Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Efterligning af funktion signalproteiner: Mod Artificial Signal transduktion Therapy

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

Introduction

Signaltransduktionsveje spiller en væsentlig rolle i næsten alle cellulær proces og tillade cellen kan reagere hurtigt på miljømæssige signaler. 1 Disse veje er ofte udløses ved binding af et signalmolekyle til en ekstracellulær receptor, hvilket resulterer i aktivering af intracellulære enzymer. Amplifikation og formering af dette signal i cellen medieres af funktionen af ​​signalering proteiner, der danner et netværk af protein-protein-interaktioner, hvor enzymer er reversibelt aktiveres med høj specificitet. Fordi dysregulering af disse netværk ofte fører til udvikling af cancer, har der været megen interesse for at etablere 'signaltransduktion terapi af cancer', 2, hvorved lægemidler er designet til at forstyrre maligne signalveje. Vi har for nylig foreslået en alternativ tilgang til signaltransduktion terapi, der er afhængig af lægemidlers evne til at generere unaturlige signaltransduktionsveje.

For at demonstrere gennemførligheden af denne fremgangsmåde, har vi for nylig skabt et syntetisk "kemisk transducer» 4, der muliggør blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) at udløse spaltningen af et anticancer prodrug ved at aktivere glutathion-s-transferase (GST), som er ikke sin naturlige bindingspartner. Strukturen af ​​denne "transducer" består af et anti-PDGF DNA aptamer, som er modificeret med en bivalent hæmmer til GST. Derfor har dette syntetiske middel tilhører en familie af molekyler med bindingssteder tilforskellige proteiner, 5-7 såsom kemiske inducere af dimerisering (kunde-id'er) 8-10 og også til gruppen af protein-bindere baseret på oligonucleotid-syntetisk molekylekonjugater. 11-21

De generelle principper ligger til grund for udformningen af ​​sådanne systemer er beskrevet heri og detaljerede protokoller til syntese og teste funktionen af ​​denne "transducer" med konventionelle enzymatiske assays leveres. Dette arbejde skal lette udvikle yderligere "transducere« i denne klasse, som kan anvendes til at mediere intracellulær protein-protein-kommunikation og dermed til at inducere kunstige celle signalveje.

Figur 1 beskriver skematisk funktionsprincipperne for syntetiske »kemiske transducere ', der kan mægle unaturlige protein-protein-kommunikation. I denne illustration, en 'kemisk transducer ", der integrerer syntetiske bindemidler til proteins I og II (bindemidler I og II), gør det muligt for protein II til at udløse den katalytiske aktivitet af protein I, som ikke er dets naturlige bindingspartner. I fravær af protein II, transduceren binder det katalytiske sted i enzymet (protein I) og inhiberer dets aktivitet (figur 1, stat ii). Bindingen af "transducer" til protein II imidlertid fremmer interaktioner mellem bindemiddel I og overfladen af protein II (Figur 1, state iii), hvilket reducerer dens affinitet mod protein I. Som følge heraf den effektive koncentration af " fri "transducer i opløsningen reduceres, hvilket fører til dissociation af transduceren-protein-i-kompleks og til reaktivering af protein i (figur 1, tilstand iv). Tilsammen disse trin fremhæve tre grundlæggende principper bag udformningen af ​​effektive 'transducere «: (1) en" transducer "bør have en specifik bindemiddel for hver af de protein-targets, (2) samspillet betweOr bindemiddel II og protein II bør være stærkere end vekselvirkningen mellem bindemiddel I og protein I, og (3) bindemiddel jeg skal kunne interagere med overfladen af ​​proteinet II. Denne sidste princip kræver ikke nødvendigvis, at bindemiddel jeg alene ville have en høj affinitet og selektivitet mod protein II. I stedet er den baseret på vores nylige undersøgelser, som viste, at vil kunne fremme interaktioner mellem dette molekyle og overfladen af proteinet bringe en syntetisk molekyle i nærhed til et protein. 19,22,23

figur 1

Figur 1:. Betjening principper for »kemiske transducere" Når "kemisk transducer« tilføjes til et aktivt protein I (tilstand i), det binder sig til sin aktive site gennem bindemiddel I og hæmmer dets aktivitet (state ii). I nærvær af protein II, men den ubundne "kemisk transducer 'interagerer med protein II gennem bindemiddel II, der fremmer interaktioner mellem bindemiddel I og overfladen af ​​proteinet II. Denne inducerede binder I-protein II interaktion reducerer den effektive koncentration af bindemiddel I, som fører til dissociation af 'transducer'-protein I kompleks og til protein I reaktivering (state iv). Klik her for at se en større version af dette tal .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntese af den "Chemical Transducer '

