Introduction
Стафилококк (S. стафилококк) известен как самый важный патоген во всем мире , ответственного за интрамаммарной инфекции (IMI) у крупного рогатого скота 1. Исследование , проведенное Fournier и соавт. 2 продемонстрировано в швейцарских коров и исследованиях Cosandey и др. 3 и Boss и др. 4 у коров 12 европейских стран , что С. стафилококк , выделенной из бычьих ИМИ представляет собой генетически гетерогенную группу. С помощью ПЦР - амплификации межгенном спейсерной области 16S-23S рРНК (RS-PCR), в общей сложности 17 генотипами были первоначально обнаружены в 101 эпидемиологически независимых изолятов 2. Генотип В и генотипа С (КТЗ) были наиболее распространенным (80%), в то время как остальные 15 генотипов (ГСТ) происходили редко, каждый из которых вносит 1 до 4% от всех изолятов. На европейском уровне 3, GTB, GTC, ГТФ, GTI и GTR были самыми важными генотипы , содержащие 76% всех анализируемых штаммов (n = 456). GTB был расположен в центральной части Европы, шhereas другие генотипы были широко распространены. Остальные 24% штаммов включали 41 генотипов, многие из них, однако, наблюдались только один раз.
В работах Fournier и соавт. 2, Cosandey и др. , 3, и Грабером и др. 5 дополнительно показано , что генотипы были высоко связаны с их рисунком генов вирулентности, а также на швейцарцев , как на европейском уровне. Исследования дополнительно выявил массовые различия в распространенности среди IMI S. стафилококк GTB, GTC и другие генотипы 2,5: учитывая GTB, до 87% коров в стаде были заражены этим генотипом. В случае GTC и других генотипов, однако, IMI был только найден в 1 до 2 коров стада.
IMI , вызванные S. стафилококк, как правило , приводит к воспалению соответствующих молочных желез и увеличение воспалительных клеток в молоке. Как следствие, соматической клетки совместноунц в молоке (SCC), основным показателем качества молока в большинстве стран, увеличивается, приводящий к снижению цен на молоко или даже доставки остановки.
Кроме того, RS-PCR из Fournier и др. 2, другие методы типирования были описаны для подтипов бычьим штаммам S. из стафилококк 8-11. Два наиболее часто встречающиеся из них включают спа набрав 12 и мульти Locus последовательность ввода (MLST) 13. Первый из них основан на секвенирование ДНК переменной спейсерной области стафилококкового гена Spa кодирующего белок А, тогда как последний из них требует секвенирование 7 генов домашнего хозяйства. Это означает , что один 12 и семь ДЗП 13, соответственно, должны быть выполнены, с последующей очисткой ампликона, реакции секвенирования и анализа с использованием специального оборудования. По сравнению с RS-PCR, эти методы требуют значительных дополнительных усилий в лабораторных условиях, что приводит к низкой пропускной способности образца и высокой стоимостью.пропускная способность особенно низка для PFGE. Принимая во внимание решение этих методов для бычьих штаммов S. стафилококк, RS-PCR, по крайней мере так же хорошо , как спа , набрав 4 и лучше , чем MLST 4 или PFGE 15.
Все эти методы , включая бинарного ввода 13 продемонстрировали свою эффективность в получении дальнейшее понимание патогенеза крупного рогатого скота IMI , вызванного S. стафилококк, но из - за указанных ограничений они менее подходят для крупных клинических исследований. Кроме того, с помощью генотипирования RS-PCR , как описано Fournier и др. 2 позволяет надежно предсказывать эпидемиологические и патогенного потенциала S. стафилококк участвует в коровьем IMI, два ключевых значения в клинической ветеринарной медицины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. стафилококк изоляты
- Спред 10 мкл S. Исходную культуру стафилококка или одной колонии выращивают на селективной среде на чашках с агаром Columbia , содержащей 5% овечьей крови (BA).
