Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מחק את תפקודם של חלבוני איתות: לקראת תרפים התמר איתותים מלאכותיות

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

Introduction

מסלולי העברת אותות לשחק תפקיד משמעותי כמעט בכל תהליך הסלולר המאפשרים לתא להגיב לאותות סביבתיים במהירות. 1 מסלולים אלה הם בדרך כלל מופעלים על ידי הקשירה של מולקולת איתות קולטן תאי, שתוצאתה הפעלה של אנזימים תאיים. הגברת התפשטות של האיתותים בתוך התא מתווכת על ידי הפונקציה של איתות חלבונים יוצרים רשת של אינטראקציות בין חלבונים שבו אנזימים מופעלים הפיך עם סגוליות גבוהות. בגלל חוסר ויסות של רשתות אלה לעיתים קרובות מוביל להתפתחות סרטן, חלה התעניינות רבה בהקמת 'טיפול הולכת אותות של סרטן', 2 לפיה תרופות נועדו לשבש מסלולי איתות ממאיר. הצענו לאחרונה גישה חלופית לאותת טיפול תמרה המסתמך על היכולת של תרופות כדי ליצור מסלולי העברת אותות טבעיים.

כדי להוכיח את ההיתכנות של גישה זו, יצרנו לאחרונה 'מתמר כימי "סינתטי 4 המאפשר גורם גדילה הנגזרות טסיות (PDGF) כדי לעורר את המחשוף של prodrug נגד סרטן על ידי הפעלת גלוטתיון-s-transferase (GST), אשר הוא לא שותף המחייב טבעי. המבנה של "מתמר" זה מורכב aptamer DNA אנטי PDGF כי הוא שונה עם מעכב הדו-ערכי עבור GST. לפיכך, סוכן סינתטי זה שייך למשפחה של מולקולות עם אתרי הקישור כדיחלבונים שונים, 5-7 כגון מעוררים כימיים של dimerization (מספרי CID) 8-10 וגם לקבוצת חלבון-קלסרים מבוססת על conjugates מולקולה סינטטי oligonucleotide. 11-21

העקרונות הכלליים שבבסיס העיצוב של מערכות כאלה מתוארים במסמך זה ו פרוטוקולים מפורטים סינתזה ובדיקת התפקוד של זה 'מתמר' עם מבחני האנזימטית קונבנציונליים מסופקים. עבודה זו נועדה להקל על פיתוח 'מתמרים' נוסף של מחלקה זו, אשר עשוי לשמש לתווך תקשורת בין חלבונים תאיים וכתוצאה מכך, לגרום מסלולי איתות תאים מלאכותיים.

איור 1 סכמטי המתאר את עקרונות ההפעלה של הסינתטי "מתמר כימי 'שיכול לתווך תקשורת בין חלבונים טבעיים. באיור זה, א 'מתמר כימית', משלבת קלסרים סינטטי protEins I ו- II (קלסרים I ו- II), מאפשרים חלבון השני כדי לעורר את הפעילות הקטליטית של חלבון לי, שהוא לא שותף המחייב טבעי. בהיעדר חלבון II, מתמר נקשר לאתר הקטליטית של האנזים (אני חלבון) ומעכב את פעילותו (איור 1, המדינה השנייה). הכריכה של "מתמר" לחלבון השני, לעומת זאת, מקדם אינטראקציות בין לי קלסר ועל פני השטח של חלבון II (איור 1, מדינת iii), אשר מפחית זיקה כלפי I. חלבון כתוצאה מכך, הוא הריכוז היעיל של ' מתמר חינם 'בפתרון הצטמצם, מה שמוביל דיסוציאציה של החלבון מתמר שאני מורכב וכדי מחדש של חלבון אני (איור 1, מדינת iv). יחדיו, את הפעולות הבאות להדגיש שלושה עקרונות יסוד שביסוד העיצוב של 'מתמר' יעיל: (1) "מתמר" צריך קלסר ספציפי עבור כל אחת מן מטרות החלבון, (2) betwe האינטראקציהen קלסר השני והחלבון שני צריכים להיות חזק יותר את האינטראקציה בין לי קלסר והחלבון לי, ו- (3) קלסר אני חייב להיות מסוגל לקיים אינטראקציה עם פני השטח של חלבון II. העיקרון אחרון זה לא בהכרח דורש קלסר שאני לבד תהיה זיקה גבוהה סלקטיביות לכיוון החלבון השני. במקום זאת, היא מבוססת על המחקרים עדכניים שלנו שהראו כי הבאת מולקולה סינטתית בסמיכות חלבון עשויה לקדם אינטראקציות בין מולקולה זו ועל פני השטח של החלבון. 19,22,23