  1. Foreløbige Forberedelser
    1. Forbered 2 M triethylammoniumacetat (TEAA) puffer ved blanding 278 ml triethylamin med 114 ml eddikesyre og 400 ml ultrarent vand. PH justeres til 7 og tilsæt vand til et endeligt volumen på 1 L. Opbevar det i en mørk flaske.
      Bemærk: Denne opløsning er stabil i år.
    2. Der fremstilles en 5 mM ascorbinsyre-opløsning ved opløsning af 18 mg af ascorbinsyre i 20 ml ultrarent vand. Brug en frisk opløsning; løsningen er stabil i en dag.
    3. Der fremstilles en 10 mM Cu (II) / Tris (benzyltriazolylmethyl) amin (TBTA) opløsning ved opløsning 25 mg kobber (II) sulfat, pentahydrat i 10 ml ultrarent vand og 58 mg TBTA i 11 ml dimethylsulfoxid (DMSO). Bland de to løsninger. Hold det ved stuetemperatur og beskytte det mod lys.
  2. konjugation Procedure
    1. Opløs 100 nmol af det modificerede oligonukleotid (ODN-1) i 80 piaf frisk ultrarent vand. Tilsæt 20 pi 2 M TEAA, pH = 7. Tilsæt 80 pi af en frisk fremstillet opløsning af ascorbinsyre (5 mM i vand).
    2. Opløs 1,5 pmol (574,5 mg) af azido-modificeret ethacrynsyre i 180 pi DMSO og føje den til løsningen. Opløsningen afgasses med argon i 60 sek og hurtigt at tilføje 40 pi fra Cu (II) / TBTA opløsning (10 mM i 55% (v / v) DMSO / vand).
    3. Rense igen med argon, lukkes tæt, og der omrøres natten over.
    4. Overvåge udviklingen af ​​reaktionen og oprense konjugatet ved RP-HPLC (mobil fase: A) 5% acetonitril, 5% TEAA, 90% ultrarent vand; B) 65% acetonitril, 5% TEAA, 30% ultrarent vand). 24

