G Protein-selektive GPCR conformations måles ved hjelp av FRET sensorer i en levende celle Suspension fluorometer analysen

Abstract

Fӧrster resonans energi overføring (FRET) -baserte studier har blitt stadig mer vanlig i etterforskningen av GPCR signalering. Vår forskningsgruppe utviklet en intra-molekylær FRET sensor for å oppdage samspillet mellom Gα underenheter og GPCRs i levende celler følgende agonist stimulering. Her har vi detalj protokollen for å detektere endringer i FRET mellom β _2-adrenerge reseptoren og Gas C-terminale peptid ved behandling med 100 uM isoproterenol-hydroklorid som tidligere karakteriserte ^1. Vår FRET sensor er et enkelt polypeptid bestående serie av en full-lengde GPCR, en FRET akseptor fluorofor (mCitrine), en ER / K krampe (systematisk protein affinitet styrke modulasjon) linker, en FRET donor fluorofor (mCerulean), og en Gα C terminale peptid. Denne protokollen vil detalj celle forberedelse, transfeksjon forhold, oppsett av utstyr, analyse gjennomføring og dataanalyse. Dette eksperimentell design oppdager små lmanges i FRET indikasjon på protein-protein interaksjoner, og kan også brukes til å sammenligne styrken av interaksjonen tvers av ligander og GPCR-G-protein paringer. For å forbedre signal-til-støy i våre målinger, krever denne protokollen økt presisjon i alle ledd, og er presentert her for å muliggjøre reproduserbar utførelse.

Introduction

G-protein-koblede reseptorer (GPCR) er syv-transmembran-reseptorer. Det humane genom alene inneholder omtrent 800 gener som koder for GPCR, som aktiveres av en rekke ligander, inkludert lys, odoranter, hormoner, peptider, medikamenter og andre små molekyler. Nesten 30% av alle legemidler på markedet målet GPCRs fordi de spiller en stor rolle i mange sykdomstilstander ^2. Til tross for flere tiår med omfattende arbeidet som er gjort på denne reseptoren familie, er det fortsatt betydelige utestående spørsmål i feltet, spesielt med hensyn til de molekylære mekanismene som driver GPCR-effektor interaksjoner. Hittil har bare en høy oppløsning krystallstruktur blitt publisert, og gir innsikt i samspillet mellom β _2-adrenerge reseptor (β _2-AR) og Gs protein ^tre. Sammen med omfattende forskning i de siste tre tiårene, gjentar det en bestemt strukturell komponent som er avgjørende i denneinteraksjon: den Gα subenheten C-terminus. Denne strukturen er viktig både for G-protein aktivering av GPCR ⁴ og G-protein utvalg ^5-6. Følgelig tilveiebringer Gα C-terminus en viktig sammenheng mellom ligand stimulering av GPCR og selektiv G-protein aktivering.

Forskning det siste tiåret tyder på at GPCRs fylle en bred conformational landskap, med ligand-bindende stabiliserende undergrupper av GPCR konformasjoner. Mens flere teknikker, inkludert krystallografi, NMR-spektroskopi og fluorescens, og massespektrometri er tilgjengelige for å undersøke GPCR konformasjonell landskapet, er det en mangelen av tilnærminger for å belyse deres funksjonelle betydning i effektor utvalg ^7. Her skisserer vi en Fӧrster resonans energi overføring (FRET) -basert tilnærming til å oppdage G protein-selektive GPCR konformasjoner. FRET er avhengig av nærheten og orienteringen av to parallelle fluoroforer med overlappende emisjon (donor) ennd eksitasjon (akseptor) spektra ^8. Som donor og akseptor fluoroforer komme nærmere hverandre som et resultat av enten konformasjonell forandring i protein eller et protein-protein interaksjon, den FRET mellom dem øker, og kan måles ved hjelp av en rekke metoder ^8. FRET-basert biosensorer har vært ansatt i stor utstrekning i GPCR felt ^9. De har blitt anvendt for å probe conformation forandringer i GPCR ved innføring av donor og akseptor i den tredje intracellulære løkke og GPCR C-terminale ende; sensorer har blitt designet for å undersøke GPCR og effektor interaksjoner med separat merking av GPCR og effektor (G protein subenheter / arrestins) med en FRET par ^10; enkelte sensorer også detektere konformasjonsendringer i G-proteinet ^11. Disse biosensorer har aktivert feltet for å spørre en rekke utestående spørsmål inkludert konformasjonsforandringer endringer i GPCR og effektor, GPCR-effektor interaksjonskinetikk og allosteriske ligander ^12. vår gruppevar spesielt interessert i å skape en biosensor som kan oppdage G protein-spesifikke GPCR conformations etter agonist-drevet forhold. Dette biosensor er avhengig av en nylig utviklet teknologi kalt krampe (systematisk protein affinitet styrke modulation) ^13. Krampe innebærer tethering samspill proteindomener som bruker en ER / K linker, som styrer deres effektive konsentrasjoner. Flankerer linker med en FRET par fluorophores skaper et verktøy som kan rapportere tilstanden av samspillet mellom proteiner ^12. Tidligere ^en krampe modulen ble brukt til å tjore Gα C-terminalen til en GPCR og overvåke deres interaksjon med FRET fluoroforer, mCitrine (referert til i denne protokollen ved sin allment kjent variant, gul fluoriserende protein (YFP), eksitasjon / emisjon topp på 490/525 nm) og mCerulean (referert til i denne protokollen ved sin allment kjent variant Cyan Fluorescent Protein (CFP), eksitasjon / emisjonstopp 430/475 nm). Fra N- til C-terminus, thans genetisk kodede enkelt polypeptid inneholder: en full lengde GPCR, FRET-akseptor (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K linker, FRET donor (mCerulean / CFP), og den Gα C-terminale peptid. I denne studien, er følere forkortet som GPCR-linker lengde-Gα peptid. Alle komponentene er separert med et ustrukturert (Gly-Ser-Gly) _4-linkeren som muliggjør fri rotasjon av hvert domene. Den detaljerte karakteriseringen av slike sensorer er tidligere utført ved hjelp av to prototypiske GPCR: β _2-AR og opsin ^1.