איור 1

איור 1:. הפעלת עקרונות 'מתמר כימי' כאשר 'מתמר הכימית' מתווסף חלבון פעיל אני (מדינת i), הוא נקשר לאתר הפעיל שלה באמצעות קלסר לי ומעכב את פעילותו (המדינה השנייה). בנוכחות החלבון השני, לעומת זאת, לא כרוך לא כימיתransducer 'אינטראקציה עם חלבון II באמצעות קלסר השנייה, המקדמת אינטראקציות בין לי קלסר ועל פני השטח של חלבון II. קלסר המושרה זה I-חלבון II אינטראקציה מפחית את ריכוז יעיל של קלסר לי, מה שמוביל דיסוציאציה של שנות ה-חלבון transducer' שאני מורכבים לחלבון שאני מחדש (המדינה iv). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה של 'מתמר הכימי "

  1. הכנות מוקדמות
    1. הכן 2 M triethylammonium אצטט (TEAA) חיץ על ידי ערבוב 278 מ"ל של triethylamine עם 114 מ"ל של חומצה אצטית 400 מ"ל מים ultrapure. התאם את ה- pH עד 7 ומוסיפים מים עד נפח סופי של 1 ל Keep it בבקבוק כהה.
      הערה: פתרון זה הוא יציב במשך שנים.
    2. כן פתרון חומצה אסקורבית 5 מ"מ על ידי המסת 18 מ"ג של חומצת אסקורבית ב 20 מ"ל מי ultrapure. השתמש פתרון חדש; הפתרון הוא יציב במשך יום אחד.
    3. הכן 10 מ"מ Cu (II) / טריס (benzyltriazolylmethyl) אמין פתרון (TBTA) על ידי המסת 25 מ"ג נחושת (II) pentahydrate סולפט ב 10 מ"ל מים ultrapure ו -58 מ"ג של TBTA ב 11 מ"ל דימתיל sulfoxide (DMSO). מערבבים את שני פתרונות. שמור את זה בטמפרטורת החדר ולהגן עליו מפני האור.
  2. נוהל הצמיד
    1. ממיסים 100 nmol של oligonucleotide שונה (ODN-1) ב 80 μlמי ultrapure טריים. הוסף 20 μl של 2 M TEAA, pH = 7. הוסף 80 μl של פתרון עתה הוצעה חומצה אסקורבית (5 מ"מ במים).
    2. ממיסים 1.5 μmol (574.5 מיקרוגרם) של חומצה ethacrynic-modified azido ב 180 μl של DMSO ולהוסיף אותו הפתרון. דגה את הפתרון באמצעות ארגון למשך 60 שניות ובמהירות להוסיף 40 μl מן Cu (II) / פתרון TBTA (10 מ"מ ב -55% (v / v) DMSO / מים).
    3. טהר שוב עם ארגון וסוגרים היטב, ומערבבים לילה.
    4. מעקב אחר ההתקדמות של התגובה ולטהר המצומד ידי RP-HPLC (שלב נייד: א) 5% אצטוניטריל, 5% TEAA, מי ultrapure 90%; B) 65% אצטוניטריל, 5% TEAA, 30% מים ultrapure). 24