2. Styring GST aktivitet af PDGF

  1. Foreløbige Forberedelser
    1. Forbered 50 ml Assay buffer ved at blande 33,9 ml phosphatbufret saltvand (PBSx1) med 16,1 ml ultrarent vand for at opnå en 8 mM endelig phosphatkoncentration og add 23,8 mg MgCl2 for at opnå en 5 mM slutkoncentration.
    2. Der fremstilles en stamopløsning af GST M1-1 ved at opløse proteinet i en buffer indeholdende 50 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol (DTT), og 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) til en slutkoncentration på 30 uM. Divider denne løsning i små portioner og opbevares ved -80 ˚C. Fortynd frisk, efter § 2.1.5.1, i Assay buffer og holde på is.
      Bemærk: Opløsningen vil være stabil i ca. 5 timer, eller indtil der er en reduktion i enzymaktivitet.
    3. Forbered underlaget efter følgende anvisninger:
      1. Opløs 10 mg af reduceret glutathion (GSH) i 325 pi ultrarent vand til en slutkoncentration på 100 mM stamopløsning. Fortynd 21 pi fra denne stamopløsning i 979 pi assay buffer til en slutkoncentration på 2,1 mM arbejdsopløsning.
      2. Opløs 10 mg 2,4-dinitrochlorbenzen (CDNB) i 492 ul ethanol til en slutkoncentration på 100 mM stamopløsning. Fortynd 43,2 pi fra stamopløsning i 956.8 pi af en assay-buffer til en slutkoncentration på 4,32 mM arbejdsopløsning.
    4. I en 96-brønds plade, sætte hvert substrat i en særskilt linje (12 brønde). Indsæt mindst 60 pi i hver brønd for at tillade hurtig og nem tilbagetrækning af løsningen. Dæk pladen med en aluminiumsplade til let beskyttelse.
    5. Forbered følgende stamopløsninger i assaypufferen:
      1. Fortynd GST M1-1 med 50 til en slutkoncentration på 0,6 uM af dimeren.
      2. Fortynd den "kemiske transducer" til en 30 uM stamopløsning.
      3. Fortynd PDGF til en slutkoncentration på 40 uM.
      4. Fortynd PDGF aptamer til en slutkoncentration på 250 uM.
  2. Mål GST aktivitet i tilstedeværelse af "kemisk transducer" og PDGF.
    1. Opsæt en eksperimentel procedure in pladen læser til kinetisk måling.
      1. Opret et nyt eksperiment som en "standard-protokol«.
      2. Tryk på "forsøg" for at åbne vinduet procedure indstillinger.
      3. I pop op-listen på oversiden af ​​vinduet, skal du vælge '384 plade' type i henhold til pladen producenten.
      4. Tryk på 'Læs' på menuen til venstre.
      5. Med hensyn påvisningsmetoden vælg 'Absorbans «.
      6. Med hensyn til læse typen vælg 'End point'.
      7. Skriv 340 nm af bølgelængden vinduet.
      8. Tryk på 'Full plade' bund på den øverste højre side og vælge brønden skal måles.
      9. Tryk på 'OK' for at lukke "Læs" vinduet.
      10. Vælg 'starte kinetisk' på menuen til venstre.
      11. Gør køretid 10 min.
      12. Vælg indstillingen minimum intervaller.
      13. Tryk på 'OK' for at lukke den kinetiske vinduet.
      14. Træk 'Read' line into den kinetiske måling.
      15. Tryk på knappen 'Godkend' og derefter 'ok' knappen.
      16. Gem eksperimentet.
      17. Tryk på knappen "play". En dialog vises - tryk kun 'ok' knappen, når målingen skal startes.
    2. For at kunne udføre den tredobbelte forsøg forberede fire prøver hver indeholder 3,25 pi af den "kemiske transducer" og 3,25 pi GST M1-1. Tilføj til hver prøve 0, 1,2, 2,4, eller 4,9 pi PDGF og 123,5, 122,3, 121,1, 118,6 eller pi af Assaypuffer hhv.
    3. Inkuber opløsningen ved stuetemperatur i 10 min.
    4. I en 384-transparent plade med, indsætte 40 pi prøve til hver brønd. Sæt prøverne kun i de ulige brønde eller kun på de lige brønde i samme linje for at tillade brug af et multi-pipette til substrat tilsætning.
    5. Ved hjælp af en 12-kanals multi-pipette, hurtigt tilføje 10 pi fra hver af than substrater, der blev allerede forberedt i 96-brønds plade (afsnit 2.1.4). Bland forsigtigt og hurtigt for at undgå bobler. Sæt pladen i læseren og start kinetisk måling. Da GST kinetik er ganske hurtig, forsøge at minimere tiden mellem substratet tilsætning og begyndelsen af ​​den kinetiske måling.
  3. GST Aktivering / Hæmning Cycles medieret af 'kemisk transducer «.
    1. For at kunne udføre den tredobbelte forsøg forberede 5 prøver hver indeholder 84,5 pi assay buffer, 3,25 pi »kemisk transducer", og 3,25 pi GST M1-1. Der inkuberes ved stuetemperatur i 3 min.
    2. Tilføj 3,65 pi assay buffer til prøve 1 og 3,65 pi PDGF til prøverne 2-5. Der inkuberes ved stuetemperatur i 3 min.
    3. Tilføj 3.12 pi Assay buffer til prøverne 1-2 og 3,12 pi PDGF aptamer til prøverne 3-5. Der inkuberes ved stuetemperatur i 3 min.
    4. Tilføj 24.4 pi assay buffer til prøver1-3 og 24,4 pi PDGF til prøverne 4-5. Der inkuberes ved stuetemperatur i 3 min.
    5. Tilføj 7,8 pi assay buffer til prøverne 1-4 og 7,8 pi PDGF aptamer til prøve 5. Der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
    6. I en 384-transparent plade med, indsætte 40 pi prøve i hver brønd. Indsæt prøver kun i det ulige eller kun i de lige brønde i samme linje.
    7. Ved hjælp af en 12-kanals multi-pipette, hurtigt tilsættes 10 ul fra hvert substrat (præ-fremstillet på plade med 96 brønde). Bland forsigtigt og hurtigt for at undgå bobler. Sæt pladen i læseren og start kinetisk måling.
    8. Beregn V 0 [mOD / min] under hver betingelse ved at subtrahere OD målt ved 340 nm ved t = 0,5 min fra OD målt ved 340 nm ved t = 1,5 min for at vurdere aktivering / hæmning genanvendelighed. 25
  4. Vurdere Real-time reaktion af "kemisk transducer" til ændringer i miljøet.
      <li> Real-time effekt af PDGF tilføjelse
      1. Opsæt en eksperimentel procedure i pladen læser til kinetisk måling.
      2. Gentag trin 2.2.1.1-2.2.1.10.
      3. Gør driftstid 3,5 min.
      4. Vælg indstillingen minimum intervaller.
      5. Tryk på 'OK' for at lukke den kinetiske vinduet.
      6. Træk 'Read' linje i den kinetiske måling.
      7. Vælg Plate Out / In i menuen til venstre.
      8. Vælg indstillingen 'plade ud (ingen dialog) «.
