Abstract
Fӧrster резонансный перенос энергии (FRET) основе исследования становятся все более распространенными в исследовании сигналов GPCR. Наша исследовательская группа разработала внутримолекулярной датчик FRET для обнаружения взаимодействия между Gα субъединиц и GPCRs в живых клетках после агонистом стимуляции. Здесь мы подробно протокол для обнаружения изменений в FRET между β 2 адренергического рецептора и С-концевого пептида Gαs после обработки 100 мкМ изопротеренол гидрохлорида , как ранее характеризовался 1. Наш датчик FRET представляет собой единый полипептид, состоящий поочередно из полнометражного GPCR, лобзиком акцепторного флуорофора (mCitrine), ER / K СПАЗМЫ (систематическое сродство белка сила модуляции) линкер, донор FRET флуорофор (mCerulean) и Gα C терминальный пептид. Этот протокол будет подробно подготовка клеток, условия трансфекции, установки оборудования, выполнение анализа и анализа данных. Этот экспериментальный дизайн обнаруживает небольшой чAnges в FRET свидетельствует о белок-белковых взаимодействий, а также могут быть использованы для сравнения силы взаимодействия через лигандов и ХВГФ-G белка спариваний. Для того, чтобы усилить сигнал-шум в наших измерениях, этот протокол требует повышенную точность на всех этапах, и представлена здесь для того, чтобы воспроизводимый исполнение.
Introduction
G-белками рецепторы (GPCRs) семь-трансмембранные рецепторы. Один только геном человека содержит около 800 генов, кодирующих GPCR,, которые активируются различными лигандами, включая свет, отдушек, гормонов, пептидов, лекарственных средств и других небольших молекул. Около 30% всех лекарственных средств в настоящее время на целевом рынке GPCRs , потому что они играют большую роль во многих болезненных состояний 2. Несмотря на десятилетия обширной работы, проделанной по этому семейству рецепторов, остаются значительные нерешенные вопросы в этой области, в частности в отношении молекулярных механизмов, которые управляют GPCR-эффекторных взаимодействий. На сегодняшний день только одна кристаллическая структура с высокой разрешающей способностью были опубликованы, обеспечивая представление о взаимодействии между β 2 адренергического рецептора (β 2 -АР) , и белок Gs 3. Вместе с обширные исследования в течение последних трех десятилетий, он повторяет один конкретный структурный компонент, который имеет решающее значение в этомВзаимодействие: The Gα субъединицей С-концевом участке. Эта структура имеет важное значение как для G активации белка путем выбора белка GPCR 4 и G 5-6. Следовательно, Gα С-конец обеспечивает важную связь между лигандом стимуляции GPCR и селективной активации белка G.
Исследования, проведенные за последнее десятилетие показывает, что GPCR, заселить широкий конформационные пейзаж с лиганд-связывающим стабилизирующим подмножеств GPCR конформации. В то время как несколько методов, в том числе кристаллография, ЯМР и флуоресцентной спектроскопии и масс - спектрометрии можно исследовать конформационные ландшафт GPCR, существует недостаток подходов к выяснению их функциональное значение в выборе эффекторной 7. Здесь мы очертить подход Fӧrster -На резонансный перенос энергии (FRET) для обнаружения белка G-селективных GPCR конформации. FRET зависит от близости и параллельной ориентации двух флуорофоров с перекрытием выбросов (доноров) аго возбуждения (акцептор) спектры 8. В качестве донора и акцептора флуорофоров сближаются в результате либо конформационных изменений в белке или белок-белкового взаимодействия, лада между ними увеличивается, и может быть измерена с помощью ряда методов 8. FRET на основе биосенсоров широко используются в области GPCR 9. Они использовались, чтобы исследовать конформационные изменения в GPCR, вставив донора и акцептора в третьем цикле внутриклеточного и GPCR С-конца; Датчики были разработаны для исследования GPCR и эффекторных взаимодействий по отдельности мечения GPCR и эффектор (G белковых субъединиц / arrestins) с FRET пары 10; некоторые датчики также обнаружить конформационные изменения в белке G 11. Эти биосенсоры позволили поле , чтобы задать множество нерешенных вопросов , в том числе конформационных изменений в GPCR и эффектора, кинетика взаимодействия GPCR-эффекторов и аллостерических лигандов 12. Наша группабыл особенно заинтересован в создании биосенсоров, которые могли бы обнаружить белок G-специфический GPCR конформации под агонистом приводом условиях. Этот биосенсора основывается на недавно разработанной технологии под названием СПАЗМЫ (систематическое сродство белка сила модуляции) 13. СПАЗМЫ включает привязывать взаимодействующих доменов белка с использованием ER / K компоновщик, который контролирует их эффективные концентрации. Обрамление линкер с FRET пары флуорофоров создает инструмент , который может сообщать о состоянии взаимодействия между белками 12. Ранее 1 модуль СПАЗМЫ был использован для привязывать к Gα С-концом к GPCR и контролировать их взаимодействие с FRET флуорофоров, mCitrine (далее в данном протоколе его широко известный вариант, желтый флуоресцентный белок (YFP), возбуждение / пик излучения при 490/525 нм) и mCerulean (далее в настоящем протоколе его широко известный вариант Cyan флуоресцентный белок (CFP), возбуждение / пик излучения 430/475 нм). От N- к С-концу, тего генетически кодируемых отдельный полипептид содержит: полная длина ХВГФ, лада акцептор (mCitrine / YFP), 10 нм ER / K компоновщик, лада донор (mCerulean / СФП), а Gα С-конец пептида. В этом исследовании, датчики сокращенно GPCR-линкер длиной Gα пептида. Все компоненты разделены неструктурированной (Gly-Ser-Gly) 4 линкера , который позволяет свободное вращение каждого домена. Подробная характеристика таких датчиков была ранее выполнена с использованием двух прототипические GPCRs: β 2 -АР и опсина 1.
Этот датчик трансфицированы в НЕК-293Т и флуорометре на основе экспериментах с клеточными мера спектров флуоресценции пары FRET в произвольных единицах число импульсов в секунду (CPS) в присутствии или в отсутствие лиганда живого. Эти измерения используются для вычисления соотношения FRET между флуорофоров (YFP макс / CFP макс). Изменение в FRET (ΔFRET) рассчитывается путем вычитания среднего отношения FRETнеочищенных образцов из соотношения лада лиганда образцах, обработанных. ΔFRET можно сравнить между конструкциями (β 2 -АР-10 нм-Gαs пептида по сравнению с не & beta ; 2--AR 10 нм не пептид). Здесь мы подробно протокол, чтобы выразить эти датчики в НЕК-293Т живых клеток, следить за их выражение, а установка, выполнение и анализ Флуорометр на основе живых клеток FRET измерения для необработанных клеток по сравнению условий наркотиков лечение. В то время как этот протокол является специфическим для β 2 -АР-10 нм-Gαs пептидной датчика обрабатывали 100 мкМ изопротеренол битартрат, она может быть оптимизирована для различных пар ХВГФ-Gα и лигандов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ДНК Приготовление
- Датчик Проектирование конструкций с использованием модульной схемы клонирования. Пожалуйста , ссылки конструкция датчика β 2 -АР подробно ранее 1.
- Готовят ДНК в соответствии с протоколом коммерческого набора Минипрепарат и элюции в 2 мМ раствора Трис-HCl, рН 8, при концентрации ≥ 750 нг / мкл, 260/280 1,7 - 1,9, 260/230 2,0 - 2,29.
2. Культура клеток Приготовление
- Культура НЕК-293Т-FLP-N клеток в среде DMEM, содержащей 4,5 г / л D-глюкозы, дополненной 10% ФБС (инактивированной нагреванием) (об / об), 1% L-глютамин добавка, 20 мМ HEPES, рН 7,5 при 37 ° C в увлажненной атмосфере при 5% СО 2. Обрабатывать клетки в биологической безопасности для колпака последующих шагов.
- Разрешить клеткам расти до сливающийся монослой , прежде чем пассажей в шесть-луночных блюд. Время достижения слитности зависит от начальной плотности металлизации. Используйте пластины, которыеприйти к сплошности в течение 1 - 2 дней обшивки в течение шести-хорошо металлизированный. Сливающийся 10 см тканевой культуры обработанных блюдо имеет плотность клеток примерно 4 × 10 6 клеток / мл. На рисунке 1 изображение роста клеточной культуры.
- Вымойте клеток с 10 мл PBS и Trypsinize с 0,25% трипсина (см Обсуждение, пункт 2). Пластина 8 х 10 5 клеток / лунку в 2 мл среды в тканевой культуре обработанные шесть также блюда и позволяют придерживаться в течение 16 - 20 часов.
3. Трансфекция условия
- Зигзагом трансфекций для конструкций, которые могут потребоваться разное количество времени для достижения оптимального выражения (между 20 - 36 ч). Синхронизировать условия для единого времени эксперимента. Также имеют нетрансфицированные управления скважиной при эквивалентной плотности клеток, которые будут использоваться для фонового шума и вычитанием рассеяния при анализе.
- Доведите реагенты трансфекции до комнатной температуры: уменьшенные сыворотки носитель, ДНК трансфекции реагента.
- ВБиологическое защитный кожух сочетают реагенты в стерильной микроцентрифужных трубки в следующем порядке: смешать 2 мкг ДНК с 100 мкл сыворотки восстановленных средств. Шип 6 мкл реагента для трансфекции в смеси носитель / ДНК, не касаясь поверхности смеси или сторону трубки. Установить одну реакцию трансфекции на лунку. условия Трансфекция могут быть оптимизированы (1 - 4 мкг ДНК, 3 - 6 мкл реагента для трансфекции), чтобы достичь устойчивых уровней экспрессии. В Таблице 1 более Оптимизиирует.
- Выдержите смесь при комнатной температуре в биологической Защитный кожух 15 - 30 мин. Не используйте реакцию, если оставить инкубировать в течение более 30 мин.
- Добавить реакцию клеток в каплям образом через хорошо и осторожно встряхните шесть хорошо, чтобы обеспечить тщательное смешивание. Добавьте одну реакцию на каждую лунку.
- Через 20 ч экспрессии, монитор флуоресценции с использованием тканевой культуры флуоресцентного микроскопа. Оценка экспрессии населения с 10-кратным объективных и белка локализации в клетке на 40Х. ObsЭрве для экспрессии белка в плазматической мембране (ПМ). Если существенная интернализации отмечается, следить за трансфекцию, пока значительное выражение не будет обнаружен в ПМ.
4. Реагент и оборудование Подготовка
- Подготовьте 100 мМ запасы лекарственных средств и хранят при -80 ° C: изопротеренол битартрат (100 мМ в дН 2 O , содержащего 300 мМ аскорбиновой кислоты). Сделайте на льду / в холодном помещении, а также флэш-немедленно заморозить. Порции могут быть получены и использованы до одного года.
- Приготовьте Cell Buffer (~ 2 мл / состояние) и хранить в C водяной бане при 37 °. Сделать свежий каждый день. Справочная таблица 2 для мобильных буферных компонентов.
- Готовят Drug буфер (10 мл) и хранят при комнатной температуре. Справочная таблица 2 для Buffer Drug компонентов.
- Кислотная промывка кюветах с использованием концентрированной HCl. Нейтрализовать со слабым основанием (1 М КОН), и тщательно промыть кюветах с дН 2 O.
- Подготовьте рабочую станцию вокруг флуорометре с несколькимикоробки 10, 200 и 1000 мкл пипеток, таймером , установленным с 10 мин обратный отсчет времени, в доступной вакуумной линии с наконечниками для очистки кювет, деликатных салфетками задач, и впрыскивают бутылка с сверхчистого H 2 O.
- Тепло внешней водяной бани для флуорометр и тепловой блок до 37 ° C.
- Включите флуорометре; установить программу сбора флуоресценции для сбора CFP к возбуждению 430 нм, полоса пропускания 8 нм; Дальность выброса 450 нм - 600 нм, полоса пропускания 4 нм. Для сбора YFP только в качестве контроля датчика (см Обсуждение) множество возбуждения на длине волны 490 нм, полоса пропускания 8 нм, диапазон излучения 500 - 600 нм, полоса пропускания 4 нм. Настройки сбора CFP будут использоваться для получения спектра FRET в этом эксперименте.
- Поместите двенадцать 1,5 мл микроцентрифужных труб в тепловой блок , как показано на рисунке 2. Эти трубки являются держателями для клеток аликвотных трубок (500 мкл микропробирок.) Поместите небольшой кусочек ткани в держателях 1 и 7, чтобы смягчить кюветки помещенные здесь.
Примечание: Используйте отдельные кюветы для необработанного состояния и состояния лекарственного средства для предотвращения перекрестного загрязнения.
Рисунок 2. микроцентрифужных трубки Настройка и Положение Ссылка в тепловой блок кювете для необработанных образцов находится в положении 1. ячейки аликвоты трубы находятся в положениях 2 - 6. Кювета для фармацевтических образцах, обработанных в положении 7; ячейки аликвоты трубы находятся в рабочем положении 8 - 12. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Заполните держатели 2 - 6 и 8 - 12 с ~ 750 мкл воды для создания мини-C на водяной бане 37 °.
- Поместите десять 500 мкл микроцентрифужных пробирок для клеточных аликвоты в мини-водяные бани (держатели 2 - 6, 8 - 12). Каждая трубка будет индивидуальное повторение условия (5 untreateд, 5 лекарственное лечение).
- Монитор клеток для экспрессии (см шаг 3.6).
5. Эксперимент и сбора данных
Рисунок 3. Экспериментальная Схема. Подробный пошаговый гид для экспериментальной установки и исполнения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Для экспериментальной схемы Reference Рисунок 3. Когда клетки готовы быть собраны, на основе экспрессии белка обнаруженного с флуоресцентным микроскопом (см Обсуждение, пункт 4): в биологическом защитном кожухе, осторожно удалить ~ 1 мл сред, ресуспендирования клеток в их культуре с P1,000 и передать взмучивания в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
Примечание: Избегайте использования трипсина, как это может переварить N-конец и /или связывающего кармана датчика GPCR. - Граф клеток, чтобы обеспечить надлежащую плотность клеток в взмучивания. Оптимизация объема ресуспендирования для 4 × 10 6 клеток / мл.
- Спин клетки в Бакет центрифуге при комнатной температуре, 290 мкг в течение 3 мин. Удалить супернатант после центрифугирования.
- ДЖЕНТЛИ ресуспендирования клеток в 1 мл клеточной буфера (хранится при 37 ° C) и повторить шаг 5.3. Во время второго спина, собрать 100 мМ препарат запаса аликвоты от -80 ° C. Сделайте разведение 1: 100 в буфере для лекарственных средств 1 мМ рабочего запаса и держать при комнатной температуре.
- После второго центрифугирования, удаления надосадочной жидкости и осторожно ресуспендирования клеток в 1 мл клеточной буфера (4 × 10 6 клеток / мл). Мера OD 600 образца в спектрофотометр с использованием 1 мл клеток , и 1 мл клеточной буфера в виде заготовки. Разлить клетки в одноразовую пластиковую кювету и передать обратно в микроцентрифужных трубку сразу после спектрофотометрии.
- Для управления нетрансфецированной челл состояние спектра, мягко ресуспендирования нетрансфецированные клеток в 1 мл клеточного буфера с P1,000 пипетку, добавьте 90 мкл клеток в кювете и приобрести FRET спектра при возбуждении 430 нм, полоса пропускания 8 нм, эмиссия 450 - 600 нм, полоса пропускания 4 нм. Соберите 3 - 5 спектров повторных со свежими 90 мкл клеток. Хранить запас клеток при 37 ° С между спецификациями, осторожно ресуспендируют с P1,000 между каждой пробы аликвоту, и прополоскать кювету с сверхчистой H 2 O между выборками.
- Для условий эксперимента, аликвотные 90 мкл трансфицированных клеток в каждую из 500 мкл трубок в держателях 2 - 6, 8 - 12 в тепловом блоке. Аккуратно ресуспендирования запас клеток с P1,000 пипеткой между каждой аликвоты.
- После того, как клетки аликвоты добавляют 10 мкл буфера лекарственных средств в пробирки 2 - 6 для необработанных образцов состояния.
- Начало эксперимента путем добавления 10 мкл 1 мМ раствора лекарственного средства в трубку 8, запустить таймер на обратный отсчет времени от 10 минут и аккуратно перемешать трубку с P200 пипеткой. Закрыть трубки и возврат к 37° тепла блок C.
- Сразу возьмите трубку 2, осторожно перемешать с P200 (используйте новый наконечник), добавьте 90 мкл суспензии клеток в необработанном состоянии кювете, и место в флуорометре.
- Приобретать FRET спектра при возбуждении 430 нм, полоса пропускания 8 нм, эмиссии 450 - 600 нм, полоса пропускания 4 нм.
- В 9 мин - 10 сек, шип трубки 9 с 10 мкл раствора лекарственного средства 1 мМ, осторожно перемешать с P200 (используйте новый наконечник), и возвратная трубка к теплу блок.
- Повторите шаги 5.10 - 5.11 с трубкой 3 и 5,12 с трубкой 10.
- Повторите шаги 5.10 - 5.13 с интервалом в 1 минуту (08:10, 07:10 и т.д.) до тех пор , пока спектры собираются для всех необработанных образцов состояния, и препарат был добавлен для всех образцов состояния лекарственного средства. Используйте свежий наконечник для каждого шага, чтобы предотвратить пипетки перекрестного загрязнения.
- В 5 мин - 10 сек, начинают смесительная трубка 8 (состояние лекарственного средства) осторожно P200 пипеткой, добавляют 90 мкл клеточной суспензии в отдельной кювете для наркотиков обработанного образца и место в флуорометре.
- Приобретать FRET спектр (см шаг 5.11 для настройки).
- Повторите шаги 5.15 - 5.16 с интервалом в 1 минуту (04:10, 03:10 и т.д.) для остальных образцов состоянии наркотическими средствами (трубы 9 - 12).
- После завершения эксперимента, сохраните файлы проекта, тщательно промыть кюветах с сверхчистого H 2 O, и повторно запаса труб для следующего состояния. Позаботьтесь, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение в стадии промывки. Изменение наконечник на бутылке H 2 O, а также на вакуумной линии между промывками.
Анализ 6. Данные
- Сохранение и файлы экспорта данных в SPC формате, который будет использоваться для анализа. Программы анализа доступны для загрузки с веб-сайта публикации Сиварамакришнан Lab.
- Создание файлов пути для программного обеспечения для анализа, которые включают программы анализа (V9, V15), нетрансфецированные образцы файлов (шаг 5.6 для нетрансфецированной сбора клеток спектра), файл выходных данных и значений, разделенных запятыми (CSV-файлы) для ввода данных.
- Введите следующую информациюв CSV - файл (см образец в таблице 3) и назначают соответствующие условия для каждого образца, в том числе:
Имя файла - отдельные SPC граф файлы
Рецептор - тестировался Назначенный который GPCR конструкцию (например, Β2)
Связующее вещество - Назначенный , который был испытан пептидный вариант конструкции (например, S) ,
Агонист - обозначают необработанной (N) или наркотиков лечение (D) условия
Directory - папка, в которой путь SPC файлы сохраняются, как правило, организованы по дате
OD - записывается оптическая плотность образца из спектрофотометра - Введите имена файлов для нетрансфецированной образцов (шаг 5.6) вычесть буфер и рассеяние шума из образцов.
- Введите условия в программу анализа.
- Запуск программ для анализа образцов в рамках индивидуальных условий (v9) и через условия (v15).
- Исключить файлы примеров, которые являются очевидными выпадающие в наборе данных, или настроить для вычитания путем увеличения или уменьшения значения ОП Indiviдвойные файлы.
- Экспорт данных в выходной файл для доступа к вычисленным FRET соотношения (525 нм / 475 нм).
- Вычислить ΔFRET путем вычитания среднего отношения FRET для необработанного состояния от индивидуальных FRET соотношений для обработанных условий (наркотиков).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обобщенная схема эксперимента установить и исполнение подробно описана на рисунке 3.
Для того, чтобы обнаружить изменение FRET в узком динамическом диапазоне датчика, важно придерживаться нюансы системы привалировать. Качество клетки является обязательным для экспрессии белка, а также последовательности в выборке. Рисунок 1 Характеристики изображения культивируемых клеток , растущих в последовательном монослоя (10Х) , который является оптимальным для шести хорошо металлизации и трансфекция Рисунок 1 (а) и клеток , растущих в слипаются узоры которые приводят к дендритных форм Рисунок 1 (б) , который не рекомендуется для последовательного покрытия. условия Трансфекция также могут быть оптимизированы для того, чтобы получить воспроизводимые выражения. Несколько условий были оптимизированы для рекомендованного трансфекции реагента , используемого здесь. Таблица 1 Данные условия для снижения сывороточных средах. ДНК, и трансфекция REAGent отношения.
После того, как все данные были собраны и введенные данные в файл CSV для анализа (см образец в таблице 3), сгенерированные результаты будут похожи на данные спектры Raw FRET , показанные на рисунке 4 (а) и нормированные, среднее FRET спектры показаны на рис 4 (б). На рисунке 4 красные спектры необработанные образцы и синий являются лекарственные обработанные образцы. Все спектры Сырье FRET на рисунке 4 (а) имеют достаточный диапазон сигнала к шуму для анализа данных последовательной (то есть., КПС при 450 нм по сравнению с СУЗ при 475 нм). При этом диапазоне спектры являются более гладкими и пик воды из пробы (комбинационное пик при 500 нм) также минимальна. Низкие уровни экспрессии приводят к видным пика воды, что препятствует анализу данных. Данные нормализованы при 475 нм, установка КПС данного значения до 1,0 (рисунок 4 (б)). В этом наборе данных для β 2 -АР-10 Нм-Gαs датчик пептида, есть существенное изменение в 525 нм чтение между необработанной (красный) и обработанных (синий) образцов. Изменение ΔFRET рассчитывается из соотношения FRET (525 нм / 475 нм) этих наборов данных и доступны через файл OUTPUT.
Если экспрессия белка низка, есть низкая эффективность трансфекции, или низкой плотности клеток в кювете для чтения флуоресценции, спектры могут появиться шумнее, как показано на рисунке 5. По сравнению с Рисунок 4 (а) диапазон сигнала к шуму для этого набор данных не является идеальным, приблизительно 1,0 -. 1,6, с КПС макс 4 х 10 5 Этот низкий уровень экспрессии способствует рваной спектров видели в необработанных данных Рисунок 5 (а), однако данные жесткие и в состоянии быть нормированный На рисунке 5 (б). Хотя пиков воды (~ 500 нм) не совпадает полностью между наборами данных Рисунок 5 (б) это ехперимента по - прежнему использоваться для анализа. Рисунок 6 является представителем эксперимента , который является недостаточным для анализа. В то время как отношение сигнал-шум образца составляет приблизительно 2 - 3 для обработанных (синий) и необработанных (красный) образцов, плотность клеток в кювете через образцах слишком низкий (450 нм значение 1 х 10 5) На рисунке 6 ( а). Это создает проблему в фоновом режиме вычитания и нормализации Рисунок 6 (б) и спектры не совпадают. Вычитание можно отрегулировать для образцов путем увеличения или уменьшения наружного диаметра в таблице 3. Тем не менее, даже при низкой плотности клеток, пик воды (~ 500 нм) , становится намного больше и шумнее Рисунок 6 (в) и ингибирует этот набор данных из дальнейшего анализа.
Рисунок 1. Пример культивированный роста клеток. Клетки , растущие в монослоя (а) Идеально подходят для последовательного обшивкой и трансфекцией. Клетки , которые появляются , чтобы расти в сгустки или дендритные структуры (б) не могут пластины последовательно в шести скважинах, может показать низкую эффективность трансфекции, и может создавать несоответствия в амплитуде спектра ладу. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Представитель Анализ данных для β 2 -АР-10 нм-Gαs Пептид ± Drug. Представитель изображения исходных данных (а) и нормированные усредненные данные (б) , собранных с & beta ; 2 -АР-10 датчика пептидной нм-Gαs с необработанными (красный) образцов и обработанный (синий) Samples после 5-минутной инкубации с 100 мкМ изопротеренол битартрата. CFP максимальная эмиссия при 475 нм, YFP макс эмиссии при 525 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Анализ бедных экспрессии белка с сырыми и нормализованные данные. Шумная спектры исходных данных (а) являются результатом низких уровней экспрессии, низкой плотности клеток в образце, и / или низкой эффективности трансфекции конструкции. Этот набор данных по - прежнему интерпретировать как нормированная (б), хотя это не является идеальным. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Анализ низких ячейки плотности в Флуорометр кювете с сырыми и нормализовали наборов данных. Низкая плотность клеток на образце, видно в исходных данных (а) усложняет воду / вычитание фона (B, C) и делает этот набор данных интерпретируемы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Состояние | 0.5x | 0.7x | 1x | 2x | 2x * |
| ДНК | 1 мкг | 1,4 мкг | 2 мкг | 4 мкг | 4 мкг |
| Снижение сыворотки СМИ | 100 мкл | 70 мкл | 100 мкл | 100 мкл | 200 мкл |
| реагент Трансфекция | 3 мкл | 4,2 мкл | 6 мкл | 6 мкл | 12 мкл |
| * Примечание: Рекомендуется для исключительно сложной конструкции. Осторожно следует принимать, так как это условие вызывает высокую гибель клеток. | |||||
Таблица 1. Трансфекция условия. Эта таблица включает в себя оптимизированные условия реагентов для трансфекциях в 2 мл лунки клеток НЕК-293Т с использованием рекомендованного реагента для трансфекции.
| Cell Buffer | ||
| объем | реактив | Комментарии |
| 9 мл | сверхчистых ДНКазы / РНКазы свободной воды | |
| 1 мл | HBS (10x), рН 7,4, хранят при температуре 4 ° C: | |
| 200 мМ HEPES | ||
| 50 мМ KCl, | ||
| 450 мМ NaCl | ||
| 20 мМ CaCl 2 - H 2 O | ||
| 10 мМ MgCl 2 - H 2 O | ||
| 100 мкл | 20% D-глюкозы | |
| 15 мкл | апротинин (1 мг / мл в дН 2 O) | предотвращения деградации |
| 15 мкл | лейпептина (1 мг / мл в дН 2 O) | предотвращения деградации |
| 100 мкл | аскорбиновая кислота (100 мМ в дН 2 O) * | стабилизировать агонист |
| * Добавить непосредственно перед началом анализа | ||
| Буферная Drug | ||
| объем | реактив | Комментарии |
| 9 мл | сверхчистых ДНКазы / РНКазы свободной воды | |
| 1 мл | HBS (10x), рН 7,4, хранят при температуре 4 ° C: | |
| 200 мМ HEPES | ||
| 50 мМ KCl, | ||
| 450 мМ NaCl | ||
| 20 мМ CaCl 2 - H 2 O | ||
| 10 мМ MgCl <к югу от > 2 - H 2 O | ||
| 100 мкл | аскорбиновая кислота (100 мМ в дН 2 O) * | стабилизировать агонист |
| * Добавить непосредственно перед началом анализа | ||
Таблица 2. Буферные конституантах. Подробности этой таблице реагенты , используемые , чтобы сделать одновременно клеточно буфер и средством для использования в эксперименте. Сделайте оба буфера свежие каждый день эксперимента; магазин ячеек буфера при 37 ° С, а буфер с наркотиками при комнатной температуре.
Таблица 3. Образец CSV файл для дальнейшего анализа. Этот файл данных образца выдвигает на первый план после того, как запись набора одного эксперимента. Несколько экспериментов могут быть введены в тот же файл CSV и можно различить в столбце "добавка" в случае необходимости. каждыйстрока должна быть заполнена со следующей информацией:
Имя файла - индивидуальный SPC граф файлы Рецептор - Назначенный , который был испытан GPCR конструкцию (например, Β2)
Связующее вещество - Назначенный , который был испытан пептидный вариант конструкции (например, S) ,
Агонист - обозначают необработанной (N) или наркотиков лечение (D) условия
Directory - папка, в которой путь SPC файлы сохраняются, как правило, организованы по дате
OD - записывается оптическая плотность образца в спектрофотометр
Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Плотный динамический диапазон измерений FRET в этой системе усиливает необходимость чувствительного контроля качества на каждом этапе этого протокола. Наиболее важные шаги для обеспечения успешного эксперимента FRET являются: 1) для культивирования клеток, 2) трансфекцию 3) экспрессии белка и 4) своевременно, четкая координация во время выполнения анализа.
здоровье клеток и качество обслуживания / покрытия может оказать существенное влияние на шум сигнала к экспериментальной системы и плохое состояние здоровья клеток может сделать невозможным обнаружить любое последовательное изменение в ладу. Консервативно, клетки являются самыми здоровыми в течение приблизительно 20 проходов, хотя это может варьироваться в зависимости от клеточной линии, обработки и условий культивирования. После того, как клетки испытывают трудности растут как сливающийся монослой, или начинают расти последовательно в более дендритных моделей (см рисунок 1 (б)), экспериментальный фоновый шум будет оказывать неблагоприятное воздействие. Тщательный уход клеток, в том числе рутинной лечеба изменения и регулярно вывозимый неадгезированных клеток и мусора от технического обслуживания пластин, будет способствовать повышению качества клеток для шести хорошо Обшивка и трансфекцию. Клеточные сгустки, которые отрицательно влияют на эффективность трансфекции, могут быть эффективно разделены на отдельные клетки путем обработки трипсином ремонтного пластин: лечить 10 см вырожденные блюда с 10 мл 0,25% трипсина в течение 30 сек, удалить трипсин, но оставить примерно 200 мкл, место блюдо в 37 ° C инкубатор для 2 - 3 мин. Клетки оторвется блюдо очень легко и менее восприимчивы к слипания.
Это имеет решающее значение для оптимизации шага трансфекции для этого эксперимента. Шесть колодцы должны быть в идеале 60 - 80% сплошности для эффективной трансфекции и оптимальной экспрессии. Если слишком мало клеток привязали (<60%), подождите приблизительно 2 - 6 ч до трансфекции, или до тех пор, по крайней мере, 70% клеток прилипают. Шесть-колодцы, которые более-конфлюэнтного (> 80%) также снизит эффективность трансфекции. Трансфекцию при более низкихклеток конфлуэнтности увеличивает скорость гибели клеток. Концентрация ДНК и чистота также являются критическими (шаг 1.2). Использование низкой концентрации и / или плохие препараты ДНК качества отрицательно повлиять на эффективность трансфекции условия Трансфекция могут быть скорректированы в конструкции, обратитесь к Таблице 1 для получения дополнительной информации.
Точная и постоянный контроль экспрессии белков с использованием тканевой культуры флуоресцентный микроскоп является еще одним важным шагом в этом процессе. Хотя этот шаг является предметом индивидуального суждения, то можно использовать другие методы, например, микроскопией, чтобы контролировать экспрессию в течение долгого времени количественно, если они не будут подробно описаны здесь. Для конструкций мы успешно протестированы в нашей системе, выражение занимает примерно 18-36 ч, чтобы достичь оптимального выражения. По нашему опыту, конструкции, которые обладают плохой выражение в течение этого времени окна редко улучшится после 40 ч. Конструкции мы опубликовали с не показали признаков degradatioп, однако это может быть проблемой для некоторых GPCRs. В наших тестах, ухудшение состояния датчика возможен временами трансфекции в течение 30 ч. Целостность датчика можно проверить с помощью коэффициентов YFP / CFP: 525 нм чтение из YFP-возбужденном (490 нм) спектра и 475 нм чтение из CFP-возбужденном (430 нм) спектра. Настройку см шаг 4.6. Рекомендуемые соотношения YFP / CFP находятся в диапазоне от 1,7 - 2,0, с идеальным соотношением 1,8. Эта величина зависит от приблизительная два раза большей яркостью YFP относительно CFP14. Поэтому интегральный датчик с минимальным ухудшением будет содержать как флуорофоры и имеют YFP: соотношение CFP приблизительно 2: 1. После того, как качество датчика было подтверждено, важно, чтобы подтвердить локализацию белка и экспрессию на плазматической мембране. Значительное внутриклеточная экспрессия может быть результатом либо деградации белков, интернализации или продолжающегося оборота белка. Монитор строит в течение долгого времени, чтобы увидеть, если выражение усиливается в плазматической мембране. Следующий критскую вызов в выражении является эффективность трансфекции. Примерно 70% КПД + трансфекция необходим для адекватного обнаружения сигнала к шуму в этой системе Флуорометр. Если меньше клетки трансфицируют, количество сигнал-шум все еще может быть обнаружено, но будет гораздо менее последовательны между образцами в одном эксперименте ладу. Это будет препятствовать точный анализ данных в узком динамическом диапазоне системы. Уровни экспрессии также представляют значительные препятствия для достижения достаточно сигнала к шуму во время эксперимента. Для уровней экспрессии детектируемых флуорометра, отношение сигнала между 475 нм и 450 нм (рассеяние клеток) 1,5 достаточна для обнаружения изменения FRET, однако оптимальной экспрессии будет иметь отношение приблизительно 2.0+. Для справки, данные β2-AR собирается в диапазоне сигнал-шум 4 × 10 5 сП (450 нм) до 1 × 10 6 сП (475 нм), отношение сигнал-шум 2.5. Это отношение поможет уменьшить количество variabiмируемости между образцами, которые также могут влиять на анализ данных. Эти уровни экспрессии также подвержены чувствительности и оптимального выравнивания Флуорометр оптики; другие системы могут потребоваться различные параметры для адекватной оптимизации сигнала к шуму.
Клетки чрезвычайно чувствительны к времени и температуры. После того, как экспериментальная процедура началась, бережное обращение имеет важное значение, чтобы избежать гибели клеток. Конкретные логистические меры могут быть приняты, чтобы ускорить процесс и избежать ошибок, в том числе своевременно подготовить рабочую станцию, убедившись, что все оборудование работает нормально, и распланировать цели эксперимента заранее. Он идеально подходит для использования клеток в течение 30 минут уборки урожая, а в нашей системе, этот протокол выполняется в течение 20 мин. После того, как метод освоен, а именно оптимизация трансфекцию и ловкость рук самого упражнения, этот эксперимент может быть использован для сравнения различных конструкций друг против друга, генерируют дозы-реsponse кривые, и датчик может быть расширен до G полноразмерного белка.
Хотя датчик FRET здесь используется уникальная разработка датчиков GPCR FRET, эта конкретная экспериментальная установка подробно описана как хорошо охарактеризованного анализа для осуществления датчика. Анализ флуорометр на основе позволяет большая популяция клеток, подлежащих оценке в каждом эксперименте и не зависит от очищенного белка или мембранных Preps, поэтому поддержание окружающей среды в естественных условиях. Этот экспериментальный дизайн также была оптимизирована для обнаружения очень небольшие изменения, наблюдаемые в системе при агонистом стимуляции GPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
РОМ финансировалось Американской кардиологической ассоциации Pre-докторских стипендий (14PRE18560010). Исследование финансировалось Американской кардиологической ассоциации Grant Scientist развития (13SDG14270009) и НИЗ (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105646-01-A1) в СС
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to RT before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to RT before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at RT |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
References
- Malik, R. U., et al. Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells. J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Alexander, N. S., et al. Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release. Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Conklin, B. R., et al. Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation. Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).
- Onaran, H. O., Costa, T. Where have all the active receptor states gone. Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M.
- Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
- Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).
- Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
- Stumpf, A. D., Hoffman, C. Optical probes based on G protein-coupled receptors - added work or added value. Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).
- Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