2. שליטה פעילות GST ידי PDGF

  1. הכנות מוקדמות
    1. כן 50 מיליליטר של חיץ assay על ידי ערבוב 33.9 מיליליטר של פוספט שנאגר מלוח (PBSx1) עם 16.1 מיליליטר מי ultrapure להשיג ריכוז פוספט סופי 8 מ"מ ו מודעהד 23.8 מ"ג של MgCl 2 כדי להשיג ריכוז סופי 5 מ"מ.
    2. הכן פתרון המניות של GST M1-1 ידי המסת החלבון חוצץ המכיל 50 מ"מ טריס pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 מ"מ dithiothreitol (DTT), ו -5 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לריכוז סופי של 30 מיקרומטר. מחלק את הפתרון הזה לתוך aliquots וחנות קטן ב -80 C. לדלל טרי, לפי סעיף 2.1.5.1, למאגר Assay ולשמור על הקרח.
      הערה: הפתרון יהיה יציב למשך כ -5 שעות, או עד יש ירידה בפעילות האנזים.
    3. מכין את המצע על פי ההוראות הבאות:
      1. ממיסים 10 מ"ג של גלוטתיון מופחת (GSH) ב 325 μl של מים ultrapure לריכוז סופי של פתרון המניות 100 מ"מ. לדלל 21 μl מפתרון המניה הזו ב 979 μl של חיץ Assay עבור ריכוז סופי של הפתרון עובד 2.1 מ"מ.
      2. ממיסים 10 מ"ג של 2,4-dinitrochlorobenzene (CDNB) ב 492 μl של דוארthanol לריכוז סופי של פתרון המניות 100 מ"מ. לדלל 43.2 μl מפתרון המניות ב 956.8 μl של חיץ Assay עבור ריכוז סופי של הפתרון עובד 4.32 מ"מ.
    4. צלחת 96-היטב, לשים את כל מצע בשורה נפרדת (12 בארות). הכנס לפחות 60 μl היטב לתוך כל אחד כדי לאפשר נסיגה מהירה וקלה של הפתרון. מכסים את הצלחת עם גיליון אלומיניום להגנה אור.
    5. הכן את פתרונות המניות הבאות למאגר Assay:
      1. לדלל GST M1-1 ב -50 לריכוז סופי של 0.6 מיקרומטר של דימר.
      2. לדלל את 'מתמר כימי "כדי פתרון מניות 30 מיקרומטר.
      3. לדלל PDGF לריכוז סופי של 40 מיקרומטר.
      4. לדלל aptamer PDGF לריכוז סופי של 250 מיקרומטר.
  2. מדדו את פעילות GST בנוכחות של 'מתמר כימי' ו PDGF.
    1. הגדרת i הליך הניסויn קורא הצלחת למדידת קינטית.
      1. צור ניסוי חדש כמו 'פרוטוקול סטנדרטי ".
      2. לחץ על "נוהל" כדי לפתוח את חלון הגדרות הליך.
      3. ברשימת הקופצות בצד העליון של החלון, בחר את סוג '384 צלחת' לפי יצרן הצלחת.
      4. "לקרוא" לחצו בתפריט השמאלי.
      5. לגבי שיטת זיהוי לבחור "ספיגה".
      6. באשר לסוג הקריאה לבחור "נקודת סיום".
      7. כתוב 340 ננומטר על החלון הגל.
      8. לחץ על החלק התחתון "צלחת מלאה" בצד הימני העליון ולבחור הבאר כדי להימדד.
      9. 'בסדר' כדי לסגור את החלון 'קרא'.
      10. בחר "להתחיל התנועתיות" בתפריט השמאלי.
      11. הפוך את 10 דקות לרוץ זמן.
      12. בחר באפשרות המרווחת מינימום.
      13. לחץ על 'אישור' כדי לסגור את החלון קינטית.
      14. גרור את i קו 'קרא'n כדי המדידה קינטית.
      15. לחצו על כפתור "לאמת" ולאחר מכן על הלחצן 'אישור'.
      16. שמור את הניסוי.
      17. לחצו על הלחצן 'הפעל'. תיבת דו-שיח תופיע - ללחוץ על כפתור 'אישור' רק כאשר המדידה יש ​​להתחיל.
    2. על מנת לבצע את הניסוי triplicates, להכין ארבעה דוגמאות שכל אחת מהן מכילה 3.25 μl של 'מתמר כימי' ו 3.25 μl של GST M1-1. הוסף מדגם 0, 1.2, 2.4, או 4.9 μl של PDGF ו- 123.5, 122.3, 121.1, 118.6 או μl של חיץ assay, בהתאמה.
    3. דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    4. בצלחת גם 384-שקוף, להוסיף 40 μl של מדגם זה טוב. הכנס את הדגימות רק בארות המוזרות או רק הבארות אפילו באותה השורה כדי לאפשר את השימוש של פיפטור רב עבור בנוסף מצע.
    5. באמצעות 12 ערוצים רב פיפטור, להוסיף במהירות 10 μl מכל אחת tהוא מצעים שהיו מוכנות מראש בצלחת 96-היטב (סעיף 2.1.4). מערבבים בעדינות ובמהירות, כדי למנוע בועות. הכנס את הצלחת לתוך הקורא ולהתחיל המדידה קינטית. מאז קינטיקה GST היא מהירה למדי, מנסה לצמצם את הזמן בין בנוסף המצע לבין תחילת המדידה קינטית.
  3. מחזורי GST הפעלה / עיכוב מתווך על ידי 'מתמר הכימי ".
    1. על מנת לבצע את הניסוי triplicates, להכין 5 דגימות שכל אחת מהן מכילה 84.5 μl של חיץ assay, 3.25 μl של 'מתמר כימי', ו 3.25 μl של GST M1-1. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
    2. להוסיף 3.65 μl של חיץ Assay לדגום 1 ו 3.65 μl של PDGF קטעים 2-5. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
    3. להוסיף 3.12 μl של חיץ Assay קטעים 1-2 ו 3.12 μl של aptamer PDGF קטעים 3-5. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
    4. להוסיף 24.4 μl של חיץ Assay כדי דגימות1-3 ו 24.4 μl של PDGF קטעים 4-5. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
    5. להוסיף 7.8 μl של חיץ Assay קטעים 1-4 ו -7.8 μl של aptamer PDGF לדגום 5. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    6. בצלחת גם 384-שקוף, להוסיף 40 μl של מדגם לבאר כל אחד. דגימות הכניסו רק לתוך מוזר או רק לתוך הבארות אפילו באותה השורה.
    7. באמצעות 12 ערוצים רב פיפטור, להוסיף במהירות 10 μl מכל מצע (מוכן מראש בצלחת 96-היטב). מערבבים בעדינות ובמהירות, כדי למנוע בועות. הכנס את הצלחת לתוך הקורא ולהתחיל המדידה קינטית.
    8. חשב את V 0 [MOD / min] תחת כל תנאי על ידי הפחתת OD הנמדדים 340 ננומטר בזמן t = 0.5 דקות מן OD הנמדדים 340 ננומטר בזמן t = 1.5 דקות כדי להעריך את המחזור הפעלה / עיכוב. 25
  4. להעריך את התגובה בזמן אמת של 'מתמר כימי "כדי השינויים בסביבה.
      <li> אפקט בזמן אמת של בנוסף PDGF
      1. הגדרת הליך ניסיוני בקורא הצלחת למדידת קינטית.
      2. חזור על שלבי 2.2.1.1-2.2.1.10.
      3. הפוך את זמן הריצה 3.5 דקות.
      4. בחר באפשרות המרווחת מינימום.
      5. לחץ על 'אישור' כדי לסגור את החלון קינטית.
      6. גרור את הקו 'קרא' לתוך המדידה קינטית.
      7. בחר פלייט מתוך / ב בתפריט השמאלי.
      8. בחר באפשרות 'צלחת החוצה (לא הדו-שיח)'.
      9. בחר באפשרות 'העיכוב' בתפריט השמאלי וזן 30 שניות.
      10. בחר פלייט מתוך / ב בתפריט השמאלי.
      11. בחר באפשרות 'הצלחת (לא הדו-שיח)'.
      12. צור מדידת הקינטית שנייה על ידי חזרה על שלבי 2.2.1.4 - 2.2.1.14 אבל בסעיף 2.2.1.11 להגדיר את הקינטית להיות 25 דקות במקום 10 דקות.
      13. לחצו על כפתור "לאמת" ולאחר מכן על הלחצן 'אישור'.
      14. שמור את הניסוי.
      15. לחצו 'צבא השחרור העממילחצן 'y. תיבת דו-שיח תופיע - ללחוץ על כפתור 'אישור' רק כאשר המדידה יש ​​להתחיל.
      16. הכינו שתי דגימות ידי ערבוב 1 μl של GST M1-1 ו 1 μl של 'מתמר כימי' ב 38 μl של חיץ assay. הכנס את הדגימות לשתי בארות של צלחת גם 384-שקופה, עוזב באר מים ריק בין שתי בארות אלה.
      17. באמצעות 12 ערוצים רב פיפטור, להוסיף במהירות 10 μl מכל המצע, מערבבים בעדינות ובמהירות, כדי למנוע בועות, הכנס את הצלחת לתוך הקורא ולהתחיל המדידה קינטית.
      18. כשהצלחת פותחת (לאחר 3.5 דקות), להוסיף במהירות 1.125 μl של PDGF לאחד הבארות, ומערבבים בעדינות, ולאפשר את הצלחת לסגור למדידות הקינטית הנותרים.
    1. אפקט בזמן אמת של הוספת aptamer PDGF
      1. חזור על שלבי 2.4.1.1-2.4.1.15.
      2. הכינו שתי דגימות ידי ערבוב 1 μl של GST M1-1, 1 μl של 'מתמר כימי ', ו 1.125 μl של PDGF ב 36.9 μl של חיץ assay. הכנס את הדגימות לשתי בארות של צלחת גם 384-שקופה, עוזב באר מים ריק בין שתי בארות אלה.
      3. באמצעות 12 ערוצים רב פיפטור, להוסיף במהירות 10 μl מכל המצע, מערבבים בעדינות ובמהירות, כדי למנוע בועות, הכנס את הצלחת לתוך הקורא, ולהתחיל המדידה קינטית.
      4. כשהצלחת פותחת (לאחר 1.5 דקות), להוסיף במהירות 1.2 μl של aptamer PDGF לאחד הבארות, ומערבבים בעדינות ולאפשר את הצלחת לסגור למדידות הקינטית הנותרים.
  5. מדוד JS-K prodrug הפעלה באמצעות GST בנוכחות של 'מתמר כימי' ו PDGF.
    1. הגדרת הליך ניסיוני בקורא הצלחת למדידת קינטית.
      1. צור ניסוי חדש כמו 'פרוטוקול סטנדרטי ".
      2. לחץ על "נוהל" כדי לפתוח את חלון הגדרות הליך.
      3. ברשימת הקופצות בצד העליון של החלון לבחור סוג '384 צלחת' לפי יצרן הצלחת.
      4. "לקרוא" לחצו בתפריט השמאלי.
      5. לגבי שיטת זיהוי בוחרת "ספיגה".
      6. באשר לסוג הקריאה לבחור "נקודת סיום".
      7. כתוב 305 ננומטר על החלון הגל.
      8. לחצו על הכפתור "צלחת מלאה" בצד הימני העליון ולבחור הבאר כדי להימדד.
      9. 'בסדר' כדי לסגור את החלון 'קרא'.
      10. בחר "להתחיל התנועתיות" בתפריט השמאלי.
      11. הפוך את 10 דקות לרוץ זמן.
      12. בחר באפשרות המרווחת מינימום.
      13. לחץ על 'אישור' כדי לסגור את החלון קינטית.
      14. גרור את הקו 'קרא' לתוך המדידה קינטית.
      15. לחצו על כפתור "לאמת" ולאחר מכן על הלחצן 'אישור'.
      16. שמור את הניסוי.
      17. לחצו על הלחצן 'הפעל'. Bo-שיחx יופיעו - לחץ על הלחצן 'אישור' רק כאשר יש להתחיל את המדידה.
    2. לייצור NO מדידות להשתמש בערכת קלוריות ניטריט / ניטרט. צלחת 96-היטב להכניס 50 μl של חיץ assay לתוך שורה אחת, 70 μl של Griess שאני מגיב לתוך בשורה שנייה, ו -70 μl של מגיב Griess השני לתוך בשורה שלישית.
    3. על מנת לבצע את ניסוי triplicates, להכין ארבע דוגמאות שכל אחת מהן מכיל 4.8 μl של 'מתמר הכימי ". כדי לדגום 1, להוסיף 155.2 μl של חיץ Assay; לדגום 2, להוסיף 3.2 μl של GST-M1-1 ו -152 μl של חיץ Assay; לדגום 3, להוסיף 9.6 μl של PDGF ו- 145.6 μl של חיץ Assay; וכדי לטעום 4, להוסיף 3.2 μl של GST-M1-1, 9.6 μl של PDGF, ו 142.4 μl של חיץ assay.
    4. דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    5. בצלחת גם 384-שקוף, להוסיף 50 μl של מדגם לבאר כל אחד. דגימות הכנס רק מוזר או רקאפילו בארות באותה השורה כדי לאפשר את השימוש של פיפטור רב עבור בנוסף מצע.
    6. להוסיף 0.54 μl של JS-K (5 מ"מ DMSO) זה טוב.
    7. באמצעות 12 ערוצים רב פיפטור, להוסיף במהירות 10 μl מפתרון GSH (מוכנה מראש בצלחת 96-היטב), לערבב בעדינות ובמהירות כדי למנוע בועות. הכנס את הצלחת לתוך הקורא ולהתחיל המדידה קינטית.
    8. מיד לאחר המדידה קינטית, באמצעות רב פיפטור 12 ערוצים, לקחת 50 μl מכל מדגם לתוך השורה חיץ assay בצלחת 96-גם מוכנה מראש ובמהירות ולהוסיף לו 50 μl של מגיב Griess I ו- 50 μl של מגיב Griess השנייה. דגירה, תוך הגנה מפני אור במשך 10 דקות ב RT ולמדוד את הספיגה ב 550 ננומטר.
      הערה: חיץ assay והנפחים ריאגנטים תלויים בפרוטוקול 'הערכות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

העיצוב, הסינתזה, מנגנון הפעולה של 'מתמר כימי' שיכול לגרום תקשורת מלאכותית בין PDGF ו- GST מוצג באיור 2. המבנה של "מתמר" משלב aptamer PDGF DNA וכן אמיד bis-ethacrynic (BEA ), אשר הינו מעכב GST ידוע (איור 2 א). 19 קלסרים אלה מאפשרות 'מתמר' להיקשר הן עם PDGF ו- GST זיקות שונות, כלומר, עם קבועי דיסוציאציה (K ד 'ים) של 26 ננומטר ו -144 ננומטר, בהתאמה . 4 בנוסף, על פי עיצוב זה, מחייב PDGF אמור להשרות אינטראקציות שאינן ספציפיות בין יחידת BEA ועל פני השטח של PDGF, אשר יפחית את העצמה ניכרת של מעכב BEA. 19,22,23 2b האיור ממחיש את מנגנון הפעלה הבסיסי במערכת זו. עם הוספת 'מתמר' ל GST פעיל,שתי יחידות EA לאגד שני אתרים פעילים בו זמנית של האנזים dimeric זה ומעכבות את פעילותה. בנוכחות PDGF, לעומת זאת, קומפלקס PDGF-'transducer 'הוא נוצר, אשר מונע את יחידת ביה מן עיכוב GST. זה וכתוצאה מכך מוביל הניתוק של GST-'transducer 'המורכב וכדי מחדש GST. GST אז יכול להיות מחדש מעוכב על ידי הוספת aptamer PDGF ללא שינוי כי מחליף את 'מתמר הכימית' ומאפשר לה לעכב GST שוב.

