Abstract
Fӧrster transfert d'énergie par résonance (FRET) à base d'études ont de plus en plus courante dans l'enquête de la signalisation GPCR. Notre groupe de recherche a développé un capteur de FRET intra-moléculaire pour détecter l'interaction entre les sous-unités et les GPCR dans des cellules vivantes après stimulation agoniste Ga. Ici, nous détaillons le protocole pour la détection des changements dans le FRET entre le β 2 adrénergiques et l'extrémité C-terminale Gas peptide lors d'un traitement avec du chlorhydrate d'isoprotérénol 100 uM comme précédemment caractérisé 1. Notre capteur de FRET est un polypeptide constitué en série d'un GPCR de longueur totale, un fluorophore accepteur de FRET (mCitrine), un ER / K SPASME (affinité de la protéine systématique force modulation) de liaison, un fluorophore FRET donneur (mCerulean), et une Ga C peptide -terminale. Ce protocole sera la préparation détaillée de la cellule, les conditions de transfection, la configuration de l'équipement, l'exécution de l'essai et l'analyse des données. Cette conception expérimentale détecte petite changes de FRET indiquant des interactions protéine-protéine et peut également être utilisé pour comparer la force de l'interaction entre les ligands et le GPCR-G paires de protéines. Pour améliorer le rapport signal-bruit dans nos mesures, ce protocole exige une précision accrue dans toutes les étapes, et est présenté ici pour permettre l'exécution reproductible.
Introduction
G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) sont des récepteurs à sept domaines transmembranaires. Le génome humain contient environ 800 seuls les gènes codant pour des GPCR, qui sont activés par une variété de ligands, y compris la lumière, des agents odorants, des hormones, des peptides, des médicaments et d'autres petites molécules. Près de 30% de tous les produits pharmaceutiques actuellement sur les RCPG cibles du marché , car ils jouent un rôle important dans de nombreux états pathologiques 2. Malgré des décennies de travail considérable effectué sur cette famille de récepteurs, il reste des questions en suspens importantes dans le domaine, en particulier en ce qui concerne les mécanismes moléculaires qui conduisent les interactions GPCR-effectrices. À ce jour, une seule structure cristalline à haute résolution a été publiée, donnant un aperçu de l'interaction entre le β 2 adrénergiques (β 2 -AR) et la protéine Gs 3. En collaboration avec des recherches approfondies au cours des trois dernières décennies, il réitère une composante structurelle spécifique qui est essentiel dans cel'interaction: la sous-unité Ga C-terminale. Cette structure est importante tant pour activation des protéines G par le GPCR 4 et G sélection de protéines 5-6. Par conséquent, le Ga C-terminale fournit un lien essentiel entre la stimulation du ligand de GPCR et l'activation de la protéine G sélective.
Recherche au cours de la dernière décennie suggère que les GPCR peuplent un vaste paysage conformationnel, avec la liaison ligand-stabilisation des sous-ensembles de conformations GPCR. Bien que plusieurs techniques, incluant la cristallographie, la RMN et la spectroscopie de fluorescence, la spectrométrie de masse sont disponibles pour examiner le paysage conformationnel GPCR, il existe peu d'approches pour élucider leur signification fonctionnelle dans le choix des effecteurs 7. Ici, nous décrivons un Fӧrster transfert d'énergie par résonance (FRET) approche à base de détecter G conformations GPCR protéine-sélective. FRET repose sur la proximité et de l'orientation parallèle de deux fluorophores avec chevauchement des émissions (donneur) ae excitation (accepteur) spectres 8. Étant donné que les fluorophores donneur et accepteur sont rapprochés à la suite de chaque changement conformationnel dans la protéine ou une interaction protéine-protéine, le FRET entre eux augmente, et peut être mesurée en utilisant une variété de méthodes 8. Biocapteurs FRET ont été utilisés largement dans le domaine GPCR 9. Ils ont été utilisés pour sonder des changements de conformation dans le GPCR en insérant le donneur et accepteur dans la troisième boucle intracellulaire et RCPG extrémité C-terminale; les capteurs sont conçus pour sonder le GPCR et les interactions effectrices par marquage séparément le GPCR et effecteur (G sous - unités protéiques / arrestine) avec une paire de FRET 10; certains capteurs détectent également les changements conformationnels dans la protéine G 11. Ces biocapteurs ont permis le terrain pour poser une multitude de questions en suspens , y compris des changements conformationnels dans le GPCR et effecteur, GPCR-effectrices cinétiques d'interaction, et les ligands allostériques 12. Notre groupea été particulièrement intéressé par la création d'un