Denne sensoren er transient transfektert inn i HEK-293T-celler og fluorometer-basert live celleforsøk måler fluorescens-spektrene for de FRET paret i vilkårlige enheter av tellinger pr sekund (CPS) i nærvær eller fravær av ligand. Disse målingene brukes til å beregne en FRET forholdet mellom fluorophores (YFP _max / CFP _max). En endring i FRET (ΔFRET) blir deretter beregnet ved å subtrahere den gjennomsnittlige FRET forholdetav ubehandlede prøver fra FRET mellom ligand behandlede prøver. ΔFRET kan sammenlignes på tvers av konstruksjoner (β _2-AR-10 nm-Gas peptid versus beta _2-AR-10 nm-no peptid). Her har vi detalj protokollen for å uttrykke disse sensorene i levende HEK-293T celler, overvåke deres uttrykk, og oppsettet, gjennomføring og analyse av fluorometer-basert live celle FRET måling for ubehandlet versus legemiddelbehandlede forhold. Selv om denne protokollen er spesifikk for den β _2-AR-10 nm-Gas peptid sensor behandlet med 100 uM isoproterenol bitartrat, kan det være optimalisert for forskjellige GPCR-Gα par og ligander.

Protocol

1. DNA Forberedelse

1. Design sensor konstruerer ved hjelp av en modulær kloning ordningen. Vennligst referere til β _2-AR sensordesign detaljert tidligere ^en.
2. Fremstille DNA ifølge kommersielt miniprep settprotokollen og elueres i 2 mM Tris-HCl-løsning, pH 8, ved konsentrasjon ≥ 750 ng / ul, A ₂₆₀ / A ₂₈₀ fra 01/07 til 01/09, A ₂₆₀ / A ₂₃₀ fra 2,0 til 2,29.

2. Cell Culture Forberedelse

1. Kultur HEK-293T-Flp-n celler i DMEM inneholdende 4,5 g / l D-glukose, supplert med 10% FBS (varmeinaktivert) (v / v), 1% L-glutamin supplement, 20 mM HEPES, pH 7,5 ved 37 ° C i fuktig atmosfære med 5% CO _2. Håndtak celler i biologisk sikkerhet hette for etterfølgende trinn.
2. Tillat celler til å vokse til en konfluent monolag før aging inn i seks-brønns retter. Tid for å oppnå konfluens avhenger innledende plating tetthet. Bruk plater somkommer til konfluens innen 1 - 2 dager etter plating for seks-brønns plating. En konfluent 10 cm vevskultur-behandlede tallerken har celletetthet på omtrent 4 x 10 ⁶ celler / ml. Se figur 1 for bilde av cellekulturvekst.
3. Vask cellene med 10 ml PBS, og trypsineres med 0,25% trypsin (se Diskusjoner, punkt 2). Platen 8 x 10 ⁵ celler / brønn i 2 ml media i vevskultur-behandlede seks brønners skåler og gjør det mulig å overholde for 16 - 20 timer.

3. Transfeksjon betingelser

1. Rave transfections for konstruksjoner som kan kreve forskjellige mengder tid for å oppnå optimal uttrykk (mellom 20 - 36 timer). Synkron forhold for en enhetlig eksperiment tid. har også en utransfekterte kontrollbrønn ved tilsvarende celletetthet som skal brukes for bakgrunnsstøy og spredning subtraksjon i løpet av analysen.
2. Ta med transfeksjon reagenser til romtemperatur: reduserte serum media, DNA, transfeksjon reagens.
3. I enbiologisk sikkerhet hette kombinere reagenser i et sterilt mikrosentrifugerør i følgende rekkefølge: blande to mikrogram DNA med 100 pl reduserte serum medier. Spike 6 pl av transfeksjon reagens inn i media / DNA-blandingen uten å berøre overflaten av blandingen eller på siden av røret. Sett opp en transfeksjon reaksjon per brønn. Transfeksjon betingelser kan optimaliseres (til 1 - 4 ug DNA, 3 - 6 pl av transfeksjon reagens) for å oppnå konsistente ekspresjonsnivåer. Se tabell 1 for mer optimaliserte forhold.
4. Inkuber blandingen ved RT i biologisk sikkerhet hette for 15-30 min. Ikke bruk reaksjon hvis igjen å ruge i mer enn 30 min.
5. Legg reaksjon på celler i en drop-klok måte på tvers av godt og rist forsiktig seks godt for å sikre grundig blanding. Legg en reaksjon per brønn.
6. Etter 20 timer i uttrykket, monitor fluorescens ved hjelp av vev kultur fluorescens mikroskop. Vurdere befolkningen uttrykk med 10X objektiv og protein lokalisering i en celle på 40X. ObsErve for protein uttrykk på plasmamembranen (PM). Hvis betydelig intern er kjent, overvåke transfeksjon inntil signifikant uttrykk blir oppdaget på PM.

4. Reagens og utstyr Forberedelse

1. Forbered 100 mm narkotika aksjer og oppbevar ved -80 ° C: isoproterenol bitartrate (100 mm i dH ₂ O som inneholder 300 mM askorbinsyre). Gjør på is / i kaldt rom, og flash-fryse umiddelbart. Porsjoner kan gjøres og brukes opp til ett år.
2. Forbered Cell Buffer (~ 2 ml / tilstand) og oppbevar i en 37 ° C vannbad. Gjør fersk hver dag. Referansetabell 2 for Cell Buffer bestanddeler.
3. Forbered Drug Buffer (10 ml) og oppbevar ved romtemperatur. Referansetabell 2 for Drug Buffer bestanddeler.
4. Acid vaske kyvetter med konsentrert HCl. Nøytraliser med en svak base (1 M KOH), og vask grundig kyvetter med dH ₂ O.
5. Forbered arbeidet stasjon rundt fluorometer med flereesker med 10, 200 og 1000 ul pipettespisser, en tidtaker satt med en 10 min nedtelling, en tilgjengelig vakuum tråd med tips for kyvette rengjøring, delikate oppgaven kluter, og sprute flaske med ultra H ₂ O.
6. Varm ytre vannbad for fluorometer og varmeblokk til 37 ° C.
7. Slå på fluorometer; satt fluorescens innsamlingsprogram for CFP samling til eksitasjon 430 nm, båndpass 8 nm; utslippsområdet 450 nm - 600 nm, båndpass 4 nm. For YFP samling bare som sensor kontroll (se diskusjon) sett eksitasjon 490 nm, båndpass 8 nm, emisjon range 500-600 nm, båndpass 4 nm. CFP samling innstillinger vil bli brukt til å skaffe seg en FRET spektrum i dette eksperimentet.
8. Plasser tolv 1,5 ml mikrosentrifugerør i varmeblokk som vist i Figur 2 nedenfor. Disse rørene er holdere for celle alikvote rør (500 mL Mikrosentrifugerør.) Plasser en liten bit av vevet i holdere 1 og 7 for å dempe kyvettene plassert her.
   Merk: Bruk separate kyvetter for ubehandlet tilstand og legemiddel betingelse for å hindre krysskontaminering.

Figur 2. mikrosentrifugerør sette opp og posisjonsreferanse i Heat Block Cuvette for ubehandlede prøvene er i posisjon 1.; celle alikvote rør er i posisjon 2 - 6. Cuvette for legemiddelbehandlede prøvene er i posisjon 7; celle alikvote rør er i posisjoner 8 - 12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

9. Fyll holdere 2 - 6 og 8 - 12 med ~ 750 mL vann for å lage en mini 37 ° C vannbad.
10. Plasser ti 500 mL Mikrosentrifugerør for celle porsjoner til mini-vannbad (holdere 2 - 6, 8 - 12). Hvert rør vil være en individuell gjentagelse av tilstanden (5 ubehandleded, 5 medikament behandlet).
11. Overvåk celler for uttrykk (se trinn 3.6).

5. Eksperimenter og datainnsamling

Figur 3. Eksperimentell Skjematisk. En detaljert trinnvis guide for eksperimentell sette opp og utførelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1. Referanse Figur 3 for eksperimentell skjematisk. Når cellene er klare til å høstes, basert på protein uttrykk oppdaget med fluorescens mikroskop (se Diskusjoner, punkt 4): i biologisk sikkerhet hette, forsiktig fjerne ~ 1 ml av media, resuspender celler i deres kultur med en P1,000 og overføre resuspensjon inn i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
   Merk: Unngå å bruke trypsin som det kan fordøye den N-terminale og /eller bindende lomme av GPCR sensoren.
2. Cellene telles for å sikre tilfredsstillende celletetthet i resuspensjon. Optimaliser resuspensjon volum for 4 x 10 ⁶ celler / ml.
3. Spin-celler i svingende spann sentrifuge ved romtemperatur, 290 x g i 3 min. Fjern supernatanten etter sentrifugering.
4. GENTLY resuspender cellene i 1 ml cellebuffer (lagret ved 37 ° C) og gjenta trinn 5.3. Under andre spin, samle 100 mM narkotika lager delmengde fra -80 ° C. Lag 1: 100 fortynning i Drug Buffer for 1 mm Arbeids lager og holde ved RT.
5. Etter den andre sentrifugeringen, fjern supernatanten forsiktig og resuspender cellene i 1 ml av cellebuffer (4 x 10 ⁶ celler / ml). Måle OD ₆₀₀ av prøven i spektrofotometer ved hjelp av 1 ml celler og 1 ml av celle buffer som blindprøve. Dispensere celler i en engangs plast kyvette og overføre tilbake til et mikrosentrifugerør umiddelbart etter spektrofotometri.
6. For en kontroll utransfekterte cell tilstand spekteret, forsiktig resuspender utransfekterte celler i 1 ml Cell Buffer med P1,000 pipette, tilsett 90 mL av celler til kyvette og skaffe FRET spekteret ved eksitasjon 430 nm, båndpass 8 nm, emisjon 450-600 nm, båndpass 4 nm. Samle 3 - 5 gjenta spektra med friske 90 mL av celler. Holde lager av cellene ved 37 ° C mellom spesifikasjoner, resuspender forsiktig med P1,000 mellom hver prøvealiquot, og skyll kyvette med ultrarent _H2O mellom prøvene.
7. For eksperimentelle forhold, alikvoter 90 mL av transfekterte celler til hver av de 500 mL rør i holdere 2 - 6, 8 - 12 i varmen blokken. Forsiktig resuspender lager av celler med P1,000 pipette mellom hver prøve.
8. Etter cellene er porsjonert, tilsett 10 mL av Drug Buffer til rør 2-6 for ubehandlede tilstand prøver.
9. Begynn eksperimentet ved tilsetning av 10 pl 1 mM narkotika løsning i rør 8, starter tidtakeren å telle ned fra 10 min, og forsiktig bland tube med P200 pipette. Lukk røret og tilbake til 37° C varme blokk.
10. Umiddelbart plukke opp rør 2, bland forsiktig med P200 (bruk en ny spiss), tilsett 90 mL av cellesuspensjon til ubehandlet tilstand kyvette, og plasser i fluorometer.
11. Erverve FRET spekteret ved eksitasjon 430 nm, båndpass 8 nm, emisjon 450-600 nm, båndpass 4 nm.
12. 9 min - 10 sek, pigge rør 9 med 10 pl 1 mM narkotika løsning, forsiktig bland med en P200 (bruk ny spiss), og returnere røret for å varme blokk.
13. Gjenta trinn 05.10 til 05.11 med rør 3 og 5.12 med slange 10.
14. Gjenta trinn 05.10 til 05.13 på 1 minutts intervaller (08:10, 07:10, etc.) til spektrene er samlet for alle ubehandlede tilstand prøvene, og stoffet har blitt lagt til alle narkotika tilstand prøver. Bruk en frisk spiss for hver pipette skritt for å hindre krysskontaminering.
15. På 5 min - 10 sek, begynne å blande rør 8 (narkotika tilstand) forsiktig med P200 pipette, tilsett 90 mL av cellesuspensjon til separat kyvette for narkotika behandlede prøve og plass i fluorometer.
16. Acquire FRET spektrum (se trinn 5.11 for innstillinger).
17. Gjenta trinn 05.15 til 05.16 på 1 minutts intervaller (04:10, 03:10, etc.) for de resterende stoffet tilstandsprøver (rør 9 - 12).
18. Etter eksperimentet, lagre prosjektfiler, grundig vask kyvetter med ultra H ₂ O, og re-lager rør for neste tilstand. Pass på å hindre krysskontaminering i vasketrinnet. Endre spissen på H ₂ O flaske, så vel som på vakuumlinjen mellom hver vask.

6. Data Analysis

1. Lagre og eksportere datafiler i SPC formatere skal brukes til analyse. Analyse programmer er tilgjengelig for nedlasting fra Sivaramakrishnan Lab publikasjonen nettside.
2. Lag bane filer for analyse programvare som inkluderer analyseprogrammer (v9, V15), utransfekterte prøver filer (se trinn 5.6 for utransfekterte celle spekteret samling), utgangs datafil, og kommadelte verdier (CSV) filer for dataregistrering.
3. Skriv inn følgende informasjoninn CSV-fil (se eksempel i tabell 3) og utpeke respektive vilkår for hver prøve, inkludert:
   Filnavn - individuelle SPC grafiske filer
   Receptor - utpeke som GPCR konstruksjon ble testet (f.eks Β2)
   Binder - utpeke hvilken peptid variant av konstruksjonen ble testet (for eksempel S)
   Agonist - utpeke ubehandlet (N) eller legemiddelbehandlede (D) betingelser
   Directory - veien mappen der SPC filene er lagret, vanligvis organisert etter dato
   OD - målt optisk tetthet av prøven fra spektrofotometer
4. Angi filnavn for utransfekterte prøver (trinn 5.6) for å trekke buffer og spredning støy fra prøvene.
5. Skriv forhold til analyseprogram.
6. Kjør programmer for å analysere prøver innen individuelle forhold (v9) og på tvers av forholdene (V15).
7. Ekskluder eksempelfiler som er åpenbare utliggere i datasettet, eller justere for subtraksjon ved å øke eller redusere OD verdien til indidual-filer.
8. Eksportere data til utdatafilen for tilgang til beregnet FRET forhold (525 nm / 475 nm).
9. Beregn ΔFRET ved å trekke den gjennomsnittlige FRET ratio for ubehandlet tilstand fra de enkelte FRET forholdstall for behandlede (narkotika) betingelser.

Representative Results

En generalisert skjematisk av eksperimentet satt opp og gjennomføring er beskrevet i figur 3.

For å oppdage en FRET endring i den smale dynamiske området av sensoren, er det viktig å følge nyansene av systemet følges. Celle kvalitet er viktig å proteinekspresjon samt konsistens i prøvetakings. Figur 1 trekk bilder av dyrkede celler som vokser i et konsistent monolag (10X) som er optimal for en seks-brønners platekledning og transfeksjon figur 1 (a) og celler som vokser i klumpet mønstre som fører til dendrittiske figurer Figur 1 (b) som ikke anbefales for konsekvent plating. Transfeksjon forhold kan også optimaliseres for å oppnå reproduserbar ekspresjon. Flere forhold har blitt optimalisert for den anbefalte transfeksjon reagens brukes her. Tabell 1 detaljer disse forholdene for reduserte serum medier. DNA, og transfeksjon reagent forholdstall.

Når alle data er samlet inn og data legges inn i CSV-fil for analyse (se eksempel i tabell 3), de genererte resultatene vil likne Raw FRET Spectra dataene vist i figur 4 (a) og normalisert, mener FRET spektra vist i Figur 4 (b). På figur 4 er de røde spektra er de ubehandlede prøver og det blå blir de legemiddelbehandlede prøvene. Alle de rå FRET-spektrene i Figur 4 (a) har tilstrekkelig signal-til-støy rekkevidde for konsekvent dataanalyse (f.eks., CPS ved 450 nm i forhold til CPS ved 475 nm). Med dette område, er spektrene er jevnere og vanntopp fra prøven (Raman topp er ved 500 nm) er også minimal. Lave nivåer resultere i en fremtredende vann peak som forstyrrer dataanalyse. Data blir normalisert ved 475 nm, innstilling av CPS fra denne verdi til 1,0 (figur 4 (b)). I dette datasettet for β _2-AR-10 Nm-Gas peptid sensor, er det en vesentlig endring ved 525 nm lest mellom ubehandlet (rød) og behandlet (blå) prøver. Den ΔFRET endringen er beregnet fra gnage forhold (525 nm / 475 nm) av disse datasettene og er tilgjengelig gjennom utdatafilen.

Hvis protein uttrykk er lav, er det dårlig transfeksjonseffektivitet, eller lav celletetthet i kuvetten for fluorescens lesing, kan spektrene vises mer utsatt for støy, som vist i figur 5. I forhold til figur 4 (a) signal-til-støy-område for denne datasettet er ikke ideell, ved omtrent 1,0 -. 1,6, med CPS _maks på 4 x 10 ⁵ Dette lave ekspresjonsnivå bidrar til den taggete spektra sett i rådata figur 5 (a), men dataene er tett og i stand til å bli normalisert Figur 5 (b). Selv om vann topper (~ 500 nm) ikke stille opp helt mellom datasett Figur 5 (b) denne experiment er fortsatt brukbare for analyse. Figur 6 er representative for et eksperiment som er utilstrekkelig for analyse. Mens signal-til-støy av prøven er omtrent 2 - 3 for behandlede (blå) og ubehandlede (røde) prøver, celletettheten i kyvetten tvers av prøvene er for lav (450 nm verdi på 1 x 10 ⁵⁾ Figur 6 ( a). Dette skaper et problem i bakgrunnen subtraksjon og normalisering figur 6 (b) og spektrene ikke justere. Subtraksjon kan justeres for prøver ved å øke eller redusere OD i tabell 3. Men selv med lav celletetthet, vann topp (~ 500 nm) blir mye større og mer støyende figur 6 (c) og hindrer dette datasettet fra videre analyse.

Figur 1. Eksempel på dyrkede cellevekst. Celler som vokser i et monolag (a) Er ideelle for konsekvent plating og transfeksjon. Celler som ser ut til å vokse i klumper eller med dendrittiske mønstre (b) kan ikke platen konsekvent i seks-brønner, kan vise dårlig transfeksjonseffektivitet, og kan skape uoverensstemmelser i amplitude av det FRET spekteret. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Representant Data Analysis for β _2-AR-10 nm-Gas Peptide ± Drug. Representant bilde av rådata (a) og normalisert gjennomsnittsdata (b) samlet inn med β _2-AR-10 nm-Gas peptid sensor med ubehandlede (rød) prøver og behandlede (blå) samples etter fem minutters inkubasjon med 100 mikrometer isoproterenol bitartrate. CFP _maks utslipp på 475 nm, YFP _maks utslipp på 525 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Analyse av Poor Protein Expression med Raw og normalisert data. Noisy rådata spektra (a) er et resultat av lave nivåer, lav celletetthet per prøve, og / eller dårlig transfeksjon effektiviteten av konstruksjonen. Dette datasettet er fortsatt tolkes som normalisert (b), selv om det ikke er ideelt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. Analyse av lav celletetthet i fluorometer Kyvette med Rå og normaliserte datasettene. Den lave celletetthet per prøve, sett i rå-data (a) kompliserer vann / bakgrunn subtraksjon (b, c) og gjør dette datasett uninterpretable. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Betingelse	0,5x	0,7x	1x	2x	2x *
DNA	1 mikrogram	1,4 mikrogram	2 mikrogram	4 mikrogram	4 mikrogram
Redusert serum media	100 pl	70 mL	100 pl	100 pl	200 ul
transfeksjon reagens	3 pl	4.2 mL	6 mL	6 mL	12 pl
* Merk: Anbefalt for svært vanskelig konstruere. Det må utvises forsiktighet, da denne tilstanden induserer høy celledød.

Tabell 1. Transfeksjon betingelser. Denne tabellen inneholder optimaliserte forhold med reagenser for transfections i 2 ml brønner i HEK-293T celler ved hjelp av den anbefalte transfeksjon reagens.

Cell Buffer
Volum	reagens	kommentarer
9 ml	ultra DNase / RNase fritt vann
1 ml	HBS (10x), pH 7,4, oppbevar ved 4 ° C:
	200 mM HEPES
	50 mM KCl
	450 mM NaCl
	20 mM CaCl2 - H 2 O
	10 mM MgCl2 - H 2 O
100 pl	20% D-glucose
15 ul	aprotinin (1 mg / ml i dH 2 O)	forhindre degradering
15 ul	leupeptin (1 mg / ml i dH 2 O)	forhindre degradering
100 pl	askorbinsyre (100 mM i dH 2 O) *	stabilisere agonist
	* Legge til rett før du begynner analysen
Drug Buffer
Volum	reagens	kommentarer
9 ml	ultra DNase / RNase fritt vann
1 ml	HBS (10x), pH 7,4, oppbevar ved 4 ° C:
	200 mM HEPES
	50 mM KCl
	450 mM NaCl
	20 mM CaCl2 - H 2 O
	10 mM MgCl <sub> 2 - H 2 O
100 pl	askorbinsyre (100 mM i dH 2 O) *	stabilisere agonist
	* Legge til rett før du begynner analysen

Tabell 2. Bufferstoffer. Denne tabell viser de reagenser som anvendes for å lage både Cell Buffer and Drug Buffer for anvendelse i forsøket. Gjør begge buffere ferske hver dag av forsøket; butikk Cell-buffer ved 37 ° C, og Drug buffer ved romtemperatur.