      9. Vælg »Forsinkelse« indstilling i menuen til venstre og indtast 30 sek.
      10. Vælg Plate Out / In i menuen til venstre.
      11. Vælg indstillingen 'plade i (ingen dialog) «.
      12. Opret en anden kinetisk måling ved at gentage trin 2.2.1.4 - 2.2.1.14, men i afsnit 2.2.1.11 indstille kinetiske at være 25 min i stedet for 10 min.
      13. Tryk på knappen 'Godkend' og derefter 'ok' knappen.
      14. Gem eksperimentet.
      15. Tryk på 'play 'knappen. En dialog vises - tryk kun 'ok' knappen, når målingen skal startes.
      16. Forbered to prøver ved at blande 1 pi GST M1-1 og 1 ul af 'kemiske transducer "i 38 ul Assay buffer. Sæt prøverne i to brønde i en 384-transparent brønde, efterlader en tom brønd mellem disse to brønde.
      17. Ved hjælp af en 12-kanals multi-pipette, hurtigt tilføje 10 ul fra hvert substrat, bland forsigtigt og hurtigt for at undgå bobler, indsætte pladen i læseren og start kinetisk måling.
      18. Når pladen åbner (efter 3,5 min), hurtigt tilføje 1.125 pi PDGF til en af brøndene, blandes forsigtigt, og lad pladen for at lukke op for de resterende kinetiske målinger.
    1. Real-time virkningen af ​​tilsætning PDGF aptamer
      1. Gentag trin 2.4.1.1-2.4.1.15.
      2. Forbered to prøver ved at blande 1 pi GST M1-1, 1 ul af 'kemisk transducer "og 1,125 pi PDGF i 36,9 pi assay buffer. Sæt prøverne i to brønde i en 384-transparent brønde, efterlader en tom brønd mellem disse to brønde.
      3. Ved hjælp af en 12-kanals multi-pipette, hurtigt tilføje 10 ul fra hvert substrat, bland forsigtigt og hurtigt for at undgå bobler, indsætte pladen i læseren, og starte den kinetiske måling.
      4. Når pladen åbner (efter 1,5 min), hurtigt tilføje 1,2 pi PDGF aptamer til en af brøndene, blandes forsigtigt og så pladen tæt op for de resterende kinetiske målinger.
  5. Mål JS-K prodrugaktivering af GST i overværelse af den "kemiske transducer" og PDGF.
    1. Opsæt en eksperimentel procedure i pladen læser til kinetisk måling.
      1. Opret et nyt eksperiment som en "standard-protokol«.
      2. Tryk på "forsøg" for at åbne vinduet procedure indstillinger.
      3. I pop op-listen på oversiden af ​​vinduet vælge "384 plade 'type i henhold til pladen producenten.
      4. Tryk på 'Læs' på menuen til venstre.
      5. Vedrørende påvisningsmetoden valgte »Absorbans«.
      6. Med hensyn til læse typen vælg 'End point'.
      7. Skriv 305 nm af bølgelængden vinduet.
      8. Tryk på 'Full plade' knappen øverst til højre og vælg brønden skal måles.
      9. Tryk på 'OK' for at lukke "Læs" vinduet.
      10. Vælg 'starte kinetisk' på menuen til venstre.
      11. Gør køretid 10 min.
      12. Vælg indstillingen minimum intervaller.
      13. Tryk på 'OK' for at lukke den kinetiske vinduet.
      14. Træk 'Read' linje i den kinetiske måling.
      15. Tryk på knappen 'Godkend' og derefter 'ok' knappen.
      16. Gem eksperimentet.
      17. Tryk på knappen "play". En dialogboks box vises - tryk kun 'ok' knappen, når målingen skal startes.
    2. For NO produktionen benyttes et nitrit / nitrat kalorimetriske kit. I en 96-brønds plade indsætte 50 pi assaypuffer i én række, 70 pi Griess jeg reagens i en anden række, og 70 pi Griess II reagens i en tredje række.
    3. For at kunne udføre den tredobbelte forsøg forberede fire prøver hver indeholdende 4,8 pi af "kemisk transducer". For at prøve en, tilsættes 155,2 ul Assay buffer; prøve 2, sættes 3,2 pi GST-M1-1 og 152 pi assay buffer; prøve 3, tilsættes 9,6 pi PDGF og 145,6 pi assay buffer; og prøve 4, sættes 3,2 pi GST-M1-1, 9,6 pi PDGF og 142,4 pi assay buffer.
    4. Inkuber opløsningen ved stuetemperatur i 10 min.
    5. I en 384-transparent plade med, indsætte 50 pi prøve i hver brønd. Indsæt prøver kun i ulige eller kun iselv brønde i den samme linje til at tillade anvendelse af en multi-pipette til substratet tilsætning.
    6. Tilføj 0,54 pi JS-K (5 mM i DMSO) til hver brønd.
    7. Ved hjælp af en 12-kanals multi-pipette, hurtigt tilsættes 10 pi fra GSH-opløsning (præ-fremstillet på plade med 96 brønde), bland forsigtigt og hurtigt at undgå bobler. Sæt pladen i læseren og start kinetisk måling.
    8. Umiddelbart efter den kinetiske måling, under anvendelse af en 12-kanals multi-pipette, tage 50 pi fra hver prøve i assaybuffer række i forberedte plade med 96 brønde og hurtigt at tilføje til det 50 pi Griess I reagens og 50 pi Griess II reagens. Inkuber samtidig beskytte mod lys i 10 minutter ved stuetemperatur, og absorbansen måles ved 550 nm.
      Bemærk: assaypuffer og reagenser mængder er afhængige af sættene 'protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Udformningen, syntese, og virkningsmekanismen af en "kemisk transducer", som kan inducere kunstig kommunikation mellem PDGF og GST er vist i figur 2. Strukturen af den "transducer" integrerer en PDGF DNA aptamer og et bis-ethacrynsyre amid (BEA ), som er et kendt GST-inhibitor (figur 2a). 19 Disse bindemidler aktivere "transducer" til at binde både PDGF og GST med forskellige affiniteter, nemlig, med dissociationskonstanter (Kd 's) fra 26 nM og 144 nM . 4 Endvidere ifølge dette motiv, bindingen til PDGF bør inducere ikke-specifikke interaktioner mellem BEA enhed og overfladen af PDGF, som markant vil reducere styrken af BEA inhibitor. 19,22,23 Figur 2b illustrerer betjeningsmekanisme bag denne ordning. Efter tilsætning af "transducer" til en aktiv GST, dento EA-enheder samtidigt binder begge aktive steder af denne dimerisk enzym og hæmme dets aktivitet. Ved tilstedeværelse af PDGF imidlertid en PDGF-'transducer 'kompleks dannet, som forhindrer BEA enheden fra at hæmme GST. Det medfører dissociation af GST-'transducer "kompleks og til GST reaktivering. GST kan derefter igen hæmmes ved at tilføje en umodificeret PDGF aptamer der forskyder "kemisk transducer", og gør det muligt at hæmme GST igen.