- Выдержите аэробно при температуре 37 ° С в течение 18 часов до 24 часов.
2. ДНК-экстракции
- Готовят ТЕЛ буфера , содержащего 10 мМ Трис-HCl и 10 мМ Na 2 EDTA, рН 8,5. Подготовка аликвоты и автоклаве при 121 ° С в течение 15 мин.
- Соберите 1 колонию от БА с помощью стерильной пластиковой петли или стерильную деревянную кирку зуба и ресуспендируют в 100 мкл TEL. Используйте 1,5 мл пробирки с винтовыми крышками.
- Инкубируют при 95 ° С в течение 10 мин. Затем поместите образцы сразу на мокром льду.
- Развести образцов 1: 100 в H 2 O , подходящей для ПЦР (= ДНК - матрицы для ПЦР). В неразбавленной и разведенные образцы можно хранить при -20 ° С в течение 1 месяца.
3. RS-PCR
- Выполните следующую программу велосипедный в стандартной ПЦР-амплификатора: 15 мин 95 ° С, а затем 27 циклов, включающих 94 ° С в течение 1 мин, а затем 2 мин рампе и отжига при температуре 55 ° С в течение 7 мин. Еще через 2 мин рампе, продлить при 72 ° С в течение 2 мин. Terminate ПЦР конечным удлинением при 72 ° С в течение 10 мин с последующим охлаждением до 4 ° С.
Примечание: ПЦР-продукты можно хранить при -20 ° С в течение 5 дней. - Для каждого запуска RS-PCR включают положительный контроль, т.е. образец с известным генотипом (обычно GTB), и отрицательный контроль (H 2 O).
4. Электрофорез
- Использование коммерческих миниатюрного набор для электрофореза ДНК (MED комплект) вместес Bioanalyzer, подключенного к ПК и установленного программного обеспечения. Внимательно изучите соответствующие инструкции изготовителя.
- Установите чип заливную станцию и отрегулировать шприц клип в соответствии с инструкцией изготовителя.
- Приготовить смесь гель-краситель в соответствии с инструкцией изготовителя.
- Загрузка смеси гель-краситель (в соответствии с инструкцией изготовителя).
- Равновесие смесь гель-краситель комнатной температуре в течение 30 мин перед использованием.
- Поместите новый чип ДНК на чипе заливочной станции. Пипетка 9 мкл гель-красителя в отчетливой G.
- Убедитесь, что поршень расположен в 1 мл, а затем закройте чип заливную станции. Нажмите плунжер до тех пор, пока удерживается шприцем клипа. Подождите, ровно на 30 секунд, затем отпустите шприц клип.
- Подождите в течение 5 сек. Медленно потяните поршень 1 мл положение.
- Открытый чип грунтование станция и пипетка 9 мкл гель-красителя в обеих скважинах отмечены 'G'.
- Загрузка Marker
- Пипетировать 5 мкл маркера во всех 12 образцов скважин и в лестнице хорошо. Не оставляйте какие-либо из этих 13 скважин пустые.
- Загрузка лестницы и образцов.
- Пипетка 1 мкл лестницы ДНК к хорошо со знаком лестницы.
- Пипетка 1 мкл образца (использованные лунки) или 1 мкл деионизованной воды (неиспользуемых скважин).
- Поместите фишку горизонтально в штекере и в вихре в течение 1 мин при 2400 оборотах в минуту.
- Запустите чип в Bioanalyzer в течение 5 мин.
- Выполнение анализа
- Запустите Bioanalyzer и подключенный компьютер. Откройте программное обеспечение.
- Откройте крышку Bioanalyzer и поместите чип в держатель чип (чип подходит только один путь). Осторожно закрыть крышку.
- В контексте инструментов программного обеспечения выберите "Электрофорез"> "дц"> "ДНК - 7500". Принять текущего префикса файла программного обеспечения или изменить его.
