å studere tumor vaskulær permeabilitet in vivo har vært måling av ekstravaskulære fargestoffer så som Evans blå 2, høye vekt dekstraner (155 kDa) molekyl3 og fluorofor eller radiotracer-konjugerte proteiner (inkludert albumin) 4 ved faste tidspunkter etter injeksjon av fargestoffet. Fremskritt i mikroskopi, har dyremodeller og fluorescerende fargestoffer aktivert visualisering av cellulære prosesser og vaskulær permeabilitet i levende dyr gjennom intramikros 5.
Levende dyr bildebehandling med oppkjøpet av statiske bilder eller kort time-lapse sekvenser over flere tidspunkter tillater ikke for fullstendig forståelse av dynamiske hendelser i svulsten mikromiljøet 6,7. Faktisk statiske bildeoverføring i løpet av 24 timer viste at tumor vaskulaturen er utett, men dynamikken i vaskulær permeabilitet ble ikke observert 6. Dermed utvidet kontinuerlig time-lapse imaging opptil 12 timer fanger kinetikken av dynamiske hendelser i svulsten mikromiljøet.
Denne protokollen beskriver bruk av utvidede tidsforsinkelse multiphotpå intramikroskopi for å studere dynamiske flercellede hendelser i svulsten mikromiljøet. Flere celletyper i svulsten mikromiljøet er merket med fargestoffer injiserbare eller ved anvendelse av transgene dyr som uttrykker fluorescerende proteiner. Ved hjelp av en halevenekateter vaskulære fargestoffer eller proteiner kan injiseres etter starten av avbildning for å erverve kinetiske data fra flercellede hendelser i svulsten mikromiljøet. For levende celle bildebehandling melke svulsten er eksponert gjennom kirurgisk utarbeidelse av en hud klaff. Bildene er kjøpt i opptil 12 timer med en multiphoton mikroskop utstyrt med flere photomultiplier rør (PMT) detektorer 8. Ved å bruke egnede filtre, gjør en subtraksjonsalgoritmen 4 PMT detektorer for å skaffe 5 fluorescerende signaler i svulsten mikromiljøet samtidig ni. Høy oppløsning multiphoton intramikros fanger enkelt celle oppløsning avbildning av tumor-stroma interaksjoner i svulsten mikromiljøet, fører til en bedre understanding av vaskulær permeabilitet og tumorcelle intravasation 10-13. Spesielt utvidede intrabilde avdekket svært lokaliserte, forbigående vaskulære permeabilitet hendelser som oppstår selektivt på områder for interaksjon mellom en svulst celle, en makrofag og en endotelceller (definert som svulstens mikrometastaser, TMEM 14) 13. Videre oppstår tumorcelle intravasation bare ved TMEM og er romlig og tidsmessig korrelert med vaskulær permeabilitet 13. Enkelt celle oppløsning av dynamikken i disse hendelsene ble gjort mulig ved bruk av forlenget time-lapse multiphoton mikroskopi av fluorescerende merkede celler i tumoren mikromiljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet må utføres i samsvar med retningslinjer og regler for bruk av virveldyr, inkludert godkjennelse fra Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Generering fluorescensmerkede Svulster og tumor-assosiert Makrofager
- Generer fluorescensmerkede tumorceller ved å krysse den spontane, innfødt, genmodifisert mus mammary kreft modell der musebrysttumorvirus lang terminal gjenta driver polyoma midtre T-antigen (MMTV-PyMT) med transgene mus med fluorescerende reportere [dvs. forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), forbedret cyan fluorescerende protein (ECFP) eller Dendra2] 8,9.
- Fluorescens-label makrofager i PyMT dyr med fluorescensmerkede tumorceller ved å krysse genmanipulerte musemodeller med myeloid- og macrophage- spesifikke fluorescerende reportere [dvs. MacGreen 15 eller MacBlue mus Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16].
- Alternativt kan generere fluorescensmerket tumorer gjennom ortotopisk transplantasjon av fluorescensmerkede PyMT tumorceller (syngeniske), humane brystcancercellelinjer eller primære humane pasient avledede tumorer (xenoimplantater) 11,17.
- Implant fluorescensmerkede PyMT svulstceller i syngene mus med fluorescerende protein-merket myeloide celler til å generere dyr med fluorescensmerkede tumorceller og myeloide celler 13.
- Injisere 100 ul av 10 mg / kg fluorescerende 70 kDa dekstran ved intravenøs (iv) halevenen inn i alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus med xenograft tumorer i humane cellelinjer eller pasient-avledet primærsvulster til fluorescently etikettmakrofager i 2 timer før starten av intravital bildebehandling.
2. Mikroskop Oppsett og Imaging Forberedelse
Merk: Denne prosedyren beskriver oppsettfor intra bildebehandling på en multiphoton mikroskop 8.
- Slå på alle mikroskop og laser komponenter, inkludert to-foton lasere og detektorer.
- Slå på varme boksen til 30 ° C for å forvarme scenen. Dette trinnet er kritisk for å opprettholde den fysiologiske temperatur av dyret.
- For bruk på en invertert mikroskop sted skreddersydde scenen innsats på mikroskopet scenen. Den tilpassede innsatsen er et ark med 1/8 "tykk aluminium maskinert for å passe i den fasen innsats plass og med en 1" diameter gjennomgående hull i midten for bildebehandling.
- Tørk av mikroskop scenen og sceneinnsats med 70% etanol og lufttørke.
- Plasser en stor dråpe vann på 20X, 1,05 NA mikroskop målsetting å opprettholde optisk kontakt med dekkglass.
- Plasser dekkglass (# 1,5 tykkelse) over bilde port på mikroskopet scenen innsatsen. Fest på plass med lab tape.
- Bruk en hulle å slå en 2 cm x 2 cm hullpå en fleksibel gummipute og plasser gummipute på mikroskopet scenen med hullet i puten på linje med hullet i den egendefinerte scenen innsatsen.
3. Utarbeidelse av Tail venekateter og reagenser for injeksjon under Imaging
- Skjær en 30 cm lengde av polyetylen (PE) tubing.
- Bruk pinsett, flytte metall nål av en 31 G nål frem og tilbake før den bryter ut av plast fitting.
- Bruk pinsett, setter den butte enden av frittliggende nål inn i PE rør.
- Sette inn en 31 G nål inn i den andre enden av PE-rør.
- Fyll en 1 cc sprøyte med sterilt fosfat saltvann (PBS) og sett den inn i 31 G nål og skylle all luft ut av slangen og nål med PBS. PBS blir anvendt for å opprettholde hydratiseringen og blod osmolaritet 9,18, kan imidlertid isotonisk saltvann også anvendes.
- Fyll en 1 cc sprøyte med 200 pl av 3 mg / kg 155 kDa dekstran-tetra (TMR) Eller kvanteprikker for vaskulær merking.
- Fremstille andre injiserbare proteiner slik som et 165 aminosyre-isoformen av vaskulær endotelial vekstfaktor A (VEGFA 165) i en 1 ml sprøyte og sted på is. Injisere 0,2 mg / kg VEGFA 165 19 ved en konsentrasjon på 0,05 mg / ml.
4. Innsetting av den iboende Tail venekateter
- Plasser dyr under bedøvelse ved hjelp av en induksjons kammer med 5% isofluran med O 2 som bærergass.
- Overfør musen til den kirurgiske plattformen når den er fullstendig bedøvet og ikke reagerer på en tå klemme.
- Åpen isofluran anestesi linje til det kirurgiske plattformen, lukker anestesi linje til induksjonskammeret og plassere nesekonusen over dyrets snute. Reduser isofluran fra 5% til 2,5%.
- Påfør ophthalmic salve til øynene til musen for å hindre tørrhet under anestesi.
- Varm dyret under varmelampei ytterligere 2 minutter for å øke sirkulasjonen i halen som sirkulasjons bremser med dyp anestesi.
- Steriliser musehalevenen med 70% etanol.
- Sette inn spissen av 31 G nål fra kateteret er konstruert i punkt 3 inn i den laterale halevenen av dyret og skyve nålen på 2-3 mm.
- Trekke tilbake på sprøyten for å se blod, slik at kateteret er plassert i halevenen.
- Bruke en 1 cm lengde av lab båndet plasseres over nålen for å holde nålen på plass parallelt med venen langs lengden av halen.
5. Skin Flap Kirurgisk prosedyre for å avsløre brysttumor
- Med dyret på den kirurgiske plattformen vattpinne tumoren og den ventrale overflaten med 70% etanol. Merk: Som beskrevet, er denne prosedyren ikke utføres helt aseptisk. For lange bilde økter hvor smitte kan bli en problemfaktor, er det anbefalt å bruke riktig aseptisk teknikk.
- Bruk av klorle tang, løfter den ventrale huden og med steril saks lage et subkutant snitt langs den ventrale midtlinje omtrent 1 cm i lengde. Unngå punktering peritoneum under snittet.
- Forsiktig skjære bindevevet fester melkekjertelen og tumor bort fra peritoneum for å eksponere brysttumor.
- Ved hjelp av saks og pinsett, forsiktig ut og skåret bort fascia og fett fra den eksponerte overflaten av tumoren og samtidig opprettholde integriteten til tumorvaskulaturen og minimalisere blødning. Dette trinnet er kritisk for å opprettholde den tumor-arkitektur og blodkar tilførsel av tumoren.
6. Animal Forberedelse til Mikroskopi
- Overfør dyret til den forvarmede avbildningstrinnet med den eksponerte tumor plassert på dekkglass på scenen innsatsen over mikroskopobjektiv for avbildning. Pass på å overføre halevenekateter forsiktig med dyret for ikke å løsne nålen.
- Plasser the anestesi nesekonus over dyrets snute for å opprettholde anestesi satt til 3% isofluran.
- Plasser dyret, slik at tumoren hviler i hullet av gummiputen og kommer i kontakt med dekkglass.
- Bruk to gummiputer for å forsiktig holde svulsten på plass og feste dem til mikroskopet scenen med lab tape for å redusere bevegelse under bildet oppkjøpet.
- Fylle kammeret fra gummiputen med PBS for å holde vevet hydratiserte og opprettholde optisk kontakt med dekkglass.
- Begynne å overvåke dyrets vitale tegn med et pulsoksymeter sonde. Fest et klips sensoren til låret av dyret. Alternativt kan en krave som er konfigurert til å passe rundt halsen kan anvendes.
- Plasser varmeboks over dyret for å opprettholde 30 ° C 20.
- Sakte redusere nivået av isofluran til 0,5-1% for å opprettholde anestesi og opprettholde blodstrøm.
7. Image Acquisition og Injeksjon av fluorescerendeent Farger og injiserbare Proteiner
- Ved hjelp av mikroskop okularet fokus på de fluoriserende tumorceller på overflaten av tumoren.
- Velg et område av interesse ved å finne områder med rennende blodkar. Utvelgelsen av et område av interesse med strømmende blodkar er viktig for vurdering av tumorvaskulatur.
- Når et område av interesse er valgt slå mikroskopet inn multiphoton avbildningsmodus.
- Setter de øvre og nedre grenser for en z-serie. Angi den øvre grense for den z-serien ved hjelp av fokusjustereren til å bevege seg målet til ønsket startsted, og å klikke på den Z-posisjon "Top" -knappen. Bestemme den øvre grense for z-serien ved å visualisere kollagenfibernettverk på overflaten av tumoren i den andre harmonisk generering (SHG) kanal og observere når ingen celler, men bare kollagenfibre er synlige.
- Velg den nedre grense av det z-serien ved å bevege objektivet til den ønskede avbildningsdybde (typically 50-150 mikrometer) og klikke Z posisjon "Bottom" -knappen.
- Angi størrelsen skritt ved å skrive inn ønsket verdi i trinnstørrelsen feltet. Bestem trinnstørrelse basert på hensynet til oppløsning og oppkjøp tid (typisk 2 mikrometer brukes for høyoppløselig 3D rekonstruksjon og fem mikrometer ellers).
- Sett time-lapse intervall ved å bytte til Time-Lapse panel og angi ønsket lapse gangen i Time-Lapse-feltet. For optimal tidsmessig oppløsning angi tidsintervallet til 0 sek for kontinuerlig avbildning. Merk: For lang time-lapse imaging anbefales det å angi tidsintervallet til 10 sek mellom oppkjøp for å fylle målet nedsenking væske.