היכולת של PDGF לשלוט בפעילות GST הוצגה לראשונה על ידי מדידת GST (10 ננומטר) פעילות עם ובלי 'מתמר כימיים "(500 ננומטר) ומדידת הפעילות של המתחם GST-'chemical מתמר' בנוכחות ריכוזים שונים של PDGF (250, 500, ו -1,000 ננומטר) (איור 3 א). לאחר הקמת כי "מתמר כימי 'גורם תקשורת PDGF-GST מלאכותית, אנחנוהבא נקבע כי תקשורת מלאכותית זו, בדומה הצעדים הולכים אותות, הוא גם הפיכה ומסתגל במהירות לשינויים בסביבה. עיכוב הפעלה / הפיך של GST בוצע על ידי תוספות רציפות של PDGF ו aptamer PDGF ללא שינוי כדי מתמר GST-'chemical 'המורכב (איור 3B). התגובה של המערכת לשינויים בזמן האמת בסביבתו הוערכה על ידי מדידת פעילות GST תוך הוספת התשומות השונות. עלייה מהירה של פעילות GST נצפתה על התוספת של PDGF (750 ננומטר) ל GST-'transducer 'המורכב (10 ננומטר ו 500 ננומטר, בהתאמה) 3.5 דקות לאחר הוספת מצעים (איור 4 א). באופן דומה, ירידה בפעילות GST נצפתה על תוספת של aptamer PDGF (5 מיקרומטר) עד לקבלת עיסה של GST (10 ננומטר), PDGF (750 ננומטר), ו 'מתמר כימיים "(500 ננומטר) (איור 4 ב).

