G 단백질 선택적 G​​PCR의 입체는 라이브 셀 서스펜션 형광 분석에서 FRET 센서를 사용하여 측정

요약

G 단백질 결합 수용체에 의한 G 단백질의 선택적 활성화를 감지하는 간단한 방법은 세포 신호 전달에서 뛰어난 과제로 남아 있습니다. Fӧrster 공명 에너지 전달(FRET) 바이오센서는 GPCR을 G 단백질 펩타이드에 쌍으로 연결하여 살아있는 세포의 제어된 농도에서 구조적 변화를 조사하는 방식으로 개발되었습니다.

초록

Fӧrster 공명 에너지 전달 (FRET)을 연구 GPCR 시그널링 조사 점차 일반화되고있다 기반. 우리의 연구 그룹 Gα 서브 유닛과 아고 니스트 자극 다음 생균의 GPCR의 상호 작용을 검출하기위한 분자 내 FRET 센서를 개발했다. 여기서는 상세히 100 μM의 이소 염산염으로 처리시 β ₂ 아드레날린 수용체 및 Gαs C 말단 펩티드 사이의 FRET의 변화를 검출하기위한 프로토콜은 이전에 ^하나의 특징으로서. 우리의 FRET 센서는 전체 길이 GPCR하는 FRET 수용체 형광 (mCitrine)의 직렬로 구성된 하나의 폴리펩티드이며, 응급실 / K 경련 (체계적인 단백질 친 화성 강도 변조) 링커하는 FRET 기증자 형광 (mCerulean) 및 Gα C 말단 펩티드. 이 프로토콜 것이다 상세 세포 준비, 형질 전환 조건, 장비 설치, 분석 실행 및 데이터 분석. 이 실험 설계는 작은 채널을 검출FRET Anges의 단백질 - 단백질 상호 작용을 나타내는, 또한 리간드 GPCR-G 단백질 쌍들에 걸쳐 상호 작용의 세기를 비교하기 위해 사용될 수있다. 신호대 우리의 측정을 향상시키기 위해,이 프로토콜은 모든 단계에서 높아진 정확도를 요구하고, 재현성이 실행 가능하도록 여기에 제시된다.

서론

G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)는 일곱 횡단 수용체이다. 인간 게놈 혼자 빛, 냄새 물질, 호르몬, 펩티드, 약물 및 다른 작은 분자를 포함하는 리간드의 다양한에 의해 활성화 된 GPCR, 코딩 약 800 유전자를 포함하고 있습니다. 시장 대상의 GPCR에 현재 모든 의약품의 약 30 %가 많은 질병 상태 ^2에서 큰 역할을하기 때문이다. 이 수용체 가족에서 수행 광범위한 작업의 수십 년에도 불구하고, 특히 GPCR 이펙터 상호 작용을 유도 분자 메커니즘에 관해서, 분야에서 상당한 뛰어난 질문이 남아있다. 지금까지 단 하나의 고해상도 결정 구조가 β ₂ 아드레날린 수용체 (β _2-AR)과 G 단백질 ⁽³⁾ 사이의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공 간행되었다. 함께 지난 30 년의 광범위한 연구와 함께,이에 중요한 하나의 특정 구성 요소를 반복한다상호 다음 Gα 서브 유닛 C 말단. 이 구조는 GPCR ⁴ G 단백질 선택 ^5-6 모두에 의해 G 단백질의 활성화를 위해 중요하다. 따라서, Gα C 말단은 GPCR의 리간드 자극에 선택적 G​​ 단백질의 활성화 사이의 중요한 링크를 제공합니다.

지난 10 년간 연구 된 GPCR....

프로토콜

1. DNA 준비

1. 디자인 센서 모듈 클로닝 기법을 사용하여 구성한다. 이전 ¹ 설명 된 β _2-AR 센서 설계를 참조하시기 바랍니다.
2. 1.9, ₂₆₀ / 2.0의 ₍₂₃₀₎ - - 2.29, ₂₆₀ / 1.7의 ₂₈₀ 상업 미니 프렙 키트 프로토콜에 따라 DNA를 준비하고 농도 ≥에서, 2 mM 트리스 - 염산 용액의 pH 8에 750 NG / μl를 용출.

2. 세포 배양 준비

1. 보충 된 4.5 g / L D- 글루코스를 함유하는 DMEM에서 배양 HEK-293T-FLP-N 세포를 10 % FBS (열 불 활성화) (V / V), 1 % L- 글루타민 보충하는 20 mM HEPES, pH가 7.5 37에서 5 % CO _2에서 가습 분위기에서 C를 °. 다음 단계에 대한 생물학적 안전 후드 세포를 처리합니다.
2. 세포가 여섯 잘 요리에 계대 전에 합류 단층로 성장할 수 있습니다. 컨 플루을 달성하기 위해 시간은 초기 도금 밀도에 따라 달라집니다. 사용 플레이트 그(1) 내의 포화 상태에 올 -에....

결과

실험의 일반화 된 도식 설정 및 실행은 그림 3에 자세히 설명되어 있습니다.

센서의 좁은 다이나믹 레인지의 FRET의 변화를 검출하기 위해, 부착되는 시스템의 뉘앙스에 부착하는 것이 중요하다. 셀 품질이 샘플링에서 단백질 발현뿐만 아니라 일관성에 필수적입니다. 최적 일관성 단층 (10X)에서 성장 배양 된 세포의 1 기능의 이미지를 그림 여섯 잘 도금과에 대한 형질 그림 1 (a)에 응집되어 패턴에서 성장 세포 수지상 모양에 그 리드 일관된 도금을하지 않는 것이 좋습니다 1의 (b)를 그림. 형질 전환 조건은 재생 가능한 발현을 달성하기 위해 최적화 될 수있다. 여러 조건이 여기에 사용 권장 형질 전환 시약에 최적화되어있다. 표 1 상세 감소 혈청 미디어에 대한 이러한 조건. DNA 및 형질 정말.......

토론

이 시스템 FRET 측정 타이트 동적 범위는이 프로토콜의 모든 단계에서 중요한 품질 관리의 필요성을 강화한다. 성공적인 FRET 실험을 보장하기 위해 가장 중요한 단계는 분석을 실행하는 동안 1) 세포 배양, 2) 형질 3) 단백 발현 및 4) 적시 정밀한 조정한다.

셀 건강 관리 / 도금 품질이 불가능 FRET 어떤 일관된 변화를 검출 할 수있는 실험 시스템 불량 셀 건강의 신호 - 대 - 잡음에 상당한 영향을 미칠 수있다. 이는 세포주, 처리 및 배양 조건에 따라 달라질 수 있지만 보수적으로, 세포는 약 20 대 건강한 통로이다. 세포가 일단 어려움 합류 단층으로 성장 이상의 돌기 패턴 실험 배경 노이즈가 저하 될 것이다 (도 1 (b)를 참조)에 지속적으로 성장하기. 일상 메디칼을 포함하여 조심 세포 유지 보수,유지 플레이트에서 비 부착 세포 파편 제 거부 변경 정기적는 6 웰 도금 및 형질 세포에 대한 품질을 개선한다. 나쁜 형질 전환 효.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
B2-AR-10 nm-가스 펩타이드 센서	Addgene	47438	https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/
GeneJET 플라스미드 Miniprep Kit	Fermentas/Fisher Sci	FERK0503	2mM Tris 용출 완충액
HEK-293T-Flp-n 세포	Life Technologies	R78007
트립신(0.25%)	Life Technologies	25200056
DMEM- 고 포도당	Life Technologies	11960-044	따뜻한 in  37 ° C 사용 전 수조
FBS, 인증, 열 비활성화, 미국 원산지	Life Technologies	10082147
Glutamax I 100x	Life Technologies	35050061
HEPES	Corning	MT25060CL
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	감소 혈청 매체;
XtremeGene HP 트랜스펙션 리에이지넷	Roche	6366236001	. 일관성을 위해 적극 권장됩니다. 사용 전에 RT로 가져오세요
FluorMax: 4	Horiba		FluorEssence V3.8 소프트웨어와 함께 사용
3mm 경로 길이 석영 큐벳	Starna	NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)	광측정기에서 사용하려면 큐벳 홀더/어댑터가 필요할 수 있습니다. Starna
Sc100-S3 가열 순환 수조 펌프	Fisher Scientific	13-874-826	to 37 ° C 사용 전
Thermomixer Heat Block	Eppendorf	22670000	Warm to 37 ° C 사용 전
초순수 DNA/RNAse 자유 물	Life Technologies	10977015	RT
D(+)-포도당, 무수	Sigma	G5767
소 폐의 아프로티닌	Sigma	A1153
leupeptin hemisulfate	EMD	10-897
L-아스코르브산, 시약 등급	Sigma	A0278
(-)- 이소프로테레놀(+)-비트타르타르산	염 시그마	I2760	각 실험마다 신선한 분취액 사용

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