Tabell 3. Eksempel på CSV-fil for analyse. Denne prøven datafil streker oppføring satt etter ett forsøk. Flere eksperimenter kan legges inn i samme CSV-fil og kan skjelnes under "Additiv kolonnen om nødvendig. hver enkeltrad må fylles ut med følgende informasjon:
Filnavn - individuell SPC graf filer Receptor - utpeke som GPCR konstruksjon ble testet (f.eks Β2)
Binder - utpeke hvilken peptid variant av konstruksjonen ble testet (for eksempel S)
Agonist - utpeke ubehandlet (N) eller legemiddelbehandlede (D) betingelser
Directory - veien mappen der SPC filene er lagret, vanligvis organisert etter dato
OD - målt optisk tetthet av prøven i spektrofotometer
Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.

Discussion

Den tette dynamisk område på FRET målinger i dette systemet forsterker behovet for følsomme kvalitetskontroll i hvert trinn av denne protokollen. De viktigste tiltak for å sikre en vellykket FRET eksperiment er 1) celledyrking, 2) transfeksjon 3) protein uttrykk og 4) rettidig, nøyaktig koordinering under analysen utførelse.

Cell helse og vedlikehold / plating kvalitet kan ha en betydelig innvirkning på signal-til-støy av den eksperimentelle systemet og dårlig celle helse kan gjøre det umulig å oppdage eventuelle konsekvent endring i bånd. Konservativt, celler er sunneste for ca 20 passasjer, selv om dette kan variere basert på cellelinje, håndtering, og dyrkningsforhold. Når cellene har vanskeligheter med å vokse som et konfluent monolag, eller begynne å vokse jevnt i flere dendritiske mønstre (se Figur 1 (b)), vil eksperimentelle bakgrunnsstøyen bli negativt påvirket. Forsiktig celle vedlikehold, herunder rutine media endringer og regelmessig fjerne ikke-heftende celler og rusk fra vedlikeholds plater, vil øke kvaliteten på cellene for seks-brønns plating og trans. Celle klumper, noe som påvirke transfeksjon effektivitet, kan effektivt deles inn i individuelle celler ved trypsinering av vedlikeholds plater: behandle 10 cm sammenflytende retter med 10 ml 0,25% trypsin i 30 sek, fjern trypsin men la ca 200 mL, sted fatet i 37 ° C inkubator for 2-3 min. Celler vil gå av fatet veldig lett og er mindre utsatt for klumper.

Det er kritisk for å optimalisere transfeksjon trinnet for dette eksperimentet. Seks-brønner må ideelt sett være 60 - 80% sammenflytende for effektiv transfeksjon og optimalt uttrykk. Dersom for få celler er klebet (<60%), vente med omtrent 2 - 6 timer for å transfektere eller inntil i det minste 70% av cellene overholdes. Seks-brønner som er overflytende (> 80%) vil også redusere transfeksjon effektivitet. Transfeksjon ved laverecelle confluency øker celledød hastighet. DNA-konsentrasjon og renhet er også kritisk (se trinn 1.2). Ved hjelp av lav konsentrasjon og / eller dårlig kvalitet DNA-preparater negativt påvirke transfeksjonseffektivitet Transfeksjon forhold kan justeres per konstruksjon, se Tabell 1 for mer informasjon.

Nøyaktig og konsekvent oppfølging av protein uttrykk ved hjelp av en vev-kultur fluorescens mikroskop er et annet viktig skritt i denne prosessen. Selv om dette trinn er gjenstand for individuell dom, er det mulig å benytte andre teknikker, slik som mikroskopi, for å overvåke ekspresjon over tid kvantitativt, selv om de ikke er beskrevet her. For konstruerer vi har testet med suksess i vårt system, tar uttrykket ca 18-36 timer å nå optimalt uttrykk. I vår erfaring, konstruerer som viser dårlig uttrykk i løpet av denne tidsvinduet sjelden bedre etter 40 timer. De konstruerer vi har publisert med har ikke vist tegn til degradation, men dette kan være et problem for noen GPCR. I våre analyser, er sensoren degradering mulig ved transfeksjon ganger i løpet av 30 timer. Sensor integritet kan testes ved hjelp av YFP / CFP forhold: 525 nm lese fra YFP-glade (490 nm) spektrum, og 475 nm leser fra CFP-glade (430 nm) spektrum. For innstillinger, se trinn 4.6. Anbefalte YFP / CFP forhold er i området fra 1,7 til 2,0, med et utmerket forhold på 1,8. Denne verdien er avhengig av den omtrentlige to-ganger høyere lyshet på YFP i forhold til CFP14. En integrert sensor med minimal degradering vil derfor inneholde både fluoroforer og ha YFP: CFP forhold på omtrent 2: 1. Etter at sensor kvalitet har blitt bekreftet, er det viktig å bekrefte protein lokalisasjon og ekspresjon i plasmamembranen. Betydelig intracellulær uttrykk kan være et resultat av enten protein degradering, internalisering, eller pågående smugling av proteinet. Monitor konstruerer over tid for å se om uttrykket er forbedret ved plasmamembranen. Den neste critical utfordring i uttrykket er transfeksjon effektivitet. Omtrent 70% + transfeksjonseffektiviteten er nødvendig for adekvat signal-til-støydeteksjon i denne fluorometer systemet. Dersom færre celler blir transfektert, kan mengden av signal-til-støy fremdeles være påvisbare, men vil være mye mindre konsekvent mellom sampler i en FRET eksperiment. Dette vil hindre nøyaktig analyse av dataene innenfor det smale dynamiske området av systemet. Ekspresjonsnivåer frem også et betydelig hinder for å oppnå god signal-til-støy i løpet av eksperimentet. For ekspresjonsnivåer detekterbare ved fluorometer, forholdet mellom signal mellom 475 nm og 450 nm (celle spredning) på 1,5 er tilstrekkelig for å detektere en endring i FRET, vil imidlertid optimal ekspresjon ha et forhold på ca. 2.0+. For referanse, er det β2-AR data samlet inn i en signal-til-støy-området fra 4 x 10 ⁵ CPS (450 nm) til 1 x 10 ⁶ CPS (475 nm), signal-til-støy-forhold på 2,5. Dette forholdet vil bidra til å redusere mengden av variabiheten mellom prøvene, som også kan påvirke dataanalyse. Disse uttrykk nivåer er også underlagt følsomheten og optimal justering av fluorometer optikk; andre systemer kan kreve forskjellige parametere for adekvat signal-til-støy-optimalisering.

Celler som er ekstremt følsomme for tid og temperatur. Når den eksperimentelle prosedyren har begynt, er skånsom håndtering nødvendig for å unngå celledød. Spesifikke logistiske tiltak kan iverksettes for å fremskynde prosessen og unngå rettidig feil inkludert utarbeidelse av arbeidsstasjonen, og pass på at alt utstyr fungerer som det skal, og planlegger ut målene for forsøket på forhånd. Det er ideelt å bruke celler i 30 min av høsting, og i vårt system, er denne protokollen henrettet innen 20 min. Når teknikken er mestret, spesielt transfeksjon optimalisering og fingerferdighet av øvelsen selv, dette forsøk kan anvendes for å sammenligne forskjellige konstruksjonene mot hverandre, å generere dose-rerespons kurver, og sensoren kan utvides til full-lengde G-protein.

Selv om FRET sensoren som brukes her er en unik utvikling i GPCR FRET sensorer, er denne spesifikke eksperimentelle oppsettet beskrevet som et godt karakterisert assay for gjennomføring av sensoren. Fluorometeret-baserte analysen kan en stor populasjon av celler som skal vurderes i hvert forsøk, og ikke er avhengig av rensede proteiner eller membran preps, derfor å opprettholde et in vivo miljø. Denne eksperimentelle design har også blitt optimalisert for å påvise svært små endringer sett i systemet ved agonist stimulering av GPCR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor	Addgene	47438	https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Fermentas/Fisher Sci	FERK0503	Elute in 2 mM Tris elution buffer
HEK-293T-Flp-n cells	Life Technologies	R78007
Trypsin (0.25%)	Life Technologies	25200056
DMEM- high glucose	Life Technologies	11960-044	Warm in  37 °C water bath before use
FBS, certified, Heat inactivated, US origin	Life Technologies	10082147
Glutamax I 100x	Life Technologies	35050061
HEPES	Corning	MT25060CL
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Reduced serum media; Bring to RT before use
XtremeGene HP transfection reagenet	Roche	6366236001	Highly recommended for its consistency. Bring to RT before use
FluoroMax 4	Horiba		Use with FluorEssence V3.8 software
3-mm path length quartz cuvette	Starna	NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)	May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna
Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump	Fisher Scientific	13-874-826	Warm to 37 °C before use
Thermomixer Heat Block	Eppendorf	22670000	Warm to 37 °C before use
Ultrapure DNA/RNAse free water	Life Technologies	10977015	Use at RT
D(+)-glucose, anhydrous	Sigma	G5767
aprotinin from bovine lung	Sigma	A1153
leupeptin hemisulfate	EMD	10-897
L-ascorbic acid, reagent grade	Sigma	A0278
(-)-isoproterenol (+)-bitartrate	Sigma	I2760	Use fresh aliquot each experiment