Fל בסוף, הראינו את היכולת של מערכת כזו לשלוט הפעלת prodrug בתגובה לשינויים בסביבה. JS-K הוא prodrug נגד סרטן מופעל על ידי GST לשחרר NO הרעיל (איור 5 א). כמות NO שוחרר על תוספת של JS-K (45 מיקרומטר) ל 'מתמר כימיים "(750 ננומטר) ושילובים שונים של GST (10 ננומטר) ו PDGF (2 מיקרומטר) נמדדו (איור 5 ב'), ובכך אישר כי רק במעמד שני GST ו PDGF יגרום הפעלת prodrug.

איור 2
איור 2. "מתמר כימית" -. סינתזה מנגנון ההפעלה (א) 'מתמר כימי' מורכב aptamer PDGF, אמיד ethacrynic הדו-ערכי (EA) GST מעכב, fluorophore (FAM), וכן מרווה (Dabcyl) . המצומד aptamer-מעכב זההוא מסונתז על ידי הצמדת אמיד ethacrynic-modified אזיד (EA) נגזרים על מהונדסים-dialkyne ו aptamer DNA שכותרתו fluorescently (ODN-1). Re מודפס באישור התייחסות 4. (ב) פעילות אנזימטית של GST מעוכבת על ידי 'מתמר כימי', בשל המחייב של קבוצות EA באתרים הפעיל של האנזים. תוספת של PDGF מובילה להיווצרות של "מורכב, אשר משבשת את 'PDGF-'chemical מתמר אינטראקצית GST-transducer', ולכן משחזרת את הפעילות האנזימטית. התוספת הבאה של aptamer PDGF ללא שינוי משחרר את "מתמר כימי" ומאפשר לה מחדש לעכב את האנזים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
אלחוטי. איור 3: פעילות GST שבשליטת PDGF (א) GST (10 ננומטר) הפעילות האנזימטית בנוכחות (-) והיעדר (-) של 'מתמר כימיים "(500 ננומטר), ובנוכחות של' מתמר כימי '(500 ננומטר) עם ריכוזים גוברים (250, 500, או 1000 ננומטר) של PDGF (---). (ב) מחזורי הפעלה עיכוב של הפעילות האנזימטית GST לידי ביטוי בין היתר משינויים המהירות ההתחלתית (V 0) בתגובה תוספות רציפים (IIV) של PDGF ו aptamer PDGF ללא שינוי כדי מתמר GST-'chemical 'מורכב: (אני) אף, PDGF (II) (750 ננומטר), (III) aptamer PDGF (4 מיקרומטר), (IV PDGF) (5 מיקרומטר), ו- (V) aptamer PDGF (10 מיקרומטר). הגרף מציג את ממוצע ± סטיית תקן של triplicates. Re מודפס באישור התייחסות 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה.