biocapteur capable de détecter G conformations GPCR spécifiques de la protéine dans des conditions conduit agoniste. Ce biocapteur repose sur une technologie développée récemment nommée SPASM (systématique force modulation des protéines d'affinité) 13. SPASM implique tethering interagissant domaines protéiques en utilisant un ER / K lieur, qui contrôle leurs concentrations efficaces. Débordement l'éditeur de liens avec une paire de fluorophores FRET crée un outil qui peut signaler l'état de l'interaction entre les protéines 12. Auparavant 1 le module SPASM a été utilisé pour attacher le Ga C-terminale à un GPCR et de surveiller leurs interactions avec les fluorophores FRET, mCitrine (appelé dans ce protocole par sa variante communément connu, Jaune Fluorescent Protein (YFP), excitation / pic d'émission à 490/525 nm) et mCerulean (dénommé dans le présent protocole par sa variante communément appelé Cyan fluorescent Protein (PCP), excitation / pic d'émission 430/475 nm). A partir de N- à C-terminale, tson polypeptide unique codé génétiquement contient: une pleine longueur GPCR, FRET accepteur (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K linker, donneur de FRET (mCerulean / CFP), et le peptide Ga C-terminale. Dans cette étude, les capteurs sont abrégés comme agent de liaison de GPCR-longueur Ga peptide. Tous les composants sont séparés par un non structurée (Gly-Ser-Gly) 4 segment de liaison qui permet une rotation libre de chaque domaine. La caractérisation détaillée de ces capteurs a déjà été réalisée en utilisant deux GPCR prototypiques: β 2 -AR et opsin 1.
Ce capteur est transfecté de manière transitoire dans des cellules HEK-293T et en temps réel des expériences cellulaires mesure des spectres de fluorescence en fonction du fluorimètre, de la paire de FRET en unités arbitraires de coups par seconde (CPS) en présence ou en absence de ligand. Ces mesures sont utilisées pour calculer un ratio de FRET entre les fluorophores (YFP max / CFP max). Un changement de FRET (ΔFRET) est ensuite calculée en soustrayant le ratio moyen de FRETdes échantillons non traités à partir du rapport de FRET d'échantillons de ligand traitée. ΔFRET peut être comparé à travers des constructions (β 2 -AR-10 nm-peptide par rapport ß Gas 2 -AR-10 nm-no peptide). Ici, nous détaillons le protocole d'exprimer ces capteurs dans des cellules vivantes HEK-293T, surveiller leur expression, et la configuration, l'exécution et l'analyse des cellules vivantes à base fluoromètre-FRET mesure pour non traité contre les conditions traitées par le médicament. Alors que ce protocole est spécifique pour le capteur de peptide β nm Gas 2 -Ar-10 traitées avec 100 uM d' isoprotérénol bitartrate, elle peut être optimisée pour les différentes paires de GPCR-Ga et des ligands.
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Protocol
1. Préparation de l'ADN
- capteur de design construit en utilisant un schéma de clonage modulaire. S'il vous plaît référence à la conception du capteur β 2 -AR détaillé précédemment 1.
- Préparer un ADN selon l' une commerciale protocole du kit miniprep et éluer dans une solution 2 mM de Tris-HCl, pH 8, à une concentration ≥ 750 ng / pl, A 260 / A 280 de 1/7 à 1/9, A 260 / A 230 de 2,0 à 2,29.
2. Culture cellulaire Préparation
- La culture des cellules HEK-293T-Flp-n cellules dans du DMEM contenant 4,5 g / L de D-glucose, supplémenté avec 10% de SVF (inactivé par la chaleur) (v / v), 1% de L-glutamine supplément, HEPES 20 mM, pH 7,5 à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO 2. Manipuler les cellules dans la hotte de sécurité biologique pour les étapes suivantes.
- Laisser les cellules se développent à une monocouche confluentes avant repiquage dans des boîtes à six puits. Temps pour atteindre la confluence dépend de la densité de placage initial. Utiliser des plaques quivenir à la confluence dans 1 - 2 jours de plaquage pour six puits de placage. Un plat confluentes tissu 10 cm culture traitée présente une densité cellulaire d'environ 4 x 10 6 cellules / ml. Voir la figure 1 pour l' image de la croissance de la culture cellulaire.
- Laver les cellules avec 10 ml de PBS, et trypsiniser avec 0,25% de trypsine (voir Discussion, paragraphe 2). Planche 8 x 10 5 cellules / puits dans 2 ml de milieu de culture de tissus traités six plats bien et laissez adhérer pendant 16 - 20 h.
3. Conditions Transfection
- Décaler transfections pour les constructions qui peuvent nécessiter des quantités différentes de temps pour atteindre une expression optimale (entre 20 - 36 h). Synchroniser les conditions pour un temps d'expérience unifiée. ont également un contrôle non transfectées ainsi à une densité cellulaire équivalente à utiliser pour le bruit de fond et de la diffusion soustraction lors de l'analyse.
- Amener les réactifs de transfection à la température ambiante: les médias sériques réduits, l'ADN, réactif de transfection.
- Dans unhotte de sécurité biologique combiner des réactifs dans un tube à centrifuger stérile dans l'ordre suivant: mélanger 2 pg d'ADN avec 100 pi réduit de médias de sérum. De Spike 6 pi de réactif de transfection dans les médias / ADN mix sans surface du mélange ou du côté du tube toucher. Mettre en place une réaction de transfection par puits. les conditions de transfection peuvent être optimisés (1 - 4 pg d'ADN, 3 - 6 ul de réactif de transfection) pour atteindre des niveaux d'expression compatibles. Voir le tableau 1 pour des rapports plus optimisés.
- Incuber mélange à la température ambiante dans la hotte de sécurité biologique pendant 15 - 30 min. Ne pas utiliser la réaction si on les laisse incuber pendant plus de 30 min.
- Ajouter réaction à des cellules d'une manière goutte à goutte à travers bien et secouez doucement six puits pour assurer un mélange complet. Ajouter une réaction par puits.
- Après 20 h d'expression, de surveiller la fluorescence en utilisant la culture de tissus microscope à fluorescence. Évaluer l'expression de la population avec 10X localisation objective et de protéines dans une cellule à 40X. observe pour l'expression de protéine à la membrane plasmique (PM). Si intériorisation substantielle est noté, surveiller la transfection jusqu'à expression significative est détectée au PM.
4. Préparation des réactifs et équipement
- Préparer 100 mM stocks de médicaments et conserver à -80 ° C: bitartrate isoprotérénol (100 mM dans dH 2 O contenant mM d' acide ascorbique 300). Faire de la glace / dans la chambre froide, et le flash-gel immédiatement. Aliquotes peuvent être fabriqués et utilisés jusqu'à un an.
- Préparer cellule tampon (~ 2 ml / condition) et stocker dans un bain d'eau C 37 °. Faire frais chaque jour. Tableau de référence 2 pour cellulaires constituants tampons.
- Préparer le tampon de drogue (10 ml) et stocker à température ambiante. Tableau de référence 2 pour les constituants tampons médicaments.
- Acid lavage des cuvettes en utilisant du HCl concentré. Neutraliser avec une base faible (1 M KOH), et laver soigneusement avec cuvettes dH 2 O.
- Préparer la station de travail autour de fluoromètre avec plusieursboîtes de 10, 200 et 1000 conseils ul de pipette, une minuterie réglée avec un compte à rebours de 10 min, une ligne de vide accessible avec des conseils pour le nettoyage de la cuvette, lingettes de tâches délicates, et gicler bouteille avec ultrapure H 2 O.
- Chauffer un bain d'eau externe pour fluorimètre et la chaleur bloc à 37 ° C.
- Allumez fluoromètre; définir le programme de collecte de fluorescence pour la collecte de la PCP à l'excitation 430 nm, bande passante 8 nm; plage d'émission de 450 nm - 600 nm, bande passante 4 nm. Pour la collecte YFP seulement comme le contrôle du capteur (voir Discussion) ensemble excitation à 490 nm, bande passante 8 nm, plage d'émission 500 - 600 nm, bande passante 4 nm. paramètres de collecte de la PCP seront utilisés pour acquérir un spectre de FRET dans cette expérience.
- Placer douze 1,5 ml microtubes dans le bloc thermique , comme illustré sur la figure 2 ci - dessous. Ces tubes sont des supports pour tubes aliquotes de cellules (tubes à centrifuger 500 pi.) Placer un petit morceau de tissu dans des supports 1 et 7 pour amortir les cuvettes placées ici.
Remarque: Utilisez des cuvettes séparées pour connaître l'état non traité et de l'état de la drogue pour éviter la contamination croisée.
Figure 2. Microcentrifugeuse Tube Set Up et position de référence dans la chaleur Bloc Cuve pour les échantillons non traités est en position 1. tubes aliquotes de cellules sont en positions 2 - 6. Cuve pour les échantillons traités par le médicament est en position 7; tubes aliquotes de cellules sont dans des positions 8 - 12. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Remplir les porteurs 2 - 6 et 8 - 12 ~ avec 750 ul d'eau pour créer un mini-bain de 37 ° C de l'eau.
- Placez dix 500 microtubes pi pour aliquotes de cellules dans des bains mini-eau (porte 2 - 6, 8 - 12). Chaque tube sera une répétition individuelle de la condition (5 untreated, 5 traité par le médicament).
- Surveiller les cellules d'expression (voir étape 3.6).
5. Expérience et collecte de données
Figure 3. Schéma expérimental. Un guide étape par étape détaillé expérimental mis en place et de l' exécution. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Référence Figure 3 pour schéma expérimental. Lorsque les cellules sont prêtes à être récoltées, sur la base de l'expression de protéine détectée avec un microscope à fluorescence (voir Discussion, paragraphe 4): dans la hotte de sécurité biologique, retirez délicatement ~ 1 ml de milieu, remettre les cellules dans leur culture avec un P1,000 et transfert resuspension dans un tube de 1,5 ml.
Remarque: Évitez d'utiliser la trypsine comme il peut digérer l'extrémité N-terminale et /ou dans la poche du capteur GPCR liant. - Compter les cellules pour assurer la densité cellulaire appropriée en resuspension. Optimiser le volume de remise en suspension 4 x 10 6 cellules / ml.
- Spin cellules dans oscillante Centrifugeuse à la température ambiante, 290 g pendant 3 min. Retirer le surnageant après la centrifugation.
- Cellules DOUCEMENT resuspendre dans 1 ml cellule tampon (stocké à 37 ° C) et répétez l' étape 5.3. Au cours du deuxième tour, recueillir 100 mM stock de médicaments aliquote de -80 ° C. Faire dilution 1: 100 dans le tampon de médicaments pour 1 mM de travail et maintenir à température ambiante.
- Après la seconde centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules doucement dans 1 ml de tampon de cellules (4 x 10 6 cellules / ml). Mesurer la DO 600 de l'échantillon dans le spectrophotomètre en utilisant 1 ml de cellules et de 1 ml d' une cellule tampon comme un blanc. Distribuer les cellules dans une cuvette en plastique jetable et transfert à un tube à centrifuger immédiatement après spectrophotométrie.
- Pour une commande de cel non transfectéesl état du spectre, resuspendre délicatement les cellules non transfectées dans 1 ml cellule tampon avec P1,000 pipette, ajouter 90 ul de cellules à cuvette et acquérir le spectre FRET à excitation 430 nm, bande passante 8 nm, émission 450-600 nm, bande passante 4 nm. Collecter 3 - 5 spectres de répétition avec frais de 90 pi de cellules. Gardez stock de cellules à 37 ° C entre les spécifications, resuspendre doucement avec P1,000 entre chaque échantillon aliquote, et rincer avec cuvette ultrapure H 2 O entre les échantillons.
- Pour des conditions expérimentales aliquotes de 90 ul des cellules transfectées à chacun des tubes de 500 ul dans des supports 2 - 6, 8 - 12 dans le bloc thermique. Resuspendre doucement stock de cellules avec P1,000 pipette entre chaque aliquote.
- Après que les cellules sont aliquotées, ajouter 10 ul de tampon de médicaments aux tubes 2 - 6 pour des échantillons d'état non traitées.
- Commencez l'expérience en ajoutant 10 pi de solution de médicament 1 mM dans le tube 8, démarrer la minuterie compte à rebours de 10 min, et doucement le tube mélanger avec P200 pipette. Fermer le tube et le retour à 37° C bloc thermique.
- ramasser immédiatement tube 2, mélanger doucement avec P200 (utiliser une nouvelle pointe), ajouter 90 ul de suspension cellulaire à l'état non traité cuvette, et le placer dans fluoromètre.
- Acquérir spectre FRET à excitation 430 nm, bande passante 8 nm, émission 450-600 nm, bande passante 4 nm.
- A 9 min - 10 sec, spike tube 9 avec 10 pi de solution médicamenteuse 1 mM, mélanger délicatement avec un P200 (utiliser une nouvelle pointe), et le tube pour chauffer le bloc de retour.
- Répétez les étapes 05.10 à 05.11 avec le tube 3 et 5.12 avec le tube 10.
- Répétez les étapes 5,10 à 5,13 à des intervalles de 1 minute (8:10, 7:10, etc.) jusqu'à ce que les spectres sont collectées pour tous les échantillons de condition non traités, et le médicament a été ajouté à tous les échantillons de l' état des médicaments. Utilisez une nouvelle astuce pour chaque étape de la pipette pour éviter la contamination croisée.
- A 5 min - 10 sec, commencer à mélanger tube 8 (condition de la drogue) doucement avec P200 pipette, ajouter 90 ul de suspension cellulaire à cuvette séparée pour la drogue échantillon traité et dans fluoromètre.
- Acquérir Fspectre de RET (voir l'étape 5.11 pour les réglages).
- Répétez les étapes 05.15 à 05.16 à des intervalles de 1 minute (4:10, 3:10, etc.) pour encore état de drogue échantillons (tubes 9 - 12).
- Après la fin de l' expérience, enregistrer des fichiers de projet, laver à fond avec cuvettes ultrapure H 2 O, et repeupler tubes pour connaître l' état suivant. Prenez soin d'éviter la contamination croisée dans l'étape de lavage. Changer la pointe de la O bouteille H 2 ainsi que sur la ligne de vide entre les lavages.
Analyse 6. Données
- Sauvegardez et fichiers de données d'exportation dans la CPS format à utiliser pour l'analyse. programmes d'analyse sont disponibles pour téléchargement à partir du site publication Sivaramakrishnan Lab.
- Créer des fichiers de chemin d'accès pour le logiciel d'analyse qui comprennent les programmes d'analyse (v9, v15), les fichiers échantillons non transfectées (voir étape 5.6 pour la collecte du spectre de cellules non transfectées), fichier de données de sortie, et les valeurs séparées par des virgules fichiers (CSV) pour la saisie des données.
- Entrez les informations suivantesdans un fichier CSV (voir exemple dans le tableau 3) et désigner les conditions respectives pour chaque échantillon, y compris:
Nom du fichier - fichiers graphiques SPC individuels
Récepteur - désigné qui GPCR construction a été testée (par exemple, Β2)
Liant - qui désignent la variante de peptide de la construction a été testée (par exemple, S)
Agonist - désigner non traitée (N) ou traités par le médicament (D) conditions
De noms - le dossier de chemin dans lequel les fichiers SPC sont enregistrés, généralement organisés par date
OD - enregistrée densité optique de l'échantillon de spectrophotomètre - Entrez les noms de fichiers pour les échantillons non transfectées (étape 5.6) pour soustraire le tampon et le bruit de diffusion à partir d'échantillons.
- Entrez les conditions dans le programme d'analyse.
- Exécuter des programmes pour analyser des échantillons à l'intérieur des conditions individuelles (v9) et à travers des conditions (v15).
- Exclure les fichiers échantillons qui sont aberrantes apparentes dans l'ensemble de données, ou d'ajuster pour la soustraction en augmentant ou en diminuant la valeur de DO de individouble fichiers.
- Exporter des données vers le fichier de sortie pour l'accès à calculer FRET rapports (525 nm / 475 nm).
- Calculer ΔFRET en soustrayant le taux de FRET moyen pour connaître l'état non traité à partir des rapports de FRET individuels pour traités conditions (de drogue).
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Representative Results
Un schéma généralisé de l'expérience mise en place et l' exécution est détaillée dans la figure 3.
Afin de détecter un changement de FRET dans la plage dynamique étroite du capteur, il est essentiel de respecter les nuances du système être respectées. La qualité cellulaire est impératif d'expression de la protéine ainsi que la cohérence dans l' échantillonnage. Figure 1 Caractéristiques des images de cellules cultivées en croissance dans une monocouche cohérente (10X) qui est optimale pour six puits de placage et de transfection Figure 1 (a) et les cellules en croissance dans les modèles agglutinés qui conduisent à des formes dendritiques Figure 1 (b) qui ne sont pas recommandé pour le placage cohérente. les conditions de transfection peuvent également être optimisées afin d'obtenir une expression reproductible. Plusieurs conditions ont été optimisées pour le réactif de transfection recommandé utilisé ici. Le tableau 1 détaille ces conditions pour les médias sériques réduits. ADN et transfection rearatios gent.
Une fois que toutes les données ont été recueillies et les données saisies dans le fichier CSV pour une analyse (voir exemple dans le tableau 3), les résultats générés ressembleront les données spectrales brutes FRET représentées sur la figure 4 (a) et normalisée, moyenne FRET spectres présentés dans la figure 4 (b). Dans la figure 4 , les spectres rouges sont les échantillons non traités et le bleu sont les échantillons traités par le médicament. Tous les spectres Raw FRET à la figure 4 (a) ont suffisamment plage signal-bruit pour l' analyse des données cohérentes (ie., CPS à 450 nm par rapport à la SCP à 475 nm). Avec cette gamme, les spectres sont plus lisses et le pic de l'eau de l'échantillon (Raman pic est à 500 nm) est également minime. faibles niveaux d'expression conduisent à un pic d'eau importante qui interfère avec l'analyse des données. Les données sont normalisées à 475 nm, le réglage de la SCP de cette valeur à 1,0 (figure 4 (b)). Dans cet ensemble de données pour la β 2 -AR-10 Capteur de peptide nm-Gas, il y a un changement significatif au 525 nm lisant entre non traité (rouge) et traités (bleu) échantillons. Le changement de ΔFRET est calculé à partir des rapports de FRET (525 nm / 475 nm) de ces ensembles de données et sont accessibles par l'intermédiaire du fichier de sortie.
Si l' expression des protéines est faible, il y a une faible efficacité de transfection, ou une faible densité de cellules dans la cuve pour la lecture de fluorescence, les spectres peuvent apparaître plus bruyants, comme représenté sur la figure 5. Par rapport à la figure 4 (a) , la plage de signal sur bruit pour cette ensemble de données ne sont pas idéales, à environ 1,0 -. 1.6, avec CPS max de 4 x 10 5 Ce faible niveau d'expression contribue aux spectres déchiquetée vu dans la Figure de données brutes 5 (a), mais les données sont serrés et en mesure d'être Figure normalisée 5 (b). Bien que les pics d'eau (~ 500 nm) ne correspond pas complètement entre les ensembles de données Figure 5 (b) cet experiment est encore utilisable pour l' analyse. La figure 6 est représentative d'une expérience qui est insuffisante pour l' analyse. Tandis que le rapport signal-bruit de l'échantillon est d' environ 2 - 3 pour les animaux traités (bleu) et (rouge) des échantillons non traités, la densité des cellules dans la cuve à travers des échantillons est trop faible (450 Valeur nm de 1 x 10 5) La figure 6 ( a). Cela crée un problème dans la soustraction de fond et de la normalisation Figure 6 (b) et les spectres ne sont pas alignés. Soustractions peut être ajustée pour des échantillons en augmentant ou en diminuant la DO dans le tableau 3. Toutefois, même avec une densité cellulaire faible, le pic de l' eau (~ 500 nm) est beaucoup plus grande et plus bruyante figure 6 (c) et inhibe cet ensemble de données à partir d' une analyse ultérieure.
Figure 1. Exemple de croissance des cellules en culture. Les cellules de culture en monocouche (a) Sont idéales pour plaquage cohérent et transfection. Les cellules qui semblent pousser en touffes ou avec des motifs dendritiques (b) peuvent ne pas plaquer de manière cohérente dans six puits, peuvent afficher une faible efficacité de transfection, et peuvent créer des incohérences dans l' amplitude du spectre de FRET. Barre d' échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Représentant analyse des données pour β 2 -AR-10 nm-Gas Peptide ± Drug. Représentant l' image des données brutes (a) et normalisée, moyennes des données (b) collectées avec le 2 -AR-10 capteur de peptide nm-β avec Gas non traitées (rouge) et des échantillons traités (bleu) sDes exemples après 5 minutes d'incubation avec 100 uM d'isoprotérénol bitartrate. PCP max émission à 475 nm, YFP max émission à 525 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Analyse des pauvres Protein Expression avec Raw et Normalized données. Spectres de données brutes Noisy (a) sont le résultat de faibles niveaux d'expression, la faible densité de cellules par échantillon, et / ou une faible efficacité de transfection de construction. Cet ensemble de données est toujours interprétable comme normalisée (b), même si elle est pas idéal. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Analyse de faible densité cellulaire dans Fluorometer Cuve avec Raw et Normalized des ensembles de données. La faible densité cellulaire par échantillon, vu dans les données brutes (a) complique l' eau / soustraction de fond (b, c) et rend cet ensemble ininterprétable données. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Condition | 0.5x | 0.7x | 1 fois | 2x | 2x * |
| ADN | 1 pg | 1,4 pg | 2 pg | 4 pg | 4 pg |
| médias sériques réduits | 100 ul | 70 ul | 100 ul | 100 ul | 200 ul |
| le réactif de transfection | 3 ul | 4,2 pi | 6 pi | 6 pi | 12 pi |
| * Remarque: Recommandé pour construction exceptionnellement difficile. Il faut être prudent, car cette condition induit la mort cellulaire élevée. | |||||
Tableau 1. Transfection Conditions. Ce tableau comprend les conditions optimisées de réactifs pour transfections dans 2 ml puits de cellules HEK-293T en utilisant le réactif de transfection recommandé.
| cellule tampon | ||
| Le volume | Réactif | commentaires |
| 9 ml | ultrapure DNase / RNase eau libre | |
| 1 ml | HBS (10x), pH 7,4, conserver à 4 ° C: | |
| 200 mM d'HEPES | ||
| 50 mM KCl | ||
| 450 mM de NaCl | ||
| 20 mM de CaCl 2 - H 2 O | ||
| 10 mM MgCl 2 - H 2 O | ||
| 100 ul | 20% de D-glucose | |
| 15 ul | l' aprotinine (1 mg / ml dans dH 2 O) | prévenir la dégradation |
| 15 ul | leupeptine (1 mg / ml dans dH 2 O) | prévenir la dégradation |
| 100 ul | l' acide ascorbique (100 mM dans dH 2 O) * | stabiliser agoniste |
| * Ajouter immédiatement avant de commencer dosage | ||
| Buffer Drug | ||
| Le volume | Réactif | commentaires |
| 9 ml | ultrapure DNase / RNase eau libre | |
| 1 ml | HBS (10x), pH 7,4, conserver à 4 ° C: | |
| 200 mM d'HEPES | ||
| 50 mM KCl | ||
| 450 mM de NaCl | ||
| 20 mM de CaCl 2 - H 2 O | ||
| mM MgCl 10 <sub> 2 - H 2 O | ||
| 100 ul | l' acide ascorbique (100 mM dans dH 2 O) * | stabiliser agoniste |
| * Ajouter immédiatement avant de commencer dosage | ||
Tableau 2. Constituants tampons. Ce tableau détaille les réactifs utilisés pour faire à la fois cellule tampon et le tampon de médicaments pour une utilisation dans l'expérience. Faire les deux tampons frais chaque jour de l'expérience; magasin cellule tampon à 37 ° C, et le tampon de médicaments à la température ambiante.
Tableau 3. Exemple de fichier CSV pour l' analyse. Ce fichier de données d'échantillon met en évidence l'entrée définie après une expérience. expériences multiples peuvent être saisies dans le même fichier CSV et peuvent être discernés dans la colonne «Additif» si nécessaire. Chaqueligne doit être rempli avec les informations suivantes:
Nom du fichier - SPC individuel fichiers graphique Receptor - désigné qui GPCR construction a été testée (par exemple, Β2)
Liant - qui désignent la variante de peptide de la construction a été testée (par exemple, S)
Agonist - désigner non traitée (N) ou traités par le médicament (D) conditions
De noms - le dossier de chemin dans lequel les fichiers SPC sont enregistrés, généralement organisés par date
OD - enregistrée densité optique de l'échantillon dans spectrophotomètre
S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
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Discussion
La gamme dynamique étroite de mesures FRET dans ce système renforce la nécessité d'un contrôle de qualité sensible à chaque étape de ce protocole. Les étapes les plus importantes pour assurer une expérience réussie FRET sont 1) la culture cellulaire, 2) la transfection 3) d'expression de protéines et 4), en temps opportun, une coordination précise lors de l'exécution du test.
la santé cellulaire et la qualité d'entretien / de placage peuvent avoir un impact significatif sur le bruit signal-du système expérimental et la santé des cellules pauvres peut rendre impossible de détecter tout changement cohérent dans FRET. Conservative, les cellules sont plus sain pour environ 20 passages, bien que cela puisse varier en fonction de la lignée cellulaire, la manipulation, et les conditions de culture. Une fois que les cellules ont de la difficulté croissante comme une monocouche confluente, ou commencer à croître de manière cohérente dans les modèles plus dendritiques (voir la figure 1 (b)), le bruit de fond expérimental sera affectée. l'entretien des cellules Attention, y compris medi routineune modification et régulièrement en éliminant les cellules non-adhérentes et les débris à partir de plaques de maintenance, permettra d'améliorer la qualité des cellules à six puits de placage et transfections. amas cellulaires, qui nuisent à l'efficacité de transfection, peuvent être efficacement séparés en cellules individuelles par trypsinisation de plaques d'entretien: traiter 10 cm plats confluentes avec 10 ml de trypsine à 0,25% pendant 30 secondes, retirez la trypsine mais laisser environ 200 pi, endroit plat dans 37 ° C incubateur pour 2 - 3 min. Les cellules se détache plat très facilement et sont moins sensibles à l'agglutination.
Il est essentiel pour optimiser l'étape de transfection pour cette expérience. Six puits doivent idéalement être de 60 - 80% confluentes pour la transfection efficace et une expression optimale. Si trop peu de cellules ont adhéré (<60%), attendez environ 2-6 heures pour transfecter, ou jusqu'à ce qu'au moins 70% des cellules sont respectées. Six puits qui sont sur-confluentes (> 80%) permettra également de réduire l'efficacité de la transfection. Transfectant en basconfluence cellulaire augmente le taux de mort cellulaire. la concentration de l'ADN et la pureté sont également essentiels (voir l'étape 1.2). En utilisant une faible concentration et / ou pauvres préparations d'ADN de qualité affectent négativement l' efficacité de transfection des conditions de transfection peuvent être ajustés par construction, se référer au tableau 1 pour plus d' informations.
Une surveillance précise et cohérente de l'expression des protéines en utilisant une culture tissulaire microscope à fluorescence est une autre étape cruciale dans ce processus. Bien que cette étape est soumise à un jugement individuel, il est possible d'utiliser d'autres techniques telles que la microscopie, pour surveiller l'expression quantitative au cours du temps, mais ils ne sont pas détaillés ici. Pour les constructions que nous avons testés avec succès dans notre système, l'expression dure environ 18-36 heures pour atteindre une expression optimale. Dans notre expérience, construit que l'affichage mauvaise expression au cours de cette fenêtre de temps à améliorer rarement après 40 h. Les constructions que nous avons publié avec ne l'ont pas montré des signes de degradation, mais cela peut être un problème pour certains GPCR. Dans nos essais, la dégradation du capteur est possible aux heures de transfection plus de 30 h. l'intégrité du capteur peut être testé en utilisant des rapports YFP / CFP: 525 nm lecture de la YFP-excité (490 nm) Spectre et 475 nm de lecture CFP-excité (430 nm) Spectre. Pour les réglages, voir l'étape 4.6. les ratios YFP / PCP sont recommandées dans la gamme de 1,7 à 2,0, avec un rapport idéal de 1,8. Cette valeur est dépendante de la approximative deux fois plus grande luminosité de la YFP par rapport à CFP14. Un capteur intégré avec une dégradation minimale contiendra donc les deux fluorophores et ont YFP: rapport CFP d'environ 2: 1. Après que la qualité du capteur a été confirmé, il est important de confirmer la localisation et l'expression de la protéine à la membrane plasmique. l'expression intracellulaire significative pourrait être le résultat de l'une dégradation des protéines, l'intériorisation, ou le trafic continue de la protéine. Moniteur construit au fil du temps pour voir si l'expression est renforcée à la membrane plasmique. Le prochain critdéfi ical dans l'expression est l'efficacité de transfection. Environ 70% d'efficacité + de transfection est nécessaire pour la détection de signal sur bruit adéquat dans ce système de fluoromètre. Si moins de cellules sont transfectées, la quantité de bruit signal-peut encore être détectable, mais sera beaucoup moins cohérente entre les échantillons dans une expérience FRET. Cela entravera une analyse précise des données au sein de la plage dynamique étroite du système. Les niveaux d'expression présentent également un obstacle important à la réalisation de grand signal-bruit pendant l'expérience. Pour des niveaux d'expression détectables par le fluorimètre, le rapport de signal entre 475 nm et 450 nm (diffusion cellulaire) de 1,5 est suffisante pour détecter une modification de FRET, mais l'expression optimale aura un rapport d'environ 2.0+. Pour référence, les données β2-AR est recueillie dans une gamme de 4 x 10 5 CPS (450 nm) à 1 x 10 6 CPS (475 nm), de rapport signal-bruit de 2,5 signal-bruit. Ce rapport aidera à réduire la quantité de variabilité entre les échantillons, qui peuvent également avoir une incidence sur l'analyse des données. Ces niveaux d'expression sont également soumis à la sensibilité et à un alignement optimal de l'optique du fluorimètre; D'autres systèmes peuvent nécessiter différents paramètres d'optimisation appropriée signal-bruit.
Les cellules sont extrêmement sensibles au temps et à la température. Une fois que la procédure expérimentale a commencé, la manipulation douce est essentielle pour éviter la mort cellulaire. mesures logistiques spécifiques peuvent être prises pour accélérer le processus et éviter les erreurs en temps opportun, y compris la préparation du poste de travail, en veillant à tout le matériel fonctionne correctement, et de planifier les objectifs de l'expérience préalable. Il est idéal d'utiliser des cellules dans les 30 minutes de la récolte, et dans notre système, ce protocole est exécuté dans 20 min. Une fois que la technique est maîtrisée, en particulier l'optimisation de la transfection et la dextérité manuelle de l'exercice lui-même, cette expérience peut être utilisé pour comparer différentes constructions contre l'autre, générer dose-reponse courbes, et le capteur peut être étendu à la protéine G de longueur complète.
Bien que le capteur de FRET utilisé ici est un développement unique dans les capteurs GPCR FRET, cette configuration expérimentale spécifique est détaillée comme un essai bien caractérisé pour la mise en œuvre du capteur. Le dosage à base de fluoromètre-permet une grande population de cellules à évaluer dans chaque expérience et ne repose pas sur des protéines membranaires ou préparations purifiées, donc le maintien d' un environnement in vivo. Ce modèle expérimental a également été optimisé pour détecter de très faibles changements observés dans le système lors de la stimulation agoniste du RCPG.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
RUM a été financée par l'American Heart Association Fellowship pré-doctoral (14PRE18560010). La recherche a été financée par le développement scientifique Grant American Heart Association (13SDG14270009) et le NIH (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105646-01-A1) SS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to RT before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to RT before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at RT |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
References
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