- Нажмите кнопку Пуск, присутствующей в программном обеспечении. Введите имена образцов в программном обеспечении. Когда чип запуска закончена (примерно через 30 мин) Конец Run сообщения появляется в программном обеспечении Bioanalyzer.
- Извлеките чип и очистить электроды Bioanalyzer в соответствии с инструкциями изготовителя.
5. Выведение генотипа из профиля электрофорез
- Загрузите программное обеспечение Mahal (программное обеспечение находится в свободном доступе у авторов).
- Импорт справочных данных в программное обеспечение Mahal: "Файл"> "Импорт справочных данных"
- Откройте электрофорез работать в контексте данных программного обеспечения Bioanalyzer. Выберите профиль электрофореза одного образца.
- Проверьте наличие соответствующих пиков.
- Используйте программное обеспечение Mahal, чтобы проверить наличие соответствующих пиков: "Инструменты"> "средняя флуоресценция". Вставьте в поле "флуоресцентный"значения флуоресценции обозначены как единицы флуоресценции (FU), поскольку они могут быть считаны с помощью программного обеспечения Bioanalyzer. Вставьте 4 (3) пики с самой высокой флуоресценции в порядке возрастания и разделены запятой. Пример: 126130132137.
Примечание: Если не все из этих пиков ФУ обозначены программным обеспечением Bioanalyzer, они должны быть оценены, читая их из сюжета.
- Используйте программное обеспечение Mahal, чтобы проверить наличие соответствующих пиков: "Инструменты"> "средняя флуоресценция". Вставьте в поле "флуоресцентный"значения флуоресценции обозначены как единицы флуоресценции (FU), поскольку они могут быть считаны с помощью программного обеспечения Bioanalyzer. Вставьте 4 (3) пики с самой высокой флуоресценции в порядке возрастания и разделены запятой. Пример: 126130132137.
- Нажмите кнопку "Рассчитать". Пик имеет значение, если наблюдаемая флуоресценция превышает значение, указанное в поле "минимальная высота пика".
- Infer генотип.
- Вставьте в Mahal текстовом поле "Input Пикс (BP)" размеры в п.н. всех соответствующих пиков в порядке возрастания и разделены запятой. Пример: 440.462.519.579.637.
Примечание: Если не все из этих пиковых размеров указаны программным обеспечением Bioanalyzer, они должны быть оценены, читая их из сюжета.
- Вставьте в Mahal текстовом поле "Input Пикс (BP)" размеры в п.н. всех соответствующих пиков в порядке возрастания и разделены запятой. Пример: 440.462.519.579.637.
- Нажмите кнопку "Рассчитать".
- В спискеокно, обратите внимание на минимальный квадрат расстояния Махаланобиса "D2m". Если соответствующее значение Р право на это ≥0.05 то вероятность ≥5% , что нулевая гипотеза Н 0 отвергается (Н 0: наблюдаемый и опорный профиль идентичны) , что означает , что наблюдаемый профиль принято быть идентичным опорный профиль указанного генотипа.
- Если D2m минимальна , но поле соответствующее значение P пусто, отвергают H 0 с вероятностью <5%.
Примечание: Это означает, что профили неравны хотя D2m минимальна. Такой результат может быть результатом без усредненных условий электрофореза.- Для коррекции этих отклонений, вставьте в текстовое поле "Наблюдаемый пик (п.н.)" значение 395 и нажмите кнопку "Рассчитать". Проверьте еще раз для минимального D2m и соответствующее значение P ≥0.05. Если не удается, попробуйте значения 405, 415, и 425.
Примечание: Иногда небольшие шаги дажеуказали. Если до сих пор не увенчались успехом, наблюдаемый профиль не присутствует в стандартных справочных данных, это может быть новый генотип или вариант.
- Для коррекции этих отклонений, вставьте в текстовое поле "Наблюдаемый пик (п.н.)" значение 395 и нажмите кнопку "Рассчитать". Проверьте еще раз для минимального D2m и соответствующее значение P ≥0.05. Если не удается, попробуйте значения 405, 415, и 425.
- Различные профили
- Повторите шаги 5.6 до 5.9 для каждого профиля отдельно электрофорез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Определение генотипа и его варианты
Электрофоретический профиль отличаясь более чем в одной группе из всех идентифицированных генотипов рассматривается как нового генотипа. Новые генотипы названы и расширены в соответствии с Fournier и др. 5 , ведущие к генотипов GTA ГТЦ, с последующим генотипов GTAA к GTAZ и GTBA к GTBZ и GTCA к GTCC в настоящее время . Изменение только в одной полосе рассматривается как генотипической вариант. Он показан с римскими цифрами с помощью верхнего индекса после того, как имя генотипа (например, GTRI, GTRII). В общей сложности, в настоящее время насчитывается 141 генотипов и варианты в базе справочных данных.
В условиях , описанных выше, RS-PCR - Фурнье и др. 5 является очень воспроизводимые к генотипу штаммов S. стафилококк. Окончательное определениеизвестный генотип или вариант всегда возможно, если технические проблемы могут быть исключены. Типичный результат представлен на рисунке 1 демонстрирует электрофорез 12 продуктов RS-PCR и представлены в режиме псевдо - гель с помощью программного обеспечения Bioanalyzer. Каждая полоса характеризуется рисунком из двух или более полос ПЦР и маркер полосы в передней и маркерной полосой на конце. Двойной щелчок в переулок открывает соответствующий, фактически измеренный электрофоретический профиль в отдельном окне. Программное обеспечение Bioanalyzer позволяет, помимо других возможностей, наблюдаемых пиков читается как размер в качестве флуоресцентных единиц ФУ (рисунок 2) или в пар оснований (рисунок 3) , причем один пик в точности соответствует одной полосы в режиме псевдо-гель. Пик чтения в ФУ требуется для оценки соответствующих пиков профиля в программном обеспечении Mahal (рисунок 4), чтение в п.н. для выводя генотип. Ненужные пиков определяются в программном обеспечении Mahal как небольшую горошинукс которых наблюдаемая флуоресценция ФУ ниже 40% от среднего геометрического 4 (3) пиков с самой высокой флуоресценции. Они , как правило , наблюдается , когда имеется избыток ДНК в RS-PCR (> 30 нг чистой ДНК / анализа) 2.
В качестве примера, генотип образца 211 , присутствующего в рисунке 1 выводится. Визуальный анализ электрофоретического профиля на рисунке 2 (Bioanalyzer программное обеспечение) и анализа с помощью программного обеспечения Mahal , используя инструмент для проверки несущественных пиков было обнаружено 6 соответствующих пиков с пиковыми размерами 395 б.п., 432 б.п., 453 б.п., 505 б.п., 567 б.п., и 622 пар оснований (рисунок 3). Эти значения заполняются и через запятую в текстовом поле "Input Пикс (п.н.)" программного обеспечения Mahal (Рисунок 4). Для коррекции отклонений приработанных Конкретнее, значение 415 был вставлен в текстовое поле "Наблюдаемый пик (п.н.)" (Рисунок 4). После нажатия "CКнопка alculate ", список представлен по заказу генотипа вместе с квадратом расстояния Махаланобиса D2m между запрошенной и указанного генотипической профиля. Прокрутите список в поисках минимальной D2m. В данном случае, минимальная D2m равна 4.499 (Рисунок 4) с значение P ≥0.05, а это означает, что запрашиваемый профиль не существенно отличается от одного из GTB.
Варианты генотипов обозначены как _I к _XV в программном обеспечении Mahal. В случае генотипа B, есть три варианта ББТ I, ББТ II, и III ББТ , обозначенные как b_i, B_II и B_III в программном обеспечении (рисунок 4).
Чип комплекта MED позволяет анализировать продукцию 12 RS-PCR в то время. Если меньше продукты доступны, остальные лунки должны быть загружены с помощью деионизированной воды. Результаты могут быть интерпретированы только в том случае управления ямикробатареях в RS-PCR являются подходящими.
Рисунок 1. Псевдо-гель , представляющий 12 продуктов RS-PCR и их выведенные генотипов. Двенадцать различных штаммов S. стафилококк анализировали с помощью RS-PCR с использованием набора MED вместе с Bioanalyzer и прилагаемого программного обеспечения. Полоса на левой стороне показывает маркер или "лестницы" для размера калибровки системы в Вр. На верхней части графика, имена образцов и соответствующие им генотипы были предъявлены обвинения , которые были получены с помощью программного обеспечения Mahal. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. электрофоретический профиль саmple 161 присутствует на рисунке 1. В верхней части пиков измеренная флуоресценции указанных в ФУ. Визуально различимые пики , которые не были обнаружены в связи с необходимостью Bioanalyzer программного обеспечения , чтобы оценить, прочитав их из сюжета , как в исполнении для пика с оценочной стоимостью флуоресценции 113 FU (синим цветом). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого цифра.
Рисунок 3. Электрофорезная профиль образца 211 настоящего на рисунке 1. В верхней части пиков их размер указанных в п.н.. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Снимок экрана программного обеспечения Mahal. В текстовом поле "Input Пикс (п.о.)" пиковые размеры образца 211 из рисунка 3 заполнены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Самый важный шаг всей процедуры, когда есть избыток ДНК в RS-PCR (> 30 нг чистой ДНК / анализа) 2. В общем, разрешение профиля является оптимальным, если все его пиков начинаются и заканчиваются в базовой линии. Если два пика слишком близко друг к другу, резолюция является неполной. В этих условиях, программное обеспечение Bioanalyzer может привести к неадекватной идентификации пика, так что требуется ручная идентификация.
Все явно разделены и соответствующие пики, выраженные в виде п.н. или ФУ включены для дальнейшего анализа. Слишком много ДНК-матрицы для RS-PCR приводит широких пиков и, следовательно, к пику перекрывающийся и нарушенную разрешение пиков. Кроме того, миграция происходит медленнее, что приводит к пику размеров, которые ложно увеличивается так, что генотип больше не могут быть выведены. И, наконец, количество несущественных пиков больше. Для профилей с более чем 3-х пиков, пик с максимальной флуоресценции обычно не должна превышать 150 ФУ.
Генотипирование с помощью RS-PCR, как описано ограничивается тем фактом, что инвестиции в машинах необходимо и требуется свободное программное обеспечение Mahal. На самом деле, стандартная машина ПЦР и Bioanalyzer необходимы. Первая из них является довольно дешевым в настоящее время в то время как последний является более дорогим. Разрешение электрофореза в агарозном основе не является достаточным, даже если используется высокое разрешение агарозы. В этих условиях вполне возможно провести различие между GTB, GTC и всех других генотипов. Затраты на электрофорезе с использованием набора MED или электрофорез в агарозном, однако, сходны. МЕД комплект вместе с Bioanalyzer дальнейшей обгоняет стандартный электрофорез в агарозном таким образом, что последний метод удобен, прямо вперед, и полученные данные присутствуют в электронном виде, что упрощает хранение и дальнейший анализ значительно. В принципе все коммерчески доступные bioanalyzers подходят для такого рода анализа при условии, что electrophoretРазрешение IC является адекватным и полученный размер полос, является точной и объективной.
Разрешение RS-PCR для бычьих штаммов S. стафилококк высока. Это же хорошо , как спа набора текста, и лучше , чем MLST и PFGE 4,14. Кроме того, по сравнению со всеми другими методами набора текста , обычно используемых для субтипирования S. стафилококк (спа - типирование, MLST, PFGE), его пропускная способность образца высока: извлечение ДНК легко и быстро, 96 образцов могут быть обработаны в один прогон RCR (обычно O / N) и электрофореза и генотип выводя прямо вперед. Полный анализ 96 образцов требует одну ночь для ПЦР и один день для электрофореза и оценки. Другие преимущества RS-PCR по Fournier и др. , 2 являются низкие затраты, особенно по сравнению с MLST , который требует семь генов секвенировать в обоих направлениях 15. Кроме того, РС-ПЦР является единственным методом прогнозирования contagiosity и патогенность штаммовS. стафилококк участвует в мастита крупного рогатого скота 2,5, ключевые предсказателей в клинической ветеринарной медицины. Наконец, RS-PCR в одиночку достаточно исследовать эпидемиологию крупного рогатого скота S. стафилококк 3,4,5,14. Интерпретация данных прямо вперед , даже в международном контексте , как всего лишь несколько основных генотипов наблюдаются 2,3. Для эпидемиологических сравнений между бычьих и человеческих штаммов, RS-PCR и спа набора текста вместе являются более предпочтительными , поскольку последний метод широко используется для подтипов штаммов человека так , что много данных доступно. MLST, однако, пригоден для оценки клональности штаммов 15 и для филогенетического анализа 4.
Для устранения неполадок в отношении термоячейке ПЦР, MED, набор и Bioanalyzer, соответствующие руководства должны быть проведены консультации. В случае метода RS-PCR, процедура поиска неисправностей в широком масштабе упрощен, если соответствующие положительный и отрицательный контроль ПЦР Included в каждом цикле. Если положительный контроль является отрицательным, то смесь ПЦР должным образом не состоит и / или ДНК контроль был деградировали. Если отрицательный контроль (H 2 O) генерируется один или несколько полос, смесь ПЦР была загрязнена с некоторыми ДНК. В обоих случаях, профили не должны быть истолкованы и РС-ПЦР должен быть повторен. Если интерпретация невозможна из-за электрофоретического проблемы, электрофорез необходимо повторить с помощью нового чипа. Электрофорезное проблемы, как правило, характеризуются неадекватной миграции и выравнивания одного или обоих диапазонов маркеров в результате ненадлежащего нагрузки и манипулирование чипа. Если полученный профиль электрофорез не может быть интерпретирован программным обеспечением Mahal, файл профиля генерируется программой Bioanalyzer направляется автору для дальнейшей оценки. Как правило, слишком много матричной ДНК использовали для RS-PCR или профиль представляет собой новый генотип или генотипической вариант.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Merck | 1.08382.0500 | Mw = 121.14 g/mol |
| Titriplex III | Merck | 1.08418.0250 | Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O |
| Hydrochloric acid 5 mol/L | Merck | 1.09911.0001 | |
| Columbia agar+5% sheep blood | bioMérieux | 43049 | |
| Agilent DNA7500 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Agilent 2100 expert sofware | Agilent Technologies | ||
| HotStarTaq master mix | Qiagen | 203445 | |
| Primer L1 | Mycrosinth | 5'CAA GGC ATC CAC CGT3' | |
| Primer G1 | Mycrosinth | 5'GAA GTC GTA ACA AGG3' |
References
- Sears, P. M., McCarthy, K. K. Management and treatment of staphylococcal mastitis. Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).
- Fournier, C., et al. Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome. Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).
- Cosandey, A., et al. Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries. J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).
- Boss, R., et al. Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer. J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).
- Graber, H. U., et al. Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties. J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).
- Heiniger, D., et al. Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben. Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).
- Hamann, J. Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition. IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).
- Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea. J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).
- Sakwinska, O., et al. Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley. Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).
- Rabello, R. F., et al. Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds. J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).
- Tavakol, M., et al.
- Harmsen, D., et al. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).
- Zadoks, R., et al. Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates. J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).
- Cremonesi, P., et al. Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows. J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).
- Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).