איור 4
. איור 4: שליטה בזמן אמת של פעילות GST (א) שיפור של הפעילות האנזימטית GST זוהה מיד לאחר תוספת של 750 ננומטר PDGF (-) כדי תמיסה המכילה GST (10 ננומטר) ו 'מתמר כימיים "(500 ננומטר) ( -) ב t = 3.5 דקות. תוספת (ב) של aptamer ללא שינוי PDGF (5 מיקרומטר) (-) כדי תמיסה המכילה GST (10 ננומטר), PDGF (750 ננומטר), ו 'מתמר כימיים "(500 ננומטר) (-) ב t = 1.5 דקות מוביל לירידה מיידית את קצב התגובה האנזימטית. Re מודפס באישור התייחסות 4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

5 "src =" / files / ftp_upload / 54,396 / 54396fig5.jpg "/>
איור 5:. מבוקרת הפעלת prodrug (א) GST הפעלה של prodrug JS-K לשחרר NO הרעיל. (ב) אין לשחרר בנוכחות של 'מתמר כימי' ושילובים שונים של GST (10 ננומטר) ו PDGF (2 מיקרומטר). הגרף מציג את ממוצע ± סטיית תקן של triplicates. השתנה באישור התייחסות 4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי קרן מינרווה, ארגון HFSP, ומענק המועצה האירופית למחקר (החל גרנט 338,265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-chloro-2,4-dinitrobenzene Sigma-Aldrich 237329
Acetic acid Bio Lab 01070521
Acetnitrile J.T.Baker 9017-03
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
Copper(II) Sulfate pentahydrate Merck-Millipore 102790
Dimethyl sulfoxide Merck-Millipore 802912
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological Industries 02-023-5A
Ethacrynic acid Tokyo Chemical Industry Co. Ltd E0526
Glutathione-s-transferase M1-1 Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
JS-K Sigma-Aldrich J4137
L-glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251
Magnesium Chloride J.T.Baker 0162
nitrate/nitrite colorimetric assay kit Cayman Chemical 780001
Oligonucleotides W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University custom order
PDGF-BB Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
TBTA Sigma-Aldrich 678937
Triethylamine Sigma-Aldrich T0886
Desalting column GE Healthcare illustra MicroSpin G-25 Columns
HPLC Waters  2695 separation module
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm)
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 10 mm × 50 mm)
Plate reader BioTek synergy H4 hybrid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
  2. Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
  3. Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment. Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).
  4. Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer. J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).
  5. Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One. ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).
  6. Rutkowska, A., Schultz, C. Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).
  7. Meyer, C., Köhn, M. A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).
  8. Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction. Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).
  9. DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).
  10. Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).
  11. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).
  12. Diezmann, F., Seitz, O. DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology. Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).
  13. Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).
  14. Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity. ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).
  15. Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability. J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).
  16. Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins. J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).
  17. Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).
  18. Han, D., et al. A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).
  19. Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).
  20. Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).
  21. Franzini, R. M., et al. Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).
  22. Unger-Angel, L., et al. Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes. Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).
  23. Nissinkorn, Y., et al. Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors. Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).
  24. Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers. Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).
  25. Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors. Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).
  26. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. , 1-16 (2013).

Tags

ביוכימיה גיליון 115 הולך אותות מלאכותיים שחרור תרופות ממוקד כימית biomimetic קולטני חלבון סינטטי וביולוגיה כימית קולטני חלבון מבוסס DNA קלסרים חלבון להחלפה
מחק את תפקודם של חלבוני איתות: לקראת תרפים התמר איתותים מלאכותיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peri-Naor, R., Motiei, L.,… More

Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54396, doi:10.3791/54396 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter