방법 논문

리트머스 테스트를 사용하여 박테리아의 비색 검출

9.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54546

⸱

2016년 9월 17일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

이 논문에서

요약

RNA 절단 DNAzyme, urease 및 마그네틱 비드를 활용하는 변형 리트머스 테스트를 사용하여 E. coli의 비색 검출 프로토콜을 설명합니다.

초록

현장 진료 또는 현장 적용을 위해 특정 병원체를 검출하는 데 사용할 수 있는 간단하지만 여전히 효과적인 방법에 대한 요구가 증가하고 있습니다. 이러한 방법은 사용자 친화적이어야 하며 전문가와 비전문가 모두가 쉽게 해석할 수 있는 신뢰할 수 있는 결과를 생성해야 합니다. pH에 대한 리트머스 테스트는 간단한 색상 변화를 통해 테스트 샘플의 pH를 보고하기 때문에 간단하고 빠르며 효과적입니다. 당사는 박테리아 검출을 위한 리트머스 테스트를 활용하기 위한 접근 방식을 개발했습니다. 이 방법은 박테리아 특이적 RNA 절단 DNAzyme을 활용하여 관심 박테리아를 인식하고 우레아제의 활성을 제어하는 메커니즘을 제공하는 두 가지 기능을 수행합니다. DNAzyme-urease 접합체로 고정된 마그네틱 비드를 사용하여 테스트 샘플에 있는 박테리아의 존재는 비드에서 용액으로의 urease 방출로 전달됩니다. 방출된 우레아제는 테스트 용액으로 옮겨져 요소를 암모니아로 가수분해하여 고전적인 리트머스 테스트를 사용하여 시각화할 수 있는 pH 증가를 초래합니다.

서론

세균 병원체는 전 세계 이환율과 폐사의 주요 원인 중 하나입니다. 병원 감염, 식품 매개 병원균 및 환경 내 박테리아 오염 물질로 인한 발병은 공중 보건 및 안전에 심각하고 지속적인 위협을 가하고 있습니다. 이러한 발병을 예방하려면 다양한 환경에서 적시에 병원체를 검출할 수 있는 효과적인 도구가 필요합니다. 간단하지만 여전히 효과적인 검사는 휴대가 간편하고 비용 효율적이며, 특히 발병에 취약하지만 값비싼 검사 시설을 감당할 수 없는 지역에서 매우 탐납니다. 1-3 박테리아를 검출하는 방법은 다양하지만 그 중 대부분은 긴 테스트 시간, 값비싼 장비 및 복잡한 테스트 절차가 필요하기 때문에 스크리닝 또는 현장 테스트 도구로 적합하지 않습니다.

색계 테스트는 육안으로 색상 변화를 쉽게 감지할 수 있기 때문에 현장 진료 또는 현장 응용 분야에 특히 매력적입니다. pH에 대한 리트머스 테스트는 간단하고 빠르며 효과적입니다. 매우 오래된 기술이지만 단순성과 효율성으로 인해 오늘날에도 여전히 널리 사용되고 있습니다. 놀랍게도, 이 간단한 검사는 최근에 대장균 검사를 위해 이 검사를 수정하는 접근 방식을 개발하기 전까지 다른 분석물을 검출하기 위해 수정한 적이 없었습니다. 4

개

대장균에 대한 확장된 리트머스 테스트는 대장균 활성화 RNA 절단 DNAzyme(EC1), 5 우레아제 및 마그네틱 비드의 세 가지 추가 구성 요소를 사용합니다. DNAzymes는 촉매 활성을 가진 합성 단일 가닥 DNA 분자를 나타냅니다. 6 그들은 시험관 내 선택을 사용하여 무작위 서열 DNA 풀에서 분리할 수 있습니다. 7,8 이들은 매우 안정적이며 고효율 자동 DNA 합성을 사용하여 비용 효율적으로 생산할 수 있습니다. 9 이러한 이유로, DNAzymes, 특히 RNA-cleaving DNAzymes는 바이오센싱 응용을 위해 널리 연구되어 왔습니다. 6,10,11 RNA 절단 DNAzyme 센서는 금속 이온, 12-16 개의 소분자, 17,18 개의 박테리아 병원체5,19-21 및 암 세포를 감지하기 위해 개발되었습니다. 22 표적 유도 RNA 절단 DNAzymes의 가용성이 높다는 점을 감안할 때, DNAzyme을 활용하는 모든 분석은 잠재적으로 다양한 분석물을 검출하도록 확장될 수 있습니다.

Urease는 요소를 암모니아로 가수분해하는 능력 때문에 선택되며,23,24 pH 증가를 초래합니다. Urease는 또한 매우 효율적이고 안정적이며 다른 생체 분자와의 접합에 적합합니다. 따라서, 우리는 RNA-cleavage DNAzyme과 urease의 접합체가 다른 표적의 검출을 위해 리트머스 테스트를 사용할 수 있다고 가정했습니다. 5

개

RNA 절단 DNAzyme의 작용은 DNAzyme-urease 접합체로 고정되는 자성 비드를 사용하여 urease-mediated pH 증가로 전달됩니다. 조사 중인 DNAzyme의 활성은 E. coli에 엄격하게 의존하기 때문에 테스트 용액에 이 박테리아가 존재하면 자성 비드에서 용액으로 우레아제가 방출된 다음 pH에 민감한 염료가 포함된 리포터 용액에서 요소를 가수분해하는 데 사용됩니다. 이 절차의 최종 결과는 염료 또는 pH 종이에 의해 편리하게 보고될 수 있는 색상 변화입니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 시약 및 완충액 준비

  1. 0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)
    1. 2L 비커에 탈이온수 800ml(ddH2O)에 186.1g의 EDTA를 추가합니다. NaOH 펠릿을 사용하여 용액의 pH를 8.0으로 조정하십시오. 최종 부피 1.0 L에 ddH2O를 첨가하고 용액을 오토클레이브 가능한 유리병에 옮겨 오토클레이빙 및 4°C에서 보관합니다.
  2. 10× 트리스-보레이트 EDTA(10x TBE)
    1. 4L 플라스틱 비커에 트리스 염기 432g, 붕산 200g, 0.5M EDTA(pH 8.0) 80ml 및 ddH2O를 4L의 최종 부피에 추가합니다. 모든 성분이 용해될 때까지 교반 막대를 사용하여 혼합합니다. 고압증기멸균을 위해 용액을 1L 유리병에 옮기고 4°C에서 보관합니다.
  3. 10% 변성 폴리아크릴아미드 주식
    1. 4L 플라스틱 비커에 요소 1681.7g, 400ml 10x TBE, 40% 아크릴아미드/비스아크릴아미드(29:1) 용액 1L, ddH2O를 최종 부피가 4L가 될 때까지 추가합니다. 요소가 용해될 때까지 교반 막대를 사용하여 혼합합니다. 용액을 1L 호박색 유리병에 옮기고 4°C에서 보관합니다.
  4. 2x 겔 로딩 버퍼(2x GLB)
    1. 200ml 유리 비커에 요소 44g, 자당 8g, 브로모페놀 블루 10mg, 자일렌 시아놀 FF 10mg, 10% 도데실황산나트륨 400μl, 10×TBE 4ml를 추가합니다. 최종 부피 40ml에 ddH2O를 첨가하고 마그네틱 교반 막대로 혼합하면서 50 ° C에서 약한 가열로 성분을 용해시킵니다. 1ml 부분 표본을 1.5ml 마이크로분리 튜브에 옮기고 4°C에서 보관합니다.
      알림: 사용하기 전에 고형물을 다시 용해시키기 위해 90°C에서 잠시 가열해야 합니다.
  5. 1M 트리스 - 하이드로 클로라이드 (Tris-HCl) (pH 7.5)
    1. 유리병에 트리스 베이스 12.1g과 ddH2O70ml를 넣고 고체가 녹을 때까지 섞습니다. 1M 염산(HCl)을 사용하여 pH를 7.5로 조정합니다. 최종 부피 100ml에 ddH2O를 첨가하고 오토클레이브를 사용하여 4°C에서 보관합니다.
  6. 5M 염화나트륨(NaCl)
    1. 유리 병에 NaCl 58.4g을 ddH2O 150ml에 녹입니다. ddH2O로 부피를 200ml로 조정합니다. 4 ° C에서 보관하십시오.
  7. DNA 용리 완충액
    1. 유리 병에 2.0ml의 1M Tris-HCl (pH 7.5), 8.0ml의 5M NaCl 및 0.4ml의 0.5M EDTA (pH 8.0)를 혼합합니다. ddH2O로 부피를 200ml로 조정하고 오토클레이브하여 4 °C에서 보관하십시오.
  8. 1 M 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) (pH 7.4)
    1. 유리 병에 2.38g의 HEPES를 80ml의 ddH2O에 용해시키고 5 N NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정하고 ddH2O를 100ml의 최종 부피에 첨가합니다.
  9. 1m 염화마그네슘(MgCl2)
    1. 유리병에 MgCl2-6H 2O 2.03g을 넣고 ddH2O로 부피를 100ml로 가져옵니다.
  10. 반응 버퍼(RB)
    1. 50ml 원뿔형 튜브에 1M HEPES 50μl(pH 7.4), 5M NaCl 1.5ml, 1M MgCl2 0.75ml 및 Tween-20 5μl를 추가합니다. 최종 부피 50ml에 ddH2O를 추가합니다. 주사기 구동 필터(0.22μm)를 사용하여 용액과 필터를 다른 원뿔형 튜브에 혼합하고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
  11. 바인딩 버퍼(BB)
    1. 50ml 원추형 튜브에 500 μl의 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 8.8 g의 NaCl, 50 μl의 1 M MgCl2 및 5 μl의 Tween 20을 첨가합니다. 최종 부피 50ml에 ddH2O를 추가합니다. 주사기 구동 필터(0.22μm)를 사용하여 용액과 필터를 다른 원뿔형 튜브에 혼합하고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
  12. 기판 용액 (SS)
    1. 50ml 원뿔형 튜브에 NaCl 5.8g, 1M MgCl2 3ml, 요소 1.5g 및 ddH2O40ml를 추가합니다. 10mM HCl을 사용하여 용액의 pH를 5.0으로 조정합니다. 용액은 완충되지 않기 때문에 작은 HCl 분취액을 추가하여 HCl을 사용하여 pH를 조심스럽게 조정합니다. 최종 부피 50ml에 ddH2O를 추가합니다.
    2. 주사기 구동 필터(0.22μm)를 사용하여 용액과 필터를 다른 원뿔형 튜브에 혼합하고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
  13. Luria Bertani (LB) 육수
    1. 비커에 20.0g LB 분말을 1L의 ddH2O에 녹입니다. 유리병에 옮겨 넣고 오토클레이브한 후 4°C에서 보관합니다.
  14. 1.5% LB 한천
    1. 250ml 플라스크에 한천 1.5g과 LB 육수 100ml를 넣습니다. 오토클레이브 및 4°C에서 보관하십시오.
  15. 한천 접시
    1. LB 한천을 전자레인지에 다시 녹이고 용액을 ~50°C로 냉각합니다. 용액을 페트리 접시에 붓고 ~5개의 접시를 만들고 응고시킵니다.

2. E. coli-responsive DNAzyme EC1의 합성 및 정제

  1. 주형 매개 효소 결찰에 의한 EC1의 합성
    1. 표준 프로토콜에 따라 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(dPAGE)으로 상업적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 BS1, DE1 및 T1(표 1에 제공된 염기서열)을 정제합니다.
    2. BS1, DE1 및 T1의 100μM 스톡을 준비합니다. 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
    3. 1.5 ml 마이크로 분리 튜브에 38.5 μl의 ddH2O, 5 μl의 DE1 및 5 μl의 10x T4 폴리 뉴클레오티드 키나아제 반응 완충액 (500 mM Tris-HCl (pH 7.6), 100 mM MgCl2, 50 mM dithiothreitol (DTT), 1.0 mM spermidine)을 첨가합니다.
    4. 1μl의 아데노신 삼인산(ATP)(100mM)을 추가합니다. T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 5단위(10 U/μl)를 추가합니다. 반응 혼합물을 조심스럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
    5. 37°C에서 30분 동안 반응을 배양합니다.
    6. 90°C로 5분 동안 가열하여 반응을 담금질합니다.
    7. ddH2O 118μl, BS1 5μl, T1 5μl를 추가합니다. 반응을 90°C로 2분 동안 가열한 다음 10분 이상 실온으로 냉각합니다.
    8. 효소 공급 업체가 제공하는 20 μl의 10× T4 DNA 리가제 반응 완충액 (400 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP)를 추가합니다. 10 단위의 T4 DNA 리가제(5 U/μl)를 추가하고 피펫팅으로 조심스럽게 혼합합니다.
    9. 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
    10. 3M 아세트산 나트륨 (NaOAc) 20 μl (pH 5.2), 차가운 100 % 에탄올 500 μl를 첨가합니다. 볼텍싱으로 용액을 혼합하고 튜브를 -20°C 냉동고에 30분 동안 넣습니다.
    11. 마이크로분리를 20,000 x g에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.피펫팅으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
    12. 펠릿을 차가운 70% 에탄올로 세척하고 20,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 다시 한 번 상등액을 제거하고 펠릿을 진공 상태에서 10분 동안 건조시킵니다.
    13. DNA를 15μl의ddH2O로 재현탁시킨 다음 15μl의 2x GLB를 첨가합니다.
    14. 격렬하게 소용돌이를 일으키고 90°C에서 2분 동안 가열합니다. 아래 설명된 대로 full-length DNA를 10% dPAGE로 정제합니다.
  2. 10% dPAGE 설정
    1. 유리판 2개(가득 찬 플레이트 1개와 노치가 있는 플레이트 1개), 0.75mm 두께의 스페이서 2개, 12웰 빗을 청소합니다. 양쪽에 두 개의 스페이서가 있고 상단에 노치가 있는 플레이트가 있는 평평한 표면에 하나의 유리판을 놓습니다. 공급업체에서 제공한 4개의 클립을 사용하여 두 개의 플레이트를 함께 클립합니다.
    2. 150ml 플라스틱 비커에 10% dPAGE 40ml, 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 40μl, 10% 과황산암모늄(APS) 400μl를 붓습니다. 구성 요소를 혼합하고 플레이트 사이에 용액을 천천히 붓습니다.
    3. 빗을 삽입한 다음 젤이 10분 이상 중합되도록 합니다. 겔이 중합되면 천천히 빗을 제거하고 ddH2O로 웰을 플러시합니다.
    4. 플레이트를 겔 전기영동 장치에 장착합니다. 금속판을 사용하여 발생하는 열을 발산하여 과열을 방지하십시오.
    5. 1x TBE를 상단 및 하단 챔버에 붓고 웰이 버퍼에 잘 잠겼는지 확인합니다. 피펫이나 주사기를 사용하여 1x TBE로 웰을 세척합니다.
    6. 장치를 35mA에서 작동하도록 설정하고 s를 로드하기 전에 15분 동안 사전 실행하십시오.amp르.
  3. 10% dPAGE에서 결찰된 EC1의 용출
    1. 2.2.6단계에 따라 하단 염료(브로모페놀 블루)가 유리판 바닥에 도달할 때까지 35mA에서 젤을 실행합니다. 이 작업은 약 1.5시간이 소요됩니다. 전원을 끄고 기기에서 플레이트를 제거하십시오.
    2. 종이 타월 몇 장에 접시를 놓고 유리판에서 스페이서를 조심스럽게 제거합니다. 상단 유리판을 조심스럽게 제거하고 젤을 플라스틱 랩으로 감쌉니다.
    3. 젤을 뒤집어 두 번째 유리판을 제거하고 플라스틱 랩으로 다시 덮습니다. 플라스틱 랩의 주름이 생기지 않도록 주의하십시오.
    4. UV 섀도잉(260nm)을 사용하여 결찰된 산물을 시각화하면 4개의 뚜렷한 DNA 밴드(완전 결찰된 EC1, DE1, BS1 및 T1)가 생성됩니다.
    5. 멸균 면도날로 상단 밴드(EC1)를 절제하고 1.5ml 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 멸균 피펫 팁(200μl 팁 크기)으로 젤이 고운 페이스트로 변할 때까지 젤을 부수십시오. DNA 용출 완충액 550μl를 추가하고, 내장된 형광단을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 15분 동안 흔듭니다.
    6. 겔 용액을 20,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고 400μl의 상등액을 다른 1.5ml 마이크로분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 파이펫팅 중 젤 조각을 빼내지 마십시오.
    7. 옮겨진 상층액이 있는 마이크로분리관에 3M NaOAc(pH 5.2) 40μl와 차가운 100% 에탄올 1.0ml를 추가합니다. 볼텍싱으로 용액을 혼합하고 튜브를 -20°C 냉동고에 30분 동안 넣습니다.
    8. 마이크로분리를 20,000 x g에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.피펫팅으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
    9. 펠릿을 차가운 70% 에탄올로 세척하고 20,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 다시 한 번, 상등액을 제거하고 펠릿을 진공 상태에서 10분 동안 건조시킵니다.
    10. 260nm에서 UV 흡광도를 측정하여 EC1의 농도를 측정합니다. 10μM 스톡을 만들고 사용할 때까지 샘플을 -20°C에서 보관합니다.

3. 우레아제를 DNA에 접합

  1. 숙시니미딜 4-(N-말레미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC) 원료의 준비
    1. 676μl의 DMSO에 1mg SMCC를 용해합니다. 소용돌이치고 사용할 때까지 얼음 위에 두십시오.
  2. Urease 주식의 준비
    1. 1 mg urease를 1 ml의 1× PBS (Mg2+ 또는 Ca2+ 없음)에 녹입니다. 사용할 때까지 얼음 위에 올려 놓습니다.
      참고: 결정화된 우레아제는 용해 속도가 느리고 변성을 피하기 위해 부드러운 혼합이 필요합니다.
  3. Urease-DNA(UrDNA)의 합성
    1. 10μl의 100μM LD1을 2.5ml 마이크로분리관에 추가합니다. 140μl의 ddH2O, 40μl의 10x PBS 및 와류를 추가합니다.
    2. 80.5μl의 SMCC 스톡, 159.5μl의 DMSO, 와류를 추가하고 탁상형 원심분리기를 사용하여 간단히 원심분리합니다.
    3. 37°C에서 60분 동안 배양합니다.마이크로퓨지 캡 아래에 응결이 생기지 않도록 합니다.
    4. 200μl의 1x PBS, 60μl의 3M NaOAc(pH 5.2) 및 1.5ml의 차가운 100% 에탄올을 추가합니다. 볼텍싱으로 용액을 혼합하고 -20 °C에서 30 분 동안 배양합니다.
    5. 용액을 20,000 x g에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고 진공 상태에서 펠릿을 건조시킵니다. 과도한 건조를 피하십시오.
    6. 건조된 펠릿에 우레아즈 스톡 400μl를 넣고 실온에서 5시간 동안 배양합니다.
    7. 200μl의 미가공 접합체를 사전 세척된 100k MWCO 원심 필터 컬럼으로 전달합니다. 14,000 x g에서 5분 동안 컬럼을 원심분리합니다.
    8. 남은 200μl의 미처리 콘주게이트를 컬럼으로 옮기고 14,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 컬럼을 제거하고 새 2.0ml 마이크로분리 튜브("수집 튜브")에 거꾸로 놓습니다.
    9. 수집 튜브(거꾸로 된 컬럼 포함)를 1,000 x g에서 2분 동안 원심분리합니다. 수집 튜브를 제거하고 30μl의 1x PBS를 원심 컬럼에 추가하여 접합체의 추가 회수를 위해 멤브레인을 세척합니다.
    10. 다시 한 번 컬럼을 뒤집어 수집 튜브에 다시 넣습니다. 수집 튜브(거꾸로 된 컬럼 포함)를 1,000 x g에서 2분 동안 원심분리합니다. 열을 제거하고 폐기합니다.
    11. UrDNA는 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.

4. EC1 및 UrDNA를 마그네틱 비드에 조립

  1. 마그네틱 비드(MB) 스톡을 잘 혼합하고 100μl의 MB 현탁액을 1.5ml 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다. MB를 분리하기 위해 마이크로fuge 튜브를 마그네틱 랙 홀더에 놓습니다.
  2. 피펫팅으로 상층액을 제거하고 150μl의 결합 완충액(BB)을 튜브에 추가합니다. 홀더에서 튜브를 제거하고 튜브를 조심스럽게 두드려 MB를 균일한 용액으로 다시 현탁시킵니다. 서스펜션이 튜브나 캡 상단으로 튀지 않도록 하십시오. 이 경우 탁상형 원심분리기를 사용하여 잔류물을 서스펜션으로 잠시 다시 회전시킵니다.
  3. 4.2단계를 두 번 더 반복합니다.
  4. 이 현탁액에 10μL의 10μM EC1을 추가합니다. 튜브를 두드려 조심스럽게 섞습니다.
  5. 30분 동안 가볍게 흔들어 용액을 배양하고 MB의 침전을 피하기 위해 2-3분마다 튜브를 두드립니다.
  6. 마이크로fuge 튜브를 마그네틱 랙에 다시 올려 MB를 분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거합니다. 150μl의 BB로 MB를 세 번 세척합니다(4.2단계에서 설명).
  7. 세척이 완료되면 총 150μl의 BB에 MB를 현탁시킵니다. 이 용액에 15μl의 UrDNA를 넣고 용액을 45°C에서 2분 동안 가열합니다. 용액을 실온으로 식히고 2시간 동안 배양합니다.
  8. 마이크로fuge 튜브를 마그네틱 랙에 다시 올려 MB를 분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거합니다.
  9. 100μl의 반응 완충액(RB)을 추가합니다. 마그네틱 랙에서 마이크로분리 튜브를 제거하고 MB를 조심스럽게 다시 매달아 놓습니다.
  10. 4.9.
    단계를 반복하여 MB를 세 번 더 세척합니다. 참고: 세척된 상등액은 혼성화되지 않은 UrDNA가 여전히 존재하는지 확인하기 위해 신속하게 테스트할 수 있으며, 이로 인해 위양성 신호가 발생할 수 있습니다. 테스트는 세척 용액에 10μl의 50mM 요소와 10μl의 0.04% 페놀 레드를 첨가하여 수행할 수 있습니다. 세척 용액으로 인해 색상이 변하지 않을 때까지 MB를 계속 세탁하십시오. 100μl 현탁액은 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.

5. 세균 세포의 준비20

  1. 주식에서 대장균 배양
    1. 화염 아래 또는 생물 안전 캐비닛에 있는 글리세롤 스톡의 LB 한천 플레이트에 E. coli K12(MG1655) 플레이트를 가열합니다.
    2. 멸균 피펫 팁을 사용하여 글리세롤 스톡을 부드럽게 만지고 한천 플레이트의 표면을 가볍게 줄무늬를 만들어 LB 한천에 구멍이 나지 않도록 합니다.
    3. 줄무늬가 있는 플레이트를 뒤집고 37°C에서 14시간 동안 배양합니다.
    4. 파라필름으로 플레이트를 밀봉하고 최대 3주 동안 4°C에서 보관하십시오.
  2. 세포 계수를 위한 대장균 배양
    1. 멸균 14ml 배양 튜브에 LB 육수 2ml를 분주합니다.
    2. 멸균 피펫 팁을 사용하여 5.1단계에서 준비한 줄무늬 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 배양 튜브로 옮깁니다.
    3. 37°C에서 배양하고 230rpm으로 14시간 동안 흔듭니다.
    4. 박테리아 배양액을 10배 간격으로 연속적으로 희석합니다.
    5. 희석된 각 샘플에 대해 별도의 LB 한천 플레이트에 5개의 100μl 분취량을 균일하게 플레이트합니다. 플레이트를 뒤집고 37°C에서 14시간 동안 배양합니다.
    6. 각 희석액의 평균 세포 농도를 얻기 위해 각 샘플의 세포를 계수합니다.
      참고: 10 7 cells는 이 수준의 E. coli가 빠른 색상 변화를 유발할 수 있으므로 E. coli에 대한 참조 리트머스 테스트를 설정하는 데 자주 사용됩니다. 그러나 적절하게 실행된 리트머스 테스트는 결과 섹션에서 설명한 것처럼 최소 500개의 세포를 검출할 수 있습니다.
  3. 검사를 위한 대장균 세포 준비
    1. 원하는 세포 현탁액을 위해 배양된 스톡 1ml를 1.5ml 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.
    2. 6,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 세포를 원심분리합니다.세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
    3. 10μl의 반응 완충액을 세포 펠렛에 추가하고 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 5분 동안 초음파 처리합니다. 세포 현탁액을 5분 동안 아이스박스에 옮깁니다.
    4. 세포 현탁액을 5분 더 초음파 처리합니다.
    5. 13,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.테스트를 위해 상등액(10μl)을 사용합니다.

6. 리트머스 테스트

  1. 1.5ml 마이크로분리관에 100μl의 반응 완충액(RB)을 첨가 및 볼텍싱하고 완충액을 폐기하여 튜브를 사전 세척합니다.
  2. 조립된 EC1(프로토콜 4) 15μl를 세척된 마이크로분리관으로 옮깁니다.
  3. 마이크로퓨지 튜브를 마그네틱 랙에 올려 마그네틱 비드를 세척합니다. 피펫팅으로 상층액을 제거합니다. 랙에서 마이크로분리 튜브를 제거하고 RB 100μl를 추가한 다음 마그네틱 비드를 조심스럽게 다시 매달아 놓습니다.
  4. 6.3단계를 반복하여 MB를 두 번 더 세척합니다.
  5. 마이크로분리 튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓고 상층액을 제거한 다음 5.3단계에서 준비한 10μl E. coli 샘플을 추가합니다.
  6. 샘플과 마그네틱 비드를 마이크로분리 튜브를 부드럽게 두드려 조심스럽게 혼합합니다.
  7. 반응을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  8. 반응에 90 μl의 ddH2O를 첨가하고 마이크로 분리 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다.
  9. 약 3분 동안 자기를 분리한 후 85μl의 상등액을 0.5ml 마이크로분리 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 자성 비드가 모이지 않도록 상등액을 천천히 빼냅니다.
  10. 위의 마이크로 분리 튜브에 15 μl의 0.04 % 페놀 레드와 100 μl의 기판 용액을 첨가하십시오.
  11. 색상 변화를 기록하기 위해 특정 시간 간격으로 사진을 찍습니다.
    참고: pH 변화는 미세 전극이 있는 pH 측정기를 사용하여 모니터링할 수도 있습니다. 시작 pH는 약 5.2-5.5 여야합니다 (용액은 노란색). 그렇지 않은 경우 1mM 아세테이트 완충액 pH 5.0)을 첨가하여 용액을 조정할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

박테리아 리트머스 시험의 원리는 그림 1에 설명되어 있습니다. 이 시험에는 세 가지 핵심 재료인 특정 박테리아에 의해 활성화되는 RNA 절단 DNAzyme, urease 및 자성 비드가 사용됩니다. DNAzyme은 표적 박테리아를 매우 특이적으로 검출하기 위한 분자 인식 요소로 사용됩니다. Urease와 자성 비드는 DNAzyme의 RNA 절단 활성을 신호로 변환하는 데 사용됩니다. 여기에는 urease-DNAzyme 접합체를 포함하는 자성 비드를 생성하는 과정이 포함됩니다. 표적 박테리아가 존재하면, DNAzyme이 자신의 RNA 연결 부위를 절단합니다. 이 작용으로 인해 자성 비드에서 urease가 해리됩니다. 방출된 urease는 자성 비드로부터 쉽게 분리될 수 있으며, urea와 pH 민감성 염료가 포함된 리포터 용액에서 색 변화를 유도하는 데 사용됩니다. Urease는 urea를 암모니아로 가수분해하며, 이 과정에서 pH가 상승하여...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

박테리아 반응성 DNA효소의 RNA 절단 활성의 작용을 리트머스 테스트로 번역하는 것은 그림 1과 같이 우레아제와 자기 분리를 사용하여 가능합니다. 박테리아 검출을 위한 변형된 리트머스 테스트의 시연은 대 장균 의존성 RNA 절단 DNA효소(5,19,20 )로 수행되지만, 설계는 일반적으로 모든 RNA 절단 DNA효소에 대해 확장될 수 있습니다. 다양한 분석물에 대한 RNA 절단 DNA효소의 가용성이 높고 새로운 표적을 위한 무작위 서열 풀에서 새로운 RNA 절단 DNA효소를 분리하는 다양한 방법론을 감안할 때, 수정된 리트머스 테스트 플랫폼이 다양한 관심 표적의 검출로 확장될 수 있을 것으로 기대합니다.

대장균 검출을 위한 리트머스 테스트는 보고 반응 시간이 각각 1시간 및 2시간으로 설정된 경우 5,000개 및 500개의 세포를 검출할 수 있습니다. 널리 사용되는 중합효소연쇄반응(PCR) 및 샌...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구 프로젝트에 대한 자금은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)에서 YL에 대한 디스커버리 보조금을 통해 제공했습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)VWR AMRESCO0105
수산화나트륨(NaOH) 펠릿BIO BASIC CANADA INC.SB6789
트리스 기반VWR AMRESCO0497
붕산AMRESCO0588
우레아VWR AMRESCOM123
40% 아크릴아미드/비스아크릴아미드(29:1) 솔루션BIO BASIC CANADA INC.A0007
설탕바이오샵 캐나다 Inc.SUC507
브로모페놀 블루Bioshop Canada inc.BRO777
크실렌시아놀 FFSIGMA-ALDRICHX-4126
10% 도데실황산나트륨Bioshop Canada inc.SDS001
염산(HCl)CALEDON LABORATORIES LTD6026
염화나트륨(NaCl)Bioshop Canada inc.SOD001
4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)바이오샵 캐나다 Inc.HEP001
염화마그네슘 (II) 육수화물VWR AMRESCO0288
트윈 20Bioshop Canada inc.TW508
아데노신 트리포스파르테 (ATP)AMRESCO0220
아세트산나트륨 트리하이드레이트 (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
에탄올상업용 알코올P016EAAN
테트라메틸렌디아민 (TEMED)AMRESCO0761
10% 과황산암모늄 (APS)BIO BASIC CANADA INC.AB0072
숙시니미딜 4-(N-말레미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)ThermoFisher SCIENTIFIC22360
디메틸설폭사이드(DMSO)CALEDON LABORATORIES803540
UreaseSIGMA-ALDRICHU0251
1x 인산염 완충 식염수(PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0.04% 페놀 레드SIGMA-ALDRICHP3532
10x T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 반응 완충액Lucigen30061-1
10x T4 DNA 리가제 반응 완충액Bio Basics CanadaB1122-B
T4 DNA 리가제(5 U/μ l)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) BrothAMRESCOJ106
AgarAMRESCOJ637
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (10 U/μ l)Lucigen30061-1
E. coli< / em> K12 (MG1655)ATCCATCC700926
원심 분리기Beckman Coulter, Inc.
유리판CBS 과학ngp-250nr
0.75mm 두께의 스페이서CBS 과학VGS-0725r
12웰 빗CBS 과학VGC-7512
UV 램프UVP95-0017-09
분광 광도계(NanoVue)GE 헬스케어N/A
금속판CBS 과학CPA165-250
와류VWR International58816-123
겔 전기 영동 장치CBS 과학ASG-250
페트리 접시VWR International25384-342
100 kDa MWCO 원심 필터EMD MilliporeUFC510024
Magnetic Bead (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
자기 분리 랙New England BioLabsS1506S
마이크로퓨지 튜브Sarstedt72.69
주사기 필터(0.22 μ m)VWR International28145-501
14ml 배양 튜브VWR International60818-725
세포 배양 인큐베이터Eppendorf ScientificM13520000
Branson 초음파 세척기BransonN/A
카메라(Canon Powershot G11)CanonN/A
50ml 원추형 튜브VWR International89004-364
392187

참고문헌

  1. Daar, A. S., et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).
  2. Newman, J. D., Turner, A. P. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).
  3. Turner, A. P. Biosensors: sense and sensibility. Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).
  4. Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).
  5. Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
  6. Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
  7. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  8. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  9. Breaker, R. R. Making catalytic DNAs. Science. 290, 2095-2096 (2000).
  10. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).
  11. Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
  12. Li, J., Lu, Y. A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions. J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).
  13. Liu, J., Lu, Y. A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).
  14. Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
  15. Liu, J., et al. A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).
  16. Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides. Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).
  17. Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design. PLoS One. 2, e1224(2007).
  18. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).
  19. Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection. Biomolecules. 3, 563-577 (2013).
  20. Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).
  22. He, S., et al. Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe. Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).
  23. Sumner, J. B., Hand, D. B. Isoelectric point of crystalline urease. J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).
  24. Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. 70 Years of crystalline urease: What have we learned. Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).
  25. Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk. Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).
  26. Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef. J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).
  27. Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).
  28. Strachan, N. J., Ogden, I. D. A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom. FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).
  29. de Boer, E., Beumer, R. R. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).
  30. Gracias, K. S., McKillip, J. L. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food. Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

RNA DNAE colipH

관련 논문