Evnen af ​​PDGF til at styre GST-aktivitet blev først påvist ved måling GST (10 nM) aktivitet med og uden "kemisk transducer" (500 nM) og måling af aktiviteten af ​​GST-'chemical transducer "kompleks i nærvær af forskellige koncentrationer PDGF (250, 500, og 1000 nM) (figur 3a). Efter at have konstateret, at den "kemiske transducer" inducerer kunstige PDGF-GST kommunikation, vinæste fastslået, at denne kunstige meddelelse, der ligner signaltransduktionstrinene, er også reversible og hurtigt tilpasser sig ændringer i miljøet. Reversibel aktivering / inhibering af GST blev udført ved sekventielle tilsætninger af PDGF og umodificeret PDGF aptamer til GST-'chemical transducer 'kompleks (figur 3b). Svaret fra systemet til realtid ændringer i sine omgivelser blev vurderet ved at måle GST aktivitet samtidig med at tilføje de forskellige indgange. En hurtig stigning i GST-aktivitet blev observeret efter tilsætningen af PDGF (750 nM) til GST-'transducer 'kompleks (10 nM og 500 nM) 3,5 minutter efter tilsætning substrater (figur 4a). Tilsvarende blev et fald i GST-aktivitet observeret efter tilsætningen af PDGF aptamer (5 uM) til en blanding af GST (10 nM), PDGF (750 nM), og "kemisk transducer" (500 nM) (figur 4b).