- Når parameterne for bildebehandling er blitt bestemt, sakte injisere 155 kDa dekstran-TMR.
- Fjern sprøyten med PBS i halevenekateter og erstatte med sprøyte som inneholder 155 kDa dekstran-TMR tar seg ikke å innføre noen bobler inn i line.
- Sakte injisere 155 kDa dekstran-TMR i musen, med et maksimalt volum på 200 ul, og erstatte sprøyten med sprøyte som inneholder PBS. KRITISK STEP: Utføre injeksjonen sakte og ta forholdsregler for å unngå å få løsning utenfor venen.
- Start oppkjøpet av Z-stack time-lapse avbildning ved å klikke på Z-Stack og Time-Lapse-knappene for å trykke dem og deretter klikke på opptaksknappen.
- Hvis andre fluorescerende dekstraner, dvs. 10 kDa dekstran-fluorescein (FITC), eller proteiner, dvs. VEGFA 165, er utarbeidet på forhånd, injiserer dem etter starten av bildet oppkjøpet for at = 0 min start.
- Fjern sprøyten med PBS i halevenekateter og erstatte med sprøyten inneholder 10 kDa dekstran-FITC eller VEGFA 165 tar seg ikke å innføre noen bobler inn i linjen.
- Injiser langsomt injiserbare inn i mus via halevenekateterog erstatte sprøyte med en sprøyte som inneholder PBS.
- Hver 30-45 minutter, langsomt injisere 50 pl PBS eller saltvann for å opprettholde hydratiseringen av dyret.
8. Eutanasi
- Ved avslutning av bildet oppkjøpet, avlive dyret.
- Øk isofluran til 5%.
- Holde dyret under 5% isofluran til 30 sek etter at det slutter å puste og fjerne dyret fra scenen.
- Utfør halshugging for å sikre fullstendig aktiv dødshjelp.
9. Bildebehandling
- Hente bilder på 16-bits TIFF-filer for hver enkelt kanal på hvert tidspunkt og lagre sekvensielt.
- Utfør separasjon av spektral overlapp (dvs. GFP og CFP), eliminering av xy drift og generering av filmer fra tid-lapse-sekvenser ved hjelp av etablerte metoder i ImageJ 9. Utfør 3D-overflate rekonstruksjoner av bilder med høy oppløsning 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvidet time-lapse intravital mikroskopi muliggjør enkelt celle oppløsning avbildning av flercellede prosesser i svulsten mikromiljøet. Ved fluorescently merking kreftceller, makrofager, det vaskulære plass, og visualisere kollagen fiber nettverk ved hjelp av den andre harmoniske generasjon signal, er flere avdelinger i svulsten mikromiljøet samtidig spores under bildebehandling. Tumorceller merket med fluorescerende proteiner kan frembringes i transgene mus som har blitt gjort i MMTV-PyMT-Dendra2 mus, med brysttumorceller merket med Dendra2 (figur 1A). Ved å krysse disse transgene mus med Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP mus, som har makrofager merket med ECFP er både kreftceller og makrofager merket i MMTV-PyMT mus. Med dobbel merking formasjonen tumorceller og makrofager, kan den direkte interaksjon mellom de to celletyper visualiseres i sanntid (figur 1A). I tillegg kan humane brystcancercellelinjer eller pasient-avledet tumor-celler transdusert med GFP brukes til å merke tumorceller. Makrofager kan merkes ved hjelp av fluorescensmerkede 70 kDa dekstran som akkumuleres i fagocytiske makrofager (figur 1B). Disse metodene har fremmet studier av dynamiske flercellede hendelser som tumorcelle-makrofag streaming motilitet, vaskulær permeabilitet og tumorcelle intravasation. For å visualisere endringer i svulst vaskulær permeabilitet, en fluorescensmerket vekt dekstran høy molekyl (er 155 kDa eller høyere anbefales 9,13,21,22) eller kvanteprikker brukes til å merke det vaskulære rom (figur 1). 155 kDa dekstran eller kvanteprikker er store nok til at de ikke lett diffundere gjennom interendothelial mellomrom 23.
Kontinuerlig høy oppløsning avbildning forenkler fangst av vaskulær permeabilitet hendelser ogkvantifisering av kinetikken av dekstran bloduttredelse og klaring på TMEM (figur 2 og Movie 1). Siden det vaskulære rom er lett defineres av 155 kDa-dekstran ved initieringen av time-lapse sekvens (som i 0 'på figur 2) ekstravaskulære fluorescerende dekstran kan kvantifiseres i hver ramme av time-lapse sekvens. Figur 2 og film 1 demonstrere bloduttredelse av 155 kDa dekstran-TMR injiseres gjennom en halevenekateter i en MMTV-PyMT-Dendra2; Csf1r-CFP mus. Dendra2-merkede tumorceller (grønt) og CFP-merket makrofager (cyan) brukes til å identifisere TMEM i levende dyr. Den TMEM struktur på stedet av vaskulær permeabilitet er skissert i en hvit boks. Den vaskulære rommet er merket med 155 kDa dekstran-TMR (rød) for å visualisere strømmer blodkar og bloduttredelse av vaskulære innhold under hendelsene i vaskulær permeabilitet. Toppen av 155 kDa dekstran-TMR ekstravasasjonpå figur 2 er sett mellom 29 'og 34'. Ekstravaskulære dekstran er sett på det hvite pilspissen i toppfeltene og på den røde pilspissen i nedre paneler, viser bare kanal for den 155 kDa dekstran-TMR. Den 155 kDa dekstran-TMR tømmer fra vevet og blir sett på som en reduksjon i ekstravaskulær TMR signal som sett på 97 "i figur 2. Etter kompilering av time-lapse sekvens i ImageJ ekstravaskulære dekstran kvantifiseres.
I tillegg til å observere spontane hendelser i svulsten mikromiljøet, er det viktig å studere de underliggende molekylære mekanisme av de identifiserte fenomener. Injisering flere vaskulære fargestoffer eller proteiner for å indusere vaskulær permeabilitet kan gi innsikt i signal hendelser som regulerer vaskulær permeabilitet. Figur 3 viser forskjellen i bloduttredelse av 10 kDa dekstran-FITC (grønn) og 155 kDa dekstran-TMR (rød).Høy molekylvekt 155 kDa dekstran-TMR administreres umiddelbart før starten av time-lapse imaging. Fem Z-stabler er ervervet i time-lapse sekvens for å sette en baseline før 10 kDa dekstran-FITC injiseres. Etter oppkjøpet av 5 th Z-stable 10 kDa dekstran-FITC administreres gjennom halevenekateter uten å forstyrre bildet oppkjøpet. Den dekstran-FITC ses inn i vaskulaturen med umiddelbar ekstravasering, mens den 155 kDa dekstran-TMR forblir begrenset til det vaskulære rom (figur 3, 0 'og 6'). Det 10 kDa dekstran-FITC ekstravaserer fullstendig fra blodkaret og fjerner fra vev som forlater 155 kDa dekstran-TMR i blodkaret (figur 3 som vist ved 56 'og filmen 2). Ved hjelp av en tid fra punkt før injeksjon, kan kinetikken av 10 kDa dekstran-FITC ekstravasasjon lett sammenlignet med 155 kD dekstran-TMR 13. Den umiddelbare bloduttredelse på 10 kDa dextren-FITC etter injeksjon er vesentlig forskjellig fra oppbevaring av 155 kDa dekstran-TMR i blodkar og spontane vaskulær permeabilitet hendelser 13. Andre eksperimentelle kontroller kan utføres inkludert indusere vaskulær permeabilitet gjennom mekanisk forstyrrelse av endotelet eller gjennom VEGFA 165 -mediert permeabilitet 13. Kinetikken til ekstravasasjon av 155 kDa dekstran-TMR av spontane permeabilitet hendelser kan sammenlignes med 10 kDa dekstran, og andre midler for å indusere vaskulær permeabilitet for å forstå de hendelser og signalene som er involvert i vaskulære permeabilitet hendelser i svulsten mikromiljøet.
Figur 1. Strategier for merking celler og blodkar i svulsten mikromiljøet. (A) transgene MMTV-PyMT mus med tumorceller merket med Dendra2 (MMTV-icre / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-PyMT) og makrofager merket med CFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Tumorvaskulatur er merket med 155 kDa dekstran-TMR administrert ved halevenekateter. (B) TN1-GFP pasient avledet xenografttumorer med makrofager merket med 70 kDa dekstran-Texas Red og blodkar merket med kvanteprikker bruker halevenekateter. Scale bar, 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Visualisering transient vaskulær permeabilitet. (A) intravital mikroskopi (IVM) time-lapse av 155 kDa dekstran-TMR (rød) ekstravasasjon og tumorcelle intravasation på TMEM (hvit boks). Tumorceller merket med Dendra2 (grønn, TC), makrofager med ECFP (cyan, M) og blood skip med 155 kDa dekstran-TMR (rød, BV). Blodkar permeabilitet områder (hvit pilspiss). (B) Isolert 155 kDa dekstran-TMR kanal. Røde piler markere dekstran ekstravasasjon (hvit). Scale bar, 50 mikrometer. Film av time-lapse mikroskopi i filmen en. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Visualisering flere fluorescensmerkede dekstraner. IVM time-lapse av forskjell i ekstravasasjon av 155 kDa dekstran-TMR (rød) og 10 kDa dekstran-FITC (grønn). Makrofager er merket med ECFP (cyan) og kollagen i blått (SHG). Den overlegg av rød 155 kDa dekstran-TMR og grønt 10 kDa dekstran-FITC i blodkar er gul. Rapid ekstravasasjon av grønn 10 kDa dekstran-FITC topp er på 6 min. scale bar, 50 mikrometer. Film av time-lapse mikroskopi i Movie 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Movie 1. Visualisering spontan transient vaskulær permeabilitet med time-lapse IVM. Time-lapse mikroskopi (som vist i figur 2) av forbigående blodkar permeabilitet visualisert i en transgen MMTV-PyMT mus med tumorceller merket med Dendra2 (MMTV-icre / CAGCAT -Dendra2 / MMTV-PyMT) og makrofager merket med CFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Ekstravasasjon av 155 kDa dekstran-TMR ekstravasasjon (rød i panelet til venstre, høyre panel hvit) er observert ved forgrening av svulsten blodkar. Please klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Movie 2. Visualisering ekstravasasjon av flere fluorescensmerkede dekstraner av time-lapse IVM. Time-lapse mikroskopi (som vist i figur 3) av ekstravasasjon av 155 kDa dekstran-TMR (rød) og 10 kDa dekstran-FITC (grønn) i en transgen MMTV-PyMT mus med makrofager merket med CFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). SHG av kollagen er merket i blått. Red 155 kDa dekstran-TMR forblir i tumor blodkar for varigheten av time-lapse mens den grønne 10 kDa dekstran-FITC raskt ekstravaserer og tømmer fra blodårer og vev. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellular interaksjoner som oppstår spontant i svulsten mikromiljøet kan føre til endringer i tumor cellemotilitet og intravasation. Høy oppløsning intra avbildning av levende svulstvev tillater visualisering av multi-mobilnettet dynamikk som kan være svært forbigående 10,13,24. End-point in vivo eller time-lapse bilder ervervet med diskrete tidspunkter kan gi viktig informasjon om molekylære mekanismer av prosesser i svulsten mikromiljøet. Intrabilde studier har blitt brukt til å studere prosesser i svulsten mikromiljøet som oppstår over flere dager, genererer ny innsikt i angiogenese, tumorcellemigrering og respons til medikamentbehandling 25-30. Men disse analysene kan ikke fange kinetikken av forbigående hendelser i svulsten mikromiljøet på grunn av tidsskala på de prosessene som studeres 7,31. Skille flere forbigående hendelser fra konstant prosesser er en vesentlig annonseutsikts av intravital mikroskopi.
Den intraavbildningsteknikk som er beskrevet i denne protokollen muliggjør direkte visualisering av cellulære dynamikk i svulsten mikromiljøet ved fluorescens-merking av flere celle linjene og strukturer. Multiphoton mikroskopi tillater større dybde av bildebehandling i løpet av single-foton konfokalmikroskopi med dybder på 300 mikrometer rutinemessig utført 24. Oppkjøp av Z-stabler av 50-100 mikrometer med 2 mikrometer trinn er av høy nok oppløsning til å generere 3D rekonstruksjon av cellulære interaksjoner, inkludert fremspring som cellene gjør som de strekker seg mot hverandre 13 og vaskulære strukturer i svulsten mikromiljøet. Filmer og 3D rekonstruksjoner fra time-lapse bildesekvenser tillate for kvantifisering av celle motilitet (hastighet og retningen) og ved hjelp av endringer i fluorescerende signal intensitet injiserbare fargestoffer, vaskulær permeabilitet.
For å fange opp spontaneous cellulære hendelser antall individuelle bilder tatt i en enkelt sekvens må være optimalisert for å gi rom for en rate på bildet oppkjøpet som fanger kinetikken av hendelsen, men det dekker også et tilstrekkelig fysisk plass til å øke sannsynligheten for å fange enkeltepisoder i løpet av én time-lapse sekvens. Den romlige bildeparametere som må vurderes inkluderer; antall skiver i en Z-stabel, antallet synsfelt med Z-stabler ervervet og den aksiale avstand mellom de enkelte skiver i en Z-stabel. Derfor, sette disse parametrene før image oppkjøpet er et kritisk punkt i protokollen. Bruke multiphoton mikroskop, oppkjøp av 30 bilder (500 mikrometer x 500 mikrometer) i en z-serien er ca 60 sek. Siden varigheten av observerte tumorcelle intravasation kan være av størrelsesorden minutter 13, fanger flere Z-stabler for 3D-rekonstruksjon av intravasation, ble innsamlingstiden for en Z-stabel begrenset to 60 sek. Derfor ble et enkelt synsfelt med opptil 30 stykker i en Z-stack ervervet. Videre, ettersom 3D rekonstruksjon av celler var ønsket, den aksiale steg mellom Z-stykker ble satt til 2 um. Dette gir tilstrekkelig informasjon om cellevolum for å tillate 3D rekonstruksjon. Disse parametrene må være optimalisert for alle mikroskop og bildebehandling brukes basert på kinetikken av live events som studeres.
Modifiseringen av de gummiputen på objektbordet og i halevenen iv kateter har begge tillatt for en betydelig økning i bilde tid. Gummiputen danner en brønn for å muliggjøre opprettholdt hydratisering av svulsten mens XY drift minimere på dekkglass. Kombinasjonen av varmekammeret med administrering av PBS opprettholder hydrering og fysiologisk temperatur på dyr. Disse forholdene kombinert opprettholde vaskulær perfusjon og blodstrøm for å tillate utvidet avbildning av cellulære hendelser på tumor vasculature inkludert vaskulær permeabilitet og tumorcelle intravasation.
En begrensning ved denne teknikk er antallet fluorescerende markører som kan brukes til å visualisere celler i tumoren mikromiljøet. Generering av transgene mus med andre celletyper (dvs. endotelceller, fibroblaster eller pericytes) inneholdende fluorescerende protein kan være vanskelig og tidkrevende. Imidlertid kan potensielle fremtidige anvendelser utnytter en kombinasjon av fluorescerende protein merking av stromale celletyper med implanterte tumorceller og 70 kDa dekstran merking av makrofager. Ved å bruke en kombinasjon av disse merking strategier og krysse transgene mus nye kombinasjoner av cellulære etiketter kan genereres for å vurdere cellulær bevegelse og hendelser i svulsten mikromiljøet.
I motsetning til endepunkts eksperimenter basert på immunfluorescens farging, tillater høy oppløsning intramikros visualisering av spontan og forbigåendehendelser i svulsten mikromiljøet. Den intra bildebehandling prosedyren som er beskrevet her avslører nye hendelser og cellulære interaksjoner i svulsten mikromiljøet som ikke kan tydet fra statiske bilder. Med romanen informasjon om samspill celletyper eller prosesser, og kinetikk disse hendelsene kan hypoteser bli generert for å undersøke signalveier som driver disse interaksjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av det amerikanske forsvarsdepartementet Breast Cancer Research Program under award nummer (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324 og Integrated Imaging Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 ml |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 ml syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 x 50 mm |
| PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors | Kent Scientific | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch |
References
- Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
- Wang, H. -L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
- Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
- Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
- Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
- Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
- Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
- Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J.
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
- Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
- Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790 (2013).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).
