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Immunology and Infection

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54615
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2
1Childrens Hospital, Department of Pediatric Stem Cell Transplantation and Immunology, Johann Wolfgang Goethe-University, 2LOEWE Center for Cell and Gene Therapy, Johann Wolfgang Goethe-University, 3Institute for Cancer Research, Department of Cancer Immunology, Oslo University Hospital, Radiumhospital, 4The KG Jebsen Center for Cancer Immunotherapy, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

Eine einfache und zuverlässige Methode wird hier beschrieben eine Reihe von NK-Zellfunktionen wie Degranulierung, Zytokin und Chemokin-Produktion in verschiedenen NK-Zelluntergruppen zu analysieren.

Introduction

Als Teil beitragen des angeborenen Immunsystems natürlichen Killerzellen (NK) in die erste Verteidigungslinie gegen virusinfizierten oder bösartig transformierten Zellen. Ein System von hemmenden und aktivierenden Rezeptoren ermöglicht es ihnen, zwischen gesunden und transformierten Zellen ohne vorherige Antigen Priming im Gegensatz zu T-Zellen zu unterscheiden. Bei der Zielzelle Begegnung lösen NK - Zellen , den Inhalt ihrer zytotoxischen Granula (zB Perforin, Granzyme) in die Immunsynapse ihr Ziel zu töten. Außerdem produzieren NK - Zellen und sekretieren verschiedene Arten von Cytokinen ( zum Beispiel Interferon γ: IFN-γ, Tumor - Nekrose - Faktor-α: TNF-α) und Chemokine ( zum Beispiel Makrophagen - Entzündungsprotein-1β: MIP-1β) , auf Zielzelle Interaktion oder Zytokinstimulation 1.

Eine ausreichende NK-Zell-Funktionen wie Zytotoxizität, Chemokin und Zytokin-Produktion haben einen wichtigen Einfluss auf das Schicksal verschiedener diserleichtert. Leukämie - Patienten zeigen Rezidivraten erhöht , wenn sie ein defektes NK - Zell - Profil bei der Diagnose , bestehend aus reduzierten IFN-γ Produktion und eine verminderte Expression von aktivierenden NK - Zell - Rezeptoren 2 aufweisen. Eine frühe Erholung der NK - Zellzahlen und Funktion einschließlich Cytokin - Produktion bei der Zielzelle Interaktion mit einem reduzierten Rückfall und eine verbesserte Überlebensrate bei Patienten mit allogener Stammzelltransplantation 3 verbunden. Außerdem können zu Beginn einer Interferon - Therapie in hepatitis C virus-infizierten Patienten die Degranulation peripherer Kapazität NK - Zellen ist stärker in frühen als Responder in Non-Responder 4. NK - Zellzahlen (> 80 / ul) am Tag 15 nach autologer Stammzelltransplantation (autoSCT) bei Patienten mit Lymphom oder Multiplem Myelom leiden , sind prädiktiv für eine verbesserte progressionsfreie und das Gesamtüberleben 5. In Melanom-Patienten die Expression des T-Zell-Immunglobulin und Mucin-domain-mit deg Molekül-3 (TIM-3), ein Immun-Regulationsprotein auf NK - Zellen korreliert mit dem Krankheitsstadium und Prognose 6.

Wissenschaftler haben in den letzten Jahrzehnten NK-Zell-Funktionen überwacht. Die erste Analyse der NK - Zell - Zytotoxizität gegen Tumorzellen ohne vorherige Grundierung wurde eine 51 Cr-Freisetzungstest 7 angesprochen. In jüngerer Zeit entwickelte Wissenschaftler eine nicht-radioaktive Verfahren die Zytotoxizität von NK - Zellen erweitert 8 zu bewerten. Zytokin und Chemokin Herstellung häufig bewertet wurde 9,10 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Techniken. Während der letzten Jahrzehnte haben sich diese Methoden durch Durchflusszytometrie basierenden Assays ergänzt. Die Verwendung von Protein - Transport - Inhibitoren (beispielsweise Brefeldin A und Monensin) und Zellpermeabilisierung Methoden in Kombination mit konventionellen Oberflächen Färbeprotokollen haben Wissenschaftler aktiviert Chemokin und Cytokin - Produktion in verschiedenen spezifischen Lymphe zu studierenocyte Teilmengen (beispielsweise T, B oder NK Zellen) 11. Außerdem verschiedene Durchflusszytometrie basierenden Assays wurden entwickelt, T und NK-Zell-Cytotoxizität zu überwachen. 2004 Alter et al. Beschrieben , um die Oberflächenexpression des Lysosom-assoziiertes Protein CD107a (Lamp1) auf NK - Zellen auf Zielzellen - Treffen als Marker für die Degranulation von zytotoxischen Granula 12. Da eine breite Palette von unterschiedlichen Fluorochromen und Multi-Channel-Durchflusszytometer in unseren Tagen zur Verfügung stehen, ist es möglich geworden, gleichzeitig diverse NK-Zell-Funktionen (Zytotoxizität, Zytokin und Chemokin-Produktion) in verschiedenen NK-Zell-Subpopulationen zu überwachen. Dies wird besonders wichtig in Situationen , in denen Probengröße begrenzt ist, beispielsweise in Biopsien oder Blutproben von Patienten mit Leukopenie leiden.

Um zu testen, Funktionen global NK-Zellen, die verschiedenen Durchflusszytometrie basierende Tests effizient kombiniert werden. Theorell et al. Stimulierte NK - Zellen aus HEAlthy Spender mit der Tumorzelllinie K562 und analysiert NK - Zell - Degranulation, inside-out - Signal und Chemokin - Produktion über die Durchflusszytometrie 13. Kürzlich NK-Zell-Untergruppen, Phänotypen und Funktionen in Tumorpatienten während autoSCT wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert basierte Assays. Es konnte gezeigt werden, dass NK - Zellen in der Lage waren Zytokinen / Chemokinen auf Tumorzellerkennung in sehr frühen Zeitpunkten nach der autoSCT 11 bis degranulieren und produzieren.

Hier ist ein Protokoll beschrieben NK Zellfunktionen bei Wechselwirkung mit Tumorzellen einschließlich Degranulation Kapazität, Chemokin und Cytokin-Produktion unter Verwendung einer Durchflusszytometrie-basierten Assays zu bewerten, die es möglich macht, NK-Zell-Funktionen in verschiedenen Teilmengen gleichzeitig zu überwachen.

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Protocol

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Ethikkommission der Universität Frankfurt durchgeführt.

1. Anzucht von K562-Zellen

  1. Kultur K562 Zellen in R10 Medium (RPMI1640 - Medium mit Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin, 10% fötales Kälberserum) bei einer Dichte von 0,5-1 x 10 6 Zellen pro ml in einem Zellkulturkolben bei 37 ° C und 5% CO 2.
  2. Ernte-K562-Zellen 24 Stunden vor dem Beginn einer neuen Experiment.
    1. Entfernen des Zellkulturkolben, die K562-Zellen aus dem Inkubator enthält. Re-suspend die K562-Zellen in der Kulturmedien durch sanftes Auf- und Abpipettieren.
    2. Übertragen Sie die Kulturmedien, die K562-Zellen in einem 15 oder 50-ml-Röhrchen und Pellet die Zellen bei 400 g für 8 min enthält. Überstand verwerfen und wieder die Zellen in 5 ml R10 Medien und gut mischen.
    3. Transfer 20 ul der Zelllösung in eine Vertiefung einer 96-U-Well-Platte. In 20 ul Trypanblau undgut mischen durch Pipettieren nach oben und unten für mindestens 5-mal. Je 10 ul der Lösung in eine Zelle Zählkammer und die Zellen zu zählen.
    4. Pelletieren Sie die Zellen bei 400 g für 8 min. Wieder die Zellen in R10 Medien und stellen Sie die K562 Zellkonzentration auf 0,5 bis 1 x 10 6 Zellen pro ml.
    5. Inkubieren der K562 - Zellen in einem Zellkulturkolben bei 37 ° C und 5% CO 2 bis zur Verwendung.

2. Isolierung von NK-Zellen

  1. Nach der Genehmigung und Richtlinien der Ethikkommission, erhalten eine schriftliche Einverständniserklärung des gesunden Spenders oder Patienten vor der Sammlung von 6-10 ml entweder EDTA oder heparinisiertes peripheren Blut.
  2. Die Reagenzien für den NK-Zell-Isolierung bei 4 ° C bis zum Beginn des Experiments und verwenden sie dann bei Raumtemperatur (RT) unter sterilen Bedingungen. Isolieren NK-Zellen aus peripherem Blut unter Verwendung von magnetischen Mikrokügelchen und einem spezifischen Magnet für Zellisolierung nach ter Anweisungen des Herstellers.
    1. Rekonstitution ein Fläschchen der lyophilisierten NK-Zell-negativen Antikörper-Cocktail Isolierung durch Pipettieren 7,5 ml des mitgelieferten Puffer A in das Fläschchen (innerhalb der NK-Zell-Extraktions-Kit enthalten). Vorsichtig mischen durch Pipettieren nach oben und unten 3-4 mal.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Suspension vor jedem Gebrauch homogen ist.
    2. Bereiten Sie die letzte Cocktail-Lösung durch entsprechende Mengen des aufgelösten Pellet aus Schritt 2.2.1 und Puffer B Mischen (innerhalb der NK-Zell-Extraktions-Kit enthalten). Um diese Volumina definieren das Volumen der Vollblutprobe in ml als Volumen = 1.0 bestimmen. Verwenden 0,25 Volumen der rekonstituierten Pellet (aus Schritt 2.2.1) und 0,25 Volumen Puffer B 1 Volumen von Vollblut zu verarbeiten.
    3. Übertragen der Mischung in einer ausreichenden Rohr der Vollblutprobe enthält. Sie Pipette nicht nach oben und unten um den Verlust von Blut innerhalb der Pipette zu vermeiden. Stattdessen schließen Sie das Rohr und bewegen vorsichtig nach oben und nach unten, bis der Suspension ist homogen. Nicht mit dem Vortex.
    4. homogenisieren ferner die Probe ein Rohr Rotator für 5 min bei RT verwendet wird.
    5. Unter sterilen Bedingungen, entfernen Sie die Kappe und legen Sie den Schlauch in den Magnetseparator 15 min, wie vom Hersteller empfohlen. Stellen Sie sicher, dass die Rohr Etiketten Gesicht in Richtung der Rückseite des Magneten ungestörte Sicht der Trennlinie zu ermöglichen. Sie nicht den Magneten während der Trennung zu bewegen, da dieses Verfahren würde gestört werden.
    6. übertragen Sie vorsichtig den Überstand in ein neues 15-ml-Tube und füllen sich mit vollständigen Medien (CM; hämatopoetischen Zellmedien, 1% Penicillin / Streptomycin, 5% Humanserum). Pelletieren Sie die Zellen bei 400 g für 8 min.
      1. Optional: Wenn das Pellet rot ist, resuspendieren der Zellen in 1 ml Puffer Erythrozyten - Lyse (beispielsweise 1 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer: 155 mM NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA; 10 mM KHCO 3 in 1 l destilliertem Wasser (DW)) und für 8 min bei RT inkubiert. Alternativ können Sie einen erythrocyte Depletion Kit.
        HINWEIS: Bitte beachten Sie , dass die Verwendung von ACK Puffer negativ NK - Zell - Funktionen 14 auswirken könnten.
      2. Schnell die ACK-Puffer verdünnt durch Zugabe von mindestens 1 ml CM die Lyse und Zentrifuge für 8 min bei 400 · g zu stoppen, um die Zellen zu pelletieren.
    7. Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml CM und mit dem Zählen fort. Übertragen Sie 20 ul der NK-Zell-Lösung auf eine 96-U-Well-Platte. In 20 ul Methylenblau in jede Vertiefung und gut mischen durch Pipettieren von oben und unten für mindestens 5-mal. Je 10 ul der Lösung in eine Zelle Zählkammer und Zellen zu zählen. Alternativ wurden 30 ul unverdünnter Zellsuspension verwendet werden, um mit einem im Handel erhältlichen Zellzähler gezählt.
    8. Stellen Sie die Zellen in einer Konzentration von mindestens 2 x 10 4 NK Zellen pro 100 ul CM.
    9. Führen Sie eine Oberfläche Antikörper-Färbung der isolierten NK-Zellpopulation, die Reinheit mit einem Durchflusszytometer zu überprüfen.
      1. Prepare einen Master - Mix - Lösung , indem die Volumina der angegebenen Antikörper gemäß Tabelle 1 Mischungs.
      2. Wieder die Zellen in 88,5 ul Waschpuffer (WB; 0,5% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% NaN 3 in PBS) und 11,5 ul des Master - Mix - Lösung hinzufügen. Inkubieren der Zellen für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln.
        Achtung: NaN 3 ist toxisch und mutagen. Behandeln Sie es entsprechend an die entsprechenden Sicherheitsdatenblätter (SDB).
      3. 1 ml WB und Pellet die Zellen bei 400 × g für 4 min.
      4. Wieder die Zellen in 300 & mgr; l-Färbung Puffer plus DAPI. Erwerben Sie die Zellen eines Durchflusszytometers verwenden.
        HINWEIS: Gehen weiter mit dem Experiment nur, wenn der NK-Zell-Reinheit mindestens 80% aller alive Lymphozyten.

3. Ernten der K562-Zellen für NK-Zell-Stimulation

  1. Entfernen Sie die Zellkulturflasche aus der K562-Zellen (aus Schritt 1.2) mit th e Inkubator. Re-suspend die K562-Zellen in der Kulturmedien durch sanftes Auf- und Abpipettieren.
  2. Übertragen Sie die ganze Kulturmedien in ein 15 oder 50-ml-Röhrchen und Pellet die Zellen bei 400 g für 8 min. Überstand verwerfen und wieder die Zellen in 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und gut mischen.
  3. Transfer 20 ul der Zelllösung in eine Vertiefung einer 96-U-Well-Platte. In 20 ul Trypanblau und gut mischen durch Pipettieren nach oben und unten für mindestens 5-mal. Je 10 ul der Lösung in eine Zelle Zählkammer und die Zellen zu zählen. Alternativ 30 ul unverdünntem Zellsuspension verwenden, um mit einem im Handel erhältlichen Zellzähler zu zählen.
  4. Pelletieren Sie die Zellen bei 400 g für 8 min. Re-suspendieren in Zellen CM bei einer Konzentration von mindestens 2 x 10 4 K562 Zellen pro 100 & mgr; l Medium.
    HINWEIS: Verwenden Sie die gleiche K562 und NK-Zell-Konzentrationen, um sowohl bei einem Effektor zu brüten: Ziel (E: T) Verhältnis von 1: 1 später.
"> 4. Stimulation von NK-Zellen mit der Tumorzelllinie K562 und Cytokinen

  1. Vorsichtig die Zellen für mindestens 5-mal durch Pipettieren sie nach oben und unten mischen. 100 ul / Vertiefung der NK-Zell-Lösung in die erforderlichen Vertiefungen einer 96-V-Well-Platte zu verteilen.
    1. Verwenden Sie mindestens zwei Vertiefungen für jeden Spender eine mit und eine ohne einen Reiz (zB K562 Tumorzellen und Zytokine). Wann immer möglich, führen Sie das Experiment zumindest in zweifacher Ausfertigung und fügen Sie eine positive Kontrolle (zB Phorbol - 12-Myristat 13-Acetat (PMA) und Ionomycin; Endkonzentration: 50 nM PMA, 1 & mgr; M Ionomycin pro Vertiefung). Bereiten aktualisiert Durchflusszytometrie Kompensationen für das Datum des Experiments.
      HINWEIS: Daraufhin wird die Antikörper vor Gebrauch (siehe Diskussion).
  2. Schalten Sie das Licht aus und fügen Sie den anti-CD107a Antikörper (2 ul, Endkonzentration: 1: 100) in jede Vertiefung mit NK-Zellen auf der 96-V-Well-Platte.
  3. Sie vorsichtig die K562-Zellen mischen durch Pipettieren sie nach oben und unten anmindestens 5 mal.
    1. Aus den Brunnen der NK-Zell / anti-CD107a Antikörper-Lösung enthält, identifizieren die für die Stimulation mit K562-Zellen geplant diejenigen. 100 l / Vertiefung der K562 Zelllösung in diesen Brunnen. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren nach oben und unten für mindestens 5-mal.
    2. Hinzufügen Interleukin-2 (IL-2; Endkonzentration 100 U / ml) und Interleukin-15 (IL-15; Endkonzentration 10 ng / ml) in die Vertiefungen enthaltenden K562 Zellen und die NK-Zell / anti-CD107a Antikörper-Lösung.
      1. Optional: Testen Sie die Auswirkungen der entweder K562-Zellen oder Zytokine allein auf den verteilten NK-Zellen Tumor-induzierte im Vergleich zu Cytokin-induzierte NK-Zell-Funktionen zu entschlüsseln.
    3. Identifizieren Sie die Vertiefungen auf der 96-V-Well-Platte geplant als negative Kontrollen ohne Reiz. Füge 100 ul / Vertiefung CM zu diesen Vertiefungen nur die NK-Zelle / anti-CD107a Antikörper-Lösung enthält. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren nach oben und unten für mindestens 5-mal.
      1. Optional: Für eine positive Kontrolle, 100 μ; L CM PMA und Ionomycin (Endkonzentration: 50 nM PMA, 1 & mgr; M Ionomycin pro Vertiefung), die zu einem gut mit dem NK-Zell / anti-CD107a Antikörper-Lösung.
  4. Inkubieren Sie die Zellen für 3 Stunden im Dunkeln bei 37 ° C und 5% CO 2.
  5. Bereiten Sie einen Proteintransport Inhibitorlösung (zB Brefeldin A und / oder Monensin) in CM. Nach 1 Stunde Inkubation mit dem Licht die Lösung in jede Vertiefung der 96-V-Well-Platte hinzufügen ausgeschaltet (Endkonzentration: 0.5-1μM Brefeldin A und 2-3 uM Monensin). Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren nach oben und unten für mindestens 5-mal. Fortsetzung der Inkubation für die restlichen 2 h.

5. Oberflächen und intrazelluläre Färbung

  1. Nach der 3 Stunden Inkubationszeit in die Vertiefungen der 96-V-Well-Platte pipettiert, nach oben und unten für mindestens 5-mal und übertragen sie in der Durchflusszytometrie Rohre sorgfältig die Zellen mischen. 1 ml / Röhrchen von WB. Pellet-Zellen bei 400 g für 4 min.
    1. Optional: Vor dem Zentrifugieren spülen Sie die Vertiefungen mit 100 ul / Vertiefung PBS, um die Erholung der Zellen zu optimieren, durch Auf- und Abpipettieren für mindestens 5-mal, bevor die Zellen in das jeweilige FACS-Röhrchen übertragen.
  2. Überstand verwerfen und Fahren Sie mit der Oberflächenfärbung.
  3. Umfassen eine aminreaktive Fluoreszenzfarbstoff, der nicht-permeierenden ist, Zellen mit einem Emissionsmaximum von 423 nm als fixierbar toten Zellmarker (DCM) zu leben. Führen Sie die Färbung vor (siehe unten) oder parallel zu der Antikörper Oberflächenfärbung verwendet von der Art des DCM abhängig.
    1. Re-suspend-Zellen in 99 & mgr; l / Röhrchen PBS und fügen 1 ul / Röhrchen des fixierbaren DCM (Endkonzentration: 1: 100). Mischen Sie Zellen auch einen Wirbel mit und brüten sie für 15 min bei RT im Dunkeln.
    2. Bereiten Sie einen Master - Mix - Lösung durch die "Oberfläche" Antikörper in Tabelle Mischen 2 (siehe Färbeschritt Spalte blau markiert). Verwenden Sie die indicated Volumen / Rohr und multiplizieren Sie sie mit der Anzahl der Durchflusszytometrie Rohre gefärbt werden.
    3. Nach der Inkubation nehmen Sie die Durchflusszytometrie Röhrchen mit den Zellen und 1 ml / Röhrchen von WB. Pelletieren Sie die Zellen bei 400 g für 4 min.
    4. Überstand verwerfen, wieder die Zellen in 84 & mgr; l / Röhrchen von WB und fügen Sie 16 ul / Rohr des Master-Mix-Lösung. Mischen Sie Zellen auch einen Wirbel verwenden. Inkubiere Zellen für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln.
    5. Nach 20 Minuten hinzufügen 4 min bei 400 · g 1 ml / Röhrchen WB und Pellet-Zellen.
  4. Überstand verwerfen und wieder die Zellen in 100 & mgr; l / Röhrchen einer Kaltfixierungslösung (zB 2% (endgültige) Paraformaldehyd oder Formaldehyd). Mischen Sie Zellen auch einen Wirbel verwenden. Inkubiere Zellen für 10 min bei 4 ° C im Dunkeln.
    1. Stain die Zellen für die intrazelluläre Zytokine / Chemokine nach diesem Schritt oder lagern Sie sie über Nacht bei 4 ° C in WB.
      HINWEIS: Nach Inkubation über Nacht eine niedrigere Zellgewinnung auftreten können.
  5. Wash-Zellen in 1 ml / Röhrchen WB bei 400 × g für 4 min und fahren Sie mit der Permeabilisierung Schritt.
  6. Vorbereiten eines Permeabilisierung Puffer (PB) (beispielsweise 0,2% Saponin, 1% BSA - Lösung in PBS).
  7. Waschen Sie die Zellen zweimal in 1 ml / Röhrchen von PB bei 400 × g für 4 min. Fahren Sie mit der intrazellulären Färbung.
    Achtung: Saponin ist möglicherweise irritierend. Behandeln Sie es entsprechend an die entsprechenden Sicherheitsdatenblätter (SDB).
  8. Bereiten Sie einen Master - Mix - Lösung die angegebenen "intrazellulären" Antikörper Volumina in Tabelle 2 mit (grün markiert). Multiplizieren diese Volumen mit der Anzahl der Rohre gefärbt werden.
    1. Wieder die Zellen in 90 & mgr; l / Röhrchen PB legen und 10 & mgr; l / Röhrchen des Antikörpers Master-Mix-Lösung. Gut mischen einen Wirbel mit und Inkubation der Zellen für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln.
  9. Waschen Sie die Zellen zweimal in 1 ml / Röhrchen von PB bei 400 × g für 4 min.
  10. Überstand verwerfen und wieder die Zellen in 400 & mgr; l / Röhrchen PB. Mischen Sie Zellen auch einen Wirbel verwenden. Legen Sie Zellen auf Eis im Dunkeln bis zur Messung.

6. Durchflusszytometrie Vergütungsprogramme und akquisitions

  1. Wählen Sie die Kanäle für die verschiedenen Fluorochromen (siehe Tabelle 2) in der Durchflusszytometrie Erfassungs - Software im Parameter Setup - Ordner. Darüber hinaus wählen die Kanäle für FSC-A und sowie für SSC-A und -H -H ist.
  2. Legen Sie eine Kompensationsmatrix für die ausgewählten Parameter in die Akquisition Datei erstellt.
    1. Erstellen Sie eine Kompensationsmatrix unter Verwendung von isolierten NK - Zellen aus Schritt 2.2.8 durch eine einzige Farbe Fleck für jede verwendete Fluorochrom Durchführung (siehe Tabelle 2). Verwenden Sie die Oberflächenfärbung in den Schritten 5.1-5.4. Fügen Sie eine ungefärbte Kontrolle (ohne Antikörper) Sowie Isotypkontrollen und / oder Fluoreszenz minus eins Kontrollen (FMO).
      HINWEIS: Als Alternative zur zellbasierten Vergütung, verwenden IgG-bindenden Perlen als Kompensationssteuerungen.
    2. Legen Sie jedes Röhrchen für einzelne Fleck Proben und die Probe ohne Antikörper in die Probeninjektionsöffnung (SIP). Klicken Sie auf den "Record" in der Durchflusszytometrie Erfassungs - Software und erwerben pro Probe mit einer Zellzahl von mindestens 5 x 10 3 NK - Zellen.
    3. Verwenden Sie die Kompensationsberechnung Anwendung der Durchflusszytometrie Erfassungs-Software eine Kompensationsmatrix zu erstellen.
  3. Erstellen Sie Dot-Plots für die Identifizierung der NK-Zell-Population.
    1. Identifizieren Sie einzelne Zellen unter Verwendung von FSC-A / FSC-H und SSC-A / SSC-H-Dot-Plots. Klicken Sie auf das "Polygon-gate" Taste. Zeichnen Sie ein Tor um Zellen, die eine lineare Verteilungsmuster in den beiden Punktplots haben. Doppelklicken Sie auf den Toren einen neuen Punkt-Diagramm zu öffnen.
    2. Wählen Sie eine FSC-A / SSC-A Punktauftragung die Lymphozyten zu identifizieren/ NK - Zell - Population (siehe Abbildung 1). Zeichnen Sie ein Polygon Tor um ihn herum, und doppelklicken Sie auf das Tor.
  4. Legen Sie jedes Probenröhrchen der NK-Zell-Stimulationstest in den SIP. Klicken Sie auf den "Record" Taste und erwerben pro Probe mit einer Zellzahl von mindestens 5 x 10 3 NK - Zellen.

7. Analyse und Statistik

  1. Öffnen Sie die Durchflusszytometrie-Analyse-Software-Programm. Klicken Sie auf das Laden Probe, um die nicht-stimulierten Kontrollprobe zu öffnen.
  2. Erstellen Sie ein Gating - System für die verschiedenen NK - Zell - Subpopulationen (siehe Abbildung 1).
    1. Klicken Sie auf den Punkt-Diagramm, um eine FSC-A / SSC-A-Plot zu erstellen. Klicken Sie auf das Sperrwarze Rechteck und zeichnen Sie ein Rechteck Tor über alle Ereignisse mit einem FSC-A - Wert> 5 x 10 4 Schutt auszuschließen. Öffnen Sie das Tor mit einem Doppelklick auf das Tor.
    2. Wählen Sie erneut die FSC-A / SSC-A-Parameter innerhalb des neuen Dot-Plot und klicken Sie auf das Polygon-Gate-Taste. Dein Polygon - Gate um die Lymphozyten - Population roh (siehe Abbildung 1). Öffne das Tor.
    3. Wählen Sie die SSC-A / SSC-H-Parameter für den neuen Dot-Plot und ein Polygon Tor ziehen um alle einzelnen Zellen. Einzelne Zellen zeigen eine lineare Verteilung über die FSC-A / FSC-H und SSC-A / SSC-H - Parameter (siehe Abbildung 1). Öffnen Sie das Tor durch einen Doppelklick auf sie.
    4. Wiederholen Sie Schritt 7.2.3 die FSC-A / FSC-H Parameter diesmal mit.
    5. Mit dem Parameter CD45 und Dump-Kanal (CD 3, CD14, CD19, DCM) tote Zellen auszuschließen. Zeichnen Sie ein Rechteck Tor um alle CD45 positive und Dump-Kanal-negativen Zellen. Öffnen Sie das Tor mit einem Doppelklick auf das Tor.
    6. Identifizieren Sie die ganze NK-Zell-Population durch die CD56 verwenden und Kanalparameter Dump. Erstellen Sie ein Rechteck Gatter um das CD56 positive und Dump-negativen Zellen kanalisieren. Öffnen Sie das Tor durch einen Doppelklick auf sie.
    7. Zeichnen Sie ein Rechteck Tor um alle drei NK-Zell-Subsets innerhalb eines CD56 / CD16 Punktauftragung. Identify die verschiedenen Untergruppen als CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + und CD56 + CD16 ++ NK - Zell - Subpopulationen.
  3. Analysieren NK Zellfunktionen für jeden einzelnen NK-Zell-Subset.
    1. Klicken Sie auf einen der drei NK-Zell-Subset Tore zu öffnen. Erstellen Sie drei verschiedene Punktplots für CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ und CD56 / MIP-1β.
    2. Zeichnen Sie ein Rechteck - Gate für CD56 - positive Zellen, die auch positiv für CD107a, IFN-γ oder MIP-1β bzw. (siehe Abbildung 1).
    3. Wiederholen Sie Schritt 7.3.1-7.3.2 für jede verbleibende NK-Zell-Untergruppe.
  4. Wiederholen Sie Schritt 7.2 und 7.3 für alle stimulierten Proben. Speichern Sie alle statistischen Werte jeder einzelnen Probe durch Klicken auf die Statistik-Export-Taste innerhalb der Analyse-Software.
  5. Öffnen der Dateien, die statistischen Werte der einzelnen Proben, die NK-Zellfunktionen zu analysieren. Wählen Sie die Werte für die einzelnen NK-ZellenUntergruppen (zB CD56 ++ CD16 - NK - Zellen) , indem Sie sie in eine andere Datei zu kopieren.
    1. Subtrahiere den Prozentsatz der CD107a positiven NK-Zellen, die nicht mit einem Reiz behandelt, von dem Prozentsatz der CD107a positiven NK-Zellen, die mit einem Stimulus behandelt wurden.
      Hinweis: Das Ergebnis Über die Degranulation Kapazität dieses speziellen NK Zell-Untergruppe in Reaktion auf den Reiz zu demonstrieren.
    2. Wiederholen Sie Schritt 7.5.1 für IFN-γ und MIP-1ß-positiven NK-Zellen das Zytokin und Chemokin-Produktion als Reaktion auf den Reiz zu demonstrieren.
    3. Wiederholen Sie Schritt 7.5.1-7.5.2 für jede verbleibende NK-Zell-Untergruppe ihre Degranulation Kapazität und Zytokin / Chemokin-Produktion nach Stimulation zu bewerten.

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Representative Results

Die Gating - Strategie zur Analyse der Degranulation, Zytokin und Chemokin Herstellung der gesamten NK - Zellpopulation und drei verschiedene NK - Zelluntergruppen sind in Abbildung 1 dargestellt.

Repräsentative Ergebnisse eines gesunden Spenders sind in Abbildung 2 dargestellt. NK - Zellen ohne Stimulus erzeugt weder IFN-γ oder MIP-1β und nicht CD107a auf ihrer Oberfläche (2A) exprimieren. Im Gegensatz dazu stimulierte NK-Zellen mit Tumorzellen und Zytokine produziert signifikante Mengen an intrazellulärer IFN-γ und MIP-1β. Darüber hinaus mehr als 20% von ihnen degranuliert bei Wechselwirkung Tumorzelle , die durch CD107a auf ihrer Oberfläche (2C) ausdrückt. PMA und Ionomycin - Stimulation wurden als Kontrolle (2B) verwendet.

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Abb . 1: Strategie Gating Nachfolgende Gattern aufgetragen. Zuerst Trümmer sind in einem FSC-A / SSC-A Plot ausgeschlossen. Dann werden Lymphozyten identifiziert und Dubletten werden mit zwei Parzellen mit SSC-A / SSC-H und FSC-A / FSC-H ausgeschlossen. Danach wird ein Tor mit allen CD45 + Zellen und unter Ausschluss aller Toten, CD3 +, CD14 + und CD19 + Zellen durch Auftragen CD45 / Dump - Kanal eingestellt. Als nächstes werden NK - Zellen durch Gating auf CD56 + Zellen identifiziert. Ein Grundstück mit CD56 / CD16 kann verwendet werden, um die Haupt NK-Zell-Subpopulationen zu identifizieren. Schließlich in der gesamten NK-Zellpopulation, sind funktionelle Marker durch Auftragen CD56 gegen CD107a, IFN-γ und MIP-1β gekennzeichnet sind. Dies kann auch für alle verschiedenen Arten von NK - Zell - Subpopulationen. Erfolgen Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Fig . 2: Repräsentative Ergebnisse aus einer gesunden Zelle Spender NK die Gating - Strategie in Figur 1 beschrieben ist , NK - Zelle funktionellen Markern wie CD107a (für Degranulation), IFN-γ und MIP-1β, identifiziert werden. Die linke Spalte (A) zeigt die Ergebnisse unter Verwendung von NK - Zellen in Abwesenheit eines Reizes. Die mittlere Spalte (B) zeigt die Ergebnisse in der Anwesenheit der positiven Kontrolle PMA / Ionomycin. Die rechte Spalte (C) stellt Ergebnisse für NK - Zellen mit der Tumorzelllinie stimuliert K562 und in Anwesenheit der Zytokine IL - 2 (100 U / ml) und IL-15 (10 ng / ml). Bitte klicken Sie hier um zu sehen eine größere Version dieser Figur.

"Tabelle Tabelle 1: Antikörper für Reinheit zu überprüfen.

Tabelle 2
Tabelle 2: Antikörper für extra- und intrazelluläre Färbung.

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Discussion

Das beschriebene Verfahren ist eine einfache, schnelle und zuverlässige Ansatz NK-Zell-Funktionen aus Vollblut von gesunden Spendern oder Patienten zu untersuchen. Dieses Verfahren bietet den großen Vorteil, direkt NK - Zellen aus Vollblut zu reinigen, die Vermeidung der zeitraub Dichtegradientenzentrifugation, die für viele andere Reinigungsverfahren 15 vorgeschrieben ist. Außerdem erfordert es eine kleinere Größe Probe im Vergleich zu "klassischen" NK-Zell-Isolation / Anreicherungsverfahren, das es eine geeignete Alternative für die Proben von Kindern und / oder immungeschwächten Patienten macht. Dieses Protokoll kann verwendet werden , Basalwerte von NK Zellfunktionen ex-vivo zu erhalten, aber es erlaubt auch die weitere NK Kultur und Expansion auf diese Weise komplementär mit anderen Methoden bisher 8 beschrieben. Nichtsdestotrotz haben einige kritische Schritte in Betracht gezogen werden. Da der Assay auf extra- und intrazellulären Antikörperfärbung beruht, ist es entscheidend, die optimal zu bestimmen, working Konzentration zunächst für jeden Antikörper. Speziell für die intrazelluläre Färbung, eine sorgfältige Bewertung der verwendeten Antikörper ist sehr zu empfehlen. Ein guter Ansatz ist , eine Verdünnungsreihe des verwendeten Antikörpers zu testen (beispielsweise 1: 100 bis 1: 12,5) in einer Suspensionszelle stimuliert mit oder ohne PMA / Ionomycin. Anschließend wird das Verhältnis von positiven Ereignissen zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Proben werden berechnet und dargestellt. Der Antikörper Verdünnung mit dem höchsten positiven fach Änderungsverhältnis (beste Signal-zu-Rausch - Verhältnis) sollte 16 für weitere Experimente verwendet werden. Darüber hinaus kann die Verwendung von Steuerelementen wie isotype- und FMO Kontrollen beweisen fundamental als besonders für die intrazelluläre Färbung, um Gate korrekt auf den positiven Zellpopulationen.

Es gibt jedoch einige wichtige Einschränkungen des beschriebenen Verfahrens. CD107a Ausdruck ist eine Degranulation Marker und somit nur indirekt zeigt NK-Zell-Zytotoxizität. NK-Zell-Zytotoxizität einnd Degranulation Kapazität kann unterschiedlich sein. Hochregulation des autophagy Stoffwechselweg in Tumorzellen führt zur Verschlechterung von sekretierten Granzym B und reduziert Zelltod auf NK - Zell - Interaktion 17. Daher ein zusätzliches DCM (zB gespalten Caspase 3) könnte an die Anfärbung Platte hinzugefügt werden , um 18 Zelltod Ereignisse innerhalb der Zielzellen zu überwachen. Zusätzlich wird der NK - Zellen - Zytotoxizität durch die Menge an zytotoxische Proteine innerhalb ihrer Granula (beispielsweise Perforin, Granzym b) beeinflusst wird , die durch eine intrazelluläre Färbung 19,20 quantifiziert werden kann.

Darüber hinaus gibt es verschiedene Möglichkeiten, um das Protokoll zu ändern. Anstelle von isolierten NK-Zellen, peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) verwendet werden. Obwohl man sich bewusst sein muss, dass die absolute NK-Zellzahl innerhalb der PBMC-Population zwischen verschiedenen Gebern unterscheidet und sogar zwischen den Proben vom selben Spender abgeleitet zu unterschiedlichen Zeitpunkten. NK-Zell-degranulation ist auf der E stark abhängig: T-Verhältnis. T-Verhältnis in allen Experimenten: Um NK Zellfunktionen zwischen verschiedenen Spendern oder zu verschiedenen Zeitpunkten, die absolute NK-Zellzahl in der PBMC-Population zu vergleichen, sollte eine Konstante E herzustellen verwendet werden. Wenn NK Zellfunktionen zu verschiedenen Zeitpunkten innerhalb des gleichen Spenders überwacht werden, können PBMCs werden eingefroren , und die Analyse kann für alle verschiedenen Zeitpunkten , um auf einmal durchgeführt werden zu verringern inter experimentellen Variationen 11.

Da Anfärben Platten mit bis zu 18 Farben möglich sind, Analyse der NK-Zellfunktionen können in viel größerem Detail erweitert werden. Verwendung von zusätzlichen Oberflächenmarker, einschließlich CD57, NKG2A und Killerzellen-Immunoglobulin-like Rezeptoren (KIR), weitere Zell NK Teilmengen identifiziert werden können. Ausgebildet NK-Zellen mindestens eine Selbst KIR exprimierenden degranulieren stärker auf Interaktion mit K562-Zellen als ungebildet NK-Zellen. Im Gegensatz dazu differenzierter CD57 + CD56 + - CD56 + NK - Zellen 21. Zusätzlich können andere Marker der NK-Zellfunktion zu richten. LFA-1 ist ein wichtiges Molekül für die NK-Zell-Adhäsion und ist in seiner offenen Konformation auf NK-Zellaktivierung exprimiert. Diese sogenannte "inside-out - Signal" ist eine frühe NK - Zellaktivierungsmarker 22.

Schließlich können die Impulse für die Prüfung NK Zellfunktionen als auch modifiziert werden. Unserer Erfahrung nach frisch nur NK-Zellen isoliert degranulieren schlecht auf K562-Zell-Interaktion, wenn keine Zytokine zugesetzt werden. Mit frisch isolierten PBMCs ohne weitere Zytokin zusätzlich zu umgehen dieses Problem, weil der Einfluss von Bystander-Zellen. Außerdem Zytokinproduktion, insbesondere IFN-γ und TNF-α kann auf IL-12 und IL-18 - Stimulation 23 eingeleitet werden. IFN-γ Produktion innerhalb der Zelle NK Untergruppen unterscheiden depending auf dem verwendeten Reiz (Cytokin- gegen Ziel-induzierte Stimulation) 24. Zusätzlich anstelle K562 - Zellen als Zielzellen des Verwendens abgeleitete primäre Tumorzellen von Tumorpatienten könnten verwendet werden , um Medikamente zu testen NK Zellfunktionen gegen autologe Tumorzellen vor oder während der immunmodulierenden Therapien (zB monoklonaler Antikörper Behandlung oder immunmodulatorischen (IMiDs)).

In den letzten Jahren wurde auf dem Gebiet der Immuntherapie entwickelt sich schnell mit der klinischen Zulassung von Immun Checkpoint - Inhibitoren (zB ipilumumab, nivolumumab, pembrolizumab) 25 und erfolgreichen Versuchen gentechnisch veränderten chimären Antigenrezeptoren unter Verwendung von (CAR) exprimierenden T - Zellen als auch als CAR-NK - Zellen ( beschrieben in Referenz 26), zur Behandlung von hämatologischen Tumor - Patienten 27. Daher NK-Zell-basierte Immuntherapie wird immer mehr in den Fokus. Anti-CD20-Antikörper sind ein großer Erfolg in der treatme gewesennt maligner Lymphome innerhalb der letzten zwei Jahrzehnte 28. Die überwiegende Mehrheit der NK-Zellen exprimieren die geringe Affinität Fc-Rezeptor CD16 die Zellen ermöglicht Antikörper-markierten Zielzellen (Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität - ADCC) zu erkennen und zu töten. Die Fähigkeit des Antikörpers NK Zellfunktionen auslösen kann in vitro unter Verwendung des beschriebenen Protokolls 29 getestet werden. Terszowski et al. Analysiert NK - Zellen 'ADCC gegen eine Lymphoblastoidzellinie B verschiedenen klinisch zugelassenen anti-CD20 - Antikörpern. Während ADCC bei Rituximab Behandlung induziert (erste klinisch zugelassenen anti-CD20 - Antikörper 30) wurde durch KIR / HLA Wechselwirkung negativ beeinflusst, wurde dieser Effekt nicht beobachtet , wenn 31, 32 unter Verwendung Obinutuzumab (eine neuartige Glycoengineering - Technologie Typ II CD20 monoklonaler Antikörper). Darüber hinaus sind NK - Zell - Funktionen durch verschiedene neuartige Anti-Tumor - Medikamente wie der IMID beeinflusst Lenalidomid 33 und verschiedene Tyrosin-kinase - Inhibitoren (TKI) 34. Derzeit NK-Zell-spezifische Checkpoint-Inhibitoren sind in klinischen Studien getestet. Beispiele sind die Verwendung von anti-KIR 35,36 oder anti-NKG2A Antikörper (NCT02331875) sowie aktivierenden Agonisten wie ein anti-CD137 - Antikörper (NCT01775631; NCT02110082).

Wichtig ist 37, Adoptiv NK - Zell - Transfer wurde in einer Vielzahl von verschiedenen bösartigen Erkrankungen mit vielversprechenden klinischen Wirkungen durchgeführt. Mit dem Ziel , die besten Spender, NK - Zell - Funktionen gegen den Tumor des Patienten zu wählen , könnten in vitro unter Verwendung von Blutproben von potentiellen NK Zellspendern getestet werden.

Zusammenfassend ist das beschriebene Protokoll diverse NK Zellfunktionen von gesunden Spendern oder Patienten zu analysieren gestaltet. Diese Funktionen können in verschiedenen NK-Zell-Subpopulationen auf verschiedene Reize zu ausgewählten Zeitpunkten überwacht werden.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0.4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

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References

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Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

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