Finally, vi demonstreret evne af et sådant system til at styre prodrugaktivering som reaktion på ændringer i miljøet. JS-K er et anticancer prodrug aktiveres af GST at frigive giftige NO (figur 5a). Mængden af NO frigjort ved tilsætning af JS-K (45 uM) til »kemisk transducer" (750 nM) og forskellige kombinationer af GST (10 nM) og PDGF (2 uM) blev målt (figur 5b), hvilket således bekræfter at kun tilstedeværelsen af ​​både GST og PDGF vil resultere i prodrug-aktivering.

Figur 2
Figur 2. 'Kemisk transducer. «- Syntese og drift mekanisme (a) Det» kemiske transducer "er sammensat af en PDGF aptamer, en bivalent ethacrynsyre amid (EA) GST-hæmmer, en fluorofor (FAM), og en slukker (Dabcyl) . Denne aptamer-inhibitor-konjugatsyntetiseres ved at binde en azid-modificeret ethacrynsyre amid (EA) derivat til en dialkyne-modificeret og fluorescensmærket DNA aptamer (ODN-1). Re-trykt med tilladelse fra henvisning 4. (B) Den enzymatiske aktivitet af GST inhiberes af »kemisk transducer ', grundet bindingen af EA grupper ved enzymets aktive steder. Tilsætning af PDGF fører til dannelsen af ​​PDGF-'chemical transducer 'kompleks, som bringer forstyrrelse i »transducer'-GST-interaktion, derfor genoprette den enzymatiske aktivitet. Følgende tilsætning af en umodificeret PDGF aptamer frigiver "kemisk transducer", og gør det muligt at re-hæmme enzymet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Fi. gur 3: PDGF-kontrolleret GST-aktivitet (a) GST (10 nM) enzymatisk aktivitet i nærvær (-) og fravær (-) af "kemiske transducer" (500 nM), og i nærvær af den "kemiske transducer '(500 nM) med stigende koncentrationer (250, 500 eller 1000 nM) på PDGF (---). (B) Inhibering-aktivering cyklusser af GST enzymatisk aktivitet manifesterer sig ved ændringer i den oprindelige hastighed (V 0) som reaktion på sekventielle tilsætninger (IIV) af PDGF og umodificeret PDGF aptamer til GST-'chemical transducer 'kompleks: (I) ingen, (II) PDGF (750 nM), (III) PDGF aptamer (4 uM), (IV ) PDGF (5 uM), og (V) PDGF aptamer (10 uM). Grafen viser middelværdien ± STDAFV af triplikater. Re-trykt med tilladelse fra henvisning 4. Klik her for at se et større version af denne figur.

Figur 4
. Figur 4: Real-time kontrol af GST-aktivitet (a) forbedring af GST enzymatisk aktivitet detekteres umiddelbart efter tilsætning af 750 nM PDGF (-) til en opløsning indeholdende GST (10 nM) og "kemisk transducer" (500 nM) ( -) ved t = 3,5 min. (B) Tilsætning af et umodificeret PDGF aptamer (5 uM) (-) til en opløsning indeholdende GST (10 nM), PDGF (750 nM), og "kemisk transducer" (500 nM) (-) ved t = 1,5 min medfører umiddelbart fald i den enzymatiske reaktionshastighed. Re-trykt med tilladelse fra henvisning 4. Klik her for at se en større version af dette tal.

5 "src =" / files / ftp_upload / 54.396 / 54396fig5.jpg "/>
Figur 5:. Controlled prodrugaktivering (a) GST aktivering af JS-K prodrug at frigive giftige NO. (B) NO frigivelse i tilstedeværelse af "kemisk transducer" og forskellige kombinationer af GST (10 nM) og PDGF (2 uM). Grafen viser middelværdien ± STDAFV af triplikater. Ændret med tilladelse fra henvisning 4. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Minerva Foundation, HFSP Organization, og et europæisk forskningsråd Grant (Starting Grant 338.265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-chloro-2,4-dinitrobenzene Sigma-Aldrich 237329
Acetic acid Bio Lab 01070521
Acetnitrile J.T.Baker 9017-03
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
Copper(II) Sulfate pentahydrate Merck-Millipore 102790
Dimethyl sulfoxide Merck-Millipore 802912
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological Industries 02-023-5A
Ethacrynic acid Tokyo Chemical Industry Co. Ltd E0526
Glutathione-s-transferase M1-1 Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
JS-K Sigma-Aldrich J4137
L-glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251
Magnesium Chloride J.T.Baker 0162
nitrate/nitrite colorimetric assay kit Cayman Chemical 780001
Oligonucleotides W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University custom order
PDGF-BB Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
TBTA Sigma-Aldrich 678937
Triethylamine Sigma-Aldrich T0886
Desalting column GE Healthcare illustra MicroSpin G-25 Columns
HPLC Waters  2695 separation module
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm)
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 10 mm × 50 mm)
Plate reader BioTek synergy H4 hybrid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
  2. Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
  3. Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment. Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).
  4. Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer. J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).
  5. Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One. ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).
  6. Rutkowska, A., Schultz, C. Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).
  7. Meyer, C., Köhn, M. A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).
  8. Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction. Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).
  9. DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).
  10. Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).
  11. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).
  12. Diezmann, F., Seitz, O. DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology. Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).
  13. Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).
  14. Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity. ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).
  15. Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability. J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).
  16. Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins. J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).
  17. Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).
  18. Han, D., et al. A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).
  19. Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).
  20. Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).
  21. Franzini, R. M., et al. Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).
  22. Unger-Angel, L., et al. Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes. Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).
  23. Nissinkorn, Y., et al. Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors. Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).
  24. Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers. Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).
  25. Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors. Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).
  26. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. , 1-16 (2013).

Tags

Biochemistry Kunstig signaltransduktion målrettet medikamentfrigivelse biomimetiske kemi syntetisk protein receptorer kemisk biologi DNA-baserede protein-receptorer omstillelig protein bindemidler
Efterligning af funktion signalproteiner: Mod Artificial Signal transduktion Therapy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peri-Naor, R., Motiei, L.,… More

Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54396, doi:10.3791/54396 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter