G Protein-selektive GPCR Konformationer målt med FRET sensorer i en Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Abstract

Fӧrster resonans (FRET) -baserede undersøgelser er blevet mere og mere almindelige i undersøgelsen af ​​GPCR signalering. Vores forskning gruppen udviklede en FRET sensor intramolekylær at detektere interaktionen mellem Ga-underenheder og GPCR'er i levende celler efter agoniststimulering. Her har vi detaljeret protokol for at detektere ændringer i FRET mellem β _2-adrenerge receptor og Gαs C-terminalen peptid ved behandling med 100 pM isoproterenol hydrochlorid som tidligere karakteriseret ^en. Vores FRET sensor er et enkelt polypeptid bestående serielt af en fuld-længde GPCR, en FRET acceptor fluorophor (mCitrine), en ER / K spasme (systematisk protein affinitet styrke modulation) linker, et FRET donorfluorophor (mCerulean), og en Ga C terminale peptid. Denne protokol vil detalje celle forberedelse, transfektionsbetingelser, opsætning udstyr, assay udførelse, og dataanalyse. Denne eksperimentelle design registrerer små lmanges i FRET indikerer protein-protein interaktioner, og kan også anvendes til at sammenligne styrken af ​​vekselvirkningen tværs ligander og GPCR-G-protein-parringer. For at forbedre signal-til-støj i vores målinger, denne protokol kræver øget præcision i alle trin, og præsenteres her for at aktivere reproducerbar udførelse.

Introduction

G-protein-koblede receptorer (GPCR'er) er syv transmembrane receptorer. Det humane genom alene indeholder ca. 800 gener, der koder for GPCR'er, som aktiveres af en række forskellige ligander, herunder lys, lugtstoffer, hormoner, peptider, lægemidler og andre små molekyler. Næsten 30% af alle lægemidler i øjeblikket på målgruppe GPCR'ere fordi de spiller en stor rolle i mange sygdomstilstande ^2. Trods årtiers omfattende arbejde på denne receptor familie, der stadig betydelige udestående spørgsmål på området, især med hensyn til de molekylære mekanismer, der driver GPCR-effektor interaktioner. Til dato har kun en høj opløsning krystalstruktur blevet offentliggjort, at give indsigt i samspillet mellem β ₂ adrenerg receptor (β _2-AR) og Gs protein ^3. Sammen med omfattende forskning i de sidste tre årtier, det gentager en specifik strukturel komponent, der er afgørende i denneinteraktion: the Ga subunit C-terminalen. Denne struktur er vigtig for både G-protein-aktivering af GPCR ⁴ og G-protein udvælgelse ^5-6. Derfor er Ga C-terminus tilvejebringer en afgørende forbindelse mellem ligand stimulering af GPCR'en og selektiv G-protein-aktivering.

Forskning i det sidste årti tyder på, at GPCR'er udfylde en bred konformationel landskab, med ligandbindende stabiliserende undergrupper af GPCR konformationer. Mens flere teknikker, herunder krystallografi, NMR og fluorescensspektroskopi, og massespektrometri er tilgængelige til at undersøge GPCR konformationel landskab, er der for få af tilgange til at belyse deres funktionelle betydning i effektor udvalg ^7. Her vil vi skitsere en Fӧrster resonans (FRET) -baseret tilgang til at detektere G-protein-selektiv GPCR konformationer. FRET afhængig af nærhed og parallel orientering af to fluoroforer med overlappende emission (donor) and excitation (acceptor) spektre ^8. Som donor- og acceptor-fluoroforer kommer tættere på hinanden som et resultat af enten konformationel ændring i protein eller et protein-protein-interaktion, FRET mellem dem øges, og kan måles ved anvendelse af en række metoder ^8. FRET-baserede biosensorer er blevet anvendt i vid udstrækning i GPCR felt ^9. De er blevet anvendt til at probe kropsbygning ændringer i GPCR'en ved at indsætte donor og acceptor i den tredje intracellulære loop og GPCR C-terminus; sensorer er blevet designet til at undersøge GPCR og effektor interaktioner ved separat mærkning af GPCR og effektor (G proteinunderenheder / arrestiner) med et FRET-par ^10; nogle sensorer registrerer også konformationelle ændringer i G-proteinet ^11. Disse biosensorer har gjort det muligt for området til at stille en lang række udestående spørgsmål, herunder konformationelle ændringer i GPCR og effektor, GPCR-effektor interaktion kinetik og allosteriske ligander ^12. Vores gruppevar især interesseret i at skabe en biosensor, der kunne detektere G-protein-specifik GPCR konformationer under agonist-drevne betingelser. Denne biosensor baseret på en nylig udviklet teknologi ved navn spasmer (systematisk protein affinitet styrke modulation) ^13. Spasmer involverer tøjre interagerende protein domæner, der bruger en ER / K-linker, som styrer deres effektive koncentrationer. Flankerer linker med et FRET par fluoroforer skaber et værktøj, som kan rapportere tilstanden af interaktionen mellem proteiner ^12. Tidligere ^en krampe-modulet blev brugt til at binde den Ga C-terminalen til en GPCR og overvåge deres samspil med FRET fluoroforer, mCitrine (omhandlet i denne protokol ved sin almindeligt kendte variant, Gul fluorescerende protein (YFP), excitation / emission toppe på 490/525 nm) og mCerulean, excitation / peak emission 430/475 nm) (ved sin almindeligt kendt variant Cyan fluorescerende protein (CFP er nævnt i denne protokol). Fra N- til C-terminus, thans genetisk kodet enkelt polypeptid indeholder: en fuld længde GPCR, FRET acceptor (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K linker, FRET donor (mCerulean / CFP), og Ga C-terminus peptid. I denne undersøgelse er sensorer forkortet som GPCR-linkerlængde-Ga-peptid. Alle komponenter er adskilt af en ustruktureret (Gly-Ser-Gly) _4-linker, som muliggør fri rotation af hvert domæne. Den detaljerede karakterisering af sådanne sensorer er tidligere udført ved anvendelse af to prototypiske GPCR'er: β _2-AR og opsin ^1.

Denne sensor transient transficeret ind i HEK-293T-celler og fluorometer-baserede levende celle eksperimenter foranstaltning fluorescens spektre af FRET-parret i arbitrære enheder af tællinger pr sekund (CPS) i nærvær eller fravær af ligand. Disse målinger anvendes til at beregne et FRET forholdet mellem fluoroforer (YFP _max / CFP _max). En ændring i FRET (ΔFRET) beregnes derefter ved at trække den gennemsnitlige FRET forholdetaf ubehandlede prøver fra FRET forhold mellem ligand-behandlede prøver. ΔFRET kan sammenlignes på tværs konstruktioner (β _2-AR-10 nm-Gαs peptid versus P _2-AR-10 nm-intet peptid). Her har vi detaljeret protokol til at udtrykke disse sensorer i levende HEK-293T-celler, overvåge deres udtryk, og opsætningen, udførelse og analyse af fluorometer-baserede levende celler FRET måling for ubehandlet versus narkotika behandlede betingelser. Mens denne protokol er specifik for β _2-AR-10 nm-Gαs peptid sensor behandlet med 100 pM isoproterenol bitartrat, kan det optimeres til forskellige GPCR-Ga par og ligander.

Protocol

1. DNA-forberedelse

1. Design sensor-konstruktioner under anvendelse af en modulær kloning ordning. Referere venligst β _2-AR sensordesign beskrevet tidligere ^1.
2. Forbered DNA ifølge kommerciel miniprep kit protokol og elueres i 2 mM Tris-HCI-opløsning, pH 8, ved en koncentration ≥ 750 ng / pl, _A260 / _A280 på 1,7 - 1,9, _A260 / ₂₃₀ på 2,0 - 2,29.

2. Cell Culture Fremstilling

1. Kultur HEK-293T-Flp-N-celler i DMEM indeholdende 4,5 g / l D-glucose, suppleret med 10% FBS (varmeinaktiveret) (v / v), 1% L-glutamin supplement, 20 mM HEPES, pH 7,5 ved 37 ° C i befugtet atmosfære ved _5% CO2. Håndtag celler i biologiske sikkerhed hætte til efterfølgende trin.
2. Tillad celler at vokse til et konfluent monolag før passage i seks brønde. Tid til at nå konfluens afhænger indledende udpladningsdensitet. Brug plader,kommer til konfluens inden for 1 - 2 dage af udpladning til seks brønde plating. En sammenflydende 10 cm vævskultur-behandlet skål har celledensitet på ca. 4 x 10 ⁶ celler / ml. Se figur 1 for foto af vækst cellekultur.
3. Vask cellerne med 10 ml PBS, og Trypsinisér med 0,25% trypsin (se Diskussion, punkt 2). Plade 8 x 10 ⁵ celler / brønd i 2 ml medier i vævskultur-behandlede seks brønde og tillader at overholde for 16-20 timer.

3. transfektionsbetingelser

1. Sikkerhedsgrænser transfektioner for konstruktioner, der kan kræve forskellige mængder af tid for at opnå optimal ekspression (på 20 - 36 timer). Synkroniser betingelser for en samlet eksperiment tid. Også have en utransficerede kontrol godt ved tilsvarende celledensitet skal anvendes til baggrundsstøj og spredning subtraktion under analyse.
2. Bring transfektionsreagenser til stuetemperatur: nedsatte serum medier, DNA, transfektionsreagens.
3. I enbiologiske sikkerhed hætte kombinere reagenserne i et sterilt mikrocentrifugerør i følgende rækkefølge: bland 2 ug DNA med 100 pi nedsatte serum media. Spike 6 pi transfektionsreagens i medie / DNA-blandingen uden at røre overfladen af ​​blandingen eller siden af ​​røret. Opsæt en transfektion reaktion per brønd. Transfektionsbetingelser kan optimeres (1 - 4 pg af DNA, 3 - 6 pi transfektionsreagens) for at opnå ensartede ekspressionsniveauer. Se tabel 1 for mere optimerede nøgletal.
4. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i biologiske sikkerhed hætte i 15 - 30 min. Brug ikke reaktion hvis det overlades til inkubere i mere end 30 min.
5. Tilføj reaktion på celler i en drop-klog måde tværs godt og forsigtigt ryste seks brønde for at sikre grundig blanding. Tilsæt en reaktion per brønd.
6. Efter 20 timer af udtryk, overvåge fluorescens hjælp vævskultur fluorescens mikroskop. Vurdere population udtryk med 10X objektiv og protein lokalisering i en celle ved 40X. observe til proteinekspression på plasmamembranen (PM). Hvis betydelig internalisering bemærkes, overvåge transfektion indtil signifikant udtryk detekteres på PM.

4. Reagens og udstyr Klargøring

1. Forbered 100 mM narkotika aktier og opbevares ved -80 ° C: isoproterenol bitartrat (100 mM i dH ₂ O indeholdende 300 mM ascorbinsyre). Lav på is / i kølerum, og flash-freeze straks. Prøver kan foretages og anvendes op til et år.
2. Forbered Cell Buffer (~ 2 ml / tilstand) og opbevares i et 37 ° C vandbad. Foretag frisk hver dag. Henvisning tabel 2 for Cell Buffer vælgere.
3. Forbered Drug Buffer (10 ml) og opbevares ved stuetemperatur. Henvisning tabel 2 for Drug Buffer vælgere.
4. Syrevask kuvetter under anvendelse af koncentreret HCI. Neutraliser med en svag base (1 M KOH), og vaskes kuvetter med dH ₂ O.
5. Forbered arbejde station omkring fluorometer med flerekasser med 10, 200 og 1000 pi pipettespidser, en timer sæt med en 10 min nedtælling, en tilgængelig vakuum linje med tips til kuvette rengøring, delikat opgave klude, og sprøjte flaske med ultrarent _H2O
6. Varm ekstern vandbad i fluorometer og varmeblok til 37 ° C.
7. Tænd fluorometer; sæt fluorescens indsamlingsprogram til indsamling fælles fiskeripolitik at excitation 430 nm, båndpas 8 nm; emission fra 450 nm - 600 nm, båndpas 4 nm. For YFP samling kun som sensor kontrol (se Diskussion) sæt excitation til 490 nm, båndpas 8 nm, emission fra 500 - 600 nm, båndpas 4 nm. indstillinger fælles fiskeripolitiks indsamling vil blive brugt til at erhverve en FRET spektrum i dette eksperiment.
8. Placer tolv 1,5 ml mikrocentrifugerør i varmeblok som vist i figur 2 nedenfor. Disse rør er holdere til celle alikvote rør (500 pi mikrocentrifugerør.) Læg et lille stykke væv i holdere 1 og 7 for at afbøde de kuvetter placeret her.
   Bemærk: Brug separate kuvetter for ubehandlet tilstand og narkotika betingelse for at undgå krydskontaminering.

Figur 2. mikrocentrifugerør Opsætning og Position reference i Heat Block Cuvette for ubehandlede prøver er i position 1.; celle alikvote rør er i positionerne 2 - 6. Cuvette for narkotika behandlede prøver er i position 7; celle alikvote rør er i positionerne 8 - 12. Klik her for at se en større version af dette tal.

9. Fyld holdere 2 - 6 og 8 - 12 med ~ 750 pi vand for at skabe en mini 37 ° C vandbad.
10. Placer ti 500 pi mikrocentrifugerør til celle portioner i mini-vandbade (indehavere 2 - 6, 8 - 12). Hvert rør vil være en individuel gentagelse af betingelsen (5 untreated, 5 lægemiddelbehandlede).
11. Overvåg celler til ekspression (se trin 3.6).

5. Eksperiment & dataindsamling

Figur 3. Eksperimentel Skematisk. En detaljeret trinvis vejledning til eksperimentel opsætning og udførelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

1. Anmodning figur 3 for eksperimentel skematisk. Når celler er klar til at blive høstet, baseret på proteinekspression detekteres med fluorescens mikroskop (se Diskussion, punkt 4): i biologiske sikkerhed hætte, forsigtigt fjerne ~ 1 ml medier, resuspender cellerne i deres kultur med en P1,000 og overføre resuspension i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
   Bemærk: Undgå anvendelse af trypsin som det kan fordøje N-terminalen og /eller bindende lomme af GPCR sensoren.
2. Tæl celler til at sikre korrekt celletæthed i resuspension. Optimer resuspension volumen for 4 x 10 ⁶ celler / ml.
3. Spin celler i svingende spand centrifuge ved stuetemperatur, 290 xg i 3 min. Fjern supernatanten efter centrifugering.
4. GENTLY resuspender celler i 1 ml Cell Buffer (opbevaret ved 37 ° C) og gentag trin 5.3. Under anden centrifugering, samle 100 mM lægemiddelstamopløsning alikvot fra -80 ° C. Lav 1: 100 fortynding i Drug Buffer til 1 mM arbejdslager og holde ved RT.
5. Efter den anden centrifugering, fjern supernatanten og forsigtigt Resuspender cellerne i 1 ml Cell Buffer (4 x 10 ⁶ celler / ml). Mål OD ₆₀₀ af prøven i spektrofotometeret anvendelse af 1 ml celler og 1 ml Cell Buffer som blindprøve. Dispenser celler i en engangs plastik cuvette og overføre tilbage til et mikrocentrifugerør umiddelbart efter spektrofotometri.
6. For en kontrol utransficeret cell tilstand spektrum, forsigtigt resuspender utransficerede celler i 1 ml Cell Buffer med P1,000 pipette, tilsættes 90 ul celler til kuvetten og erhverve FRET spektret ved excitation 430 nm, båndpas 8 nm, emission 450-600 nm, båndpas 4 nm. Saml 3 - 5 gentagne spektre med friske 90 pi af celler. Hold bestand af celler ved 37 ° C mellem specs, resuspenderes forsigtigt med P1,000 mellem hver prøve portion, og skyl kuvetten med ultrarent _H2O mellem prøverne.
7. For forsøgsbetingelser, aliquot 90 pi af transficerede celler til hver af de 500 pi rør i holderne 2 - 6, 8 - 12 i varmen blok. resuspender forsigtigt lager af celler med P1,000 pipette mellem hver portion.
8. Efter celler opdeles i portioner, tilsættes 10 ul Drug Buffer til rørene 2 - 6 for ubehandlede tilstand prøver.
9. Begynd eksperiment ved at tilsætte 10 pi af 1 mM lægemiddelopløsning i røret 8, starte timeren at tælle ned fra 10 min, og forsigtigt blande rør med P200 pipette. Luk rør og vende tilbage til 37° C varme blok.
10. afhente straks op rør 2, bland forsigtigt med P200 (brug en ny spids), tilsættes 90 ul cellesuspension til ubehandlet tilstand kuvetten, og plads i fluorometer.
11. Anskaf FRET spektret ved excitation 430 nm, båndpas 8 nm, emission 450-600 nm, båndpas 4 nm.
12. Ved 9 min - 10 sek, spike rør 9 med 10 pi 1 mM narkotika løsning, forsigtigt blandes med en P200 (brug ny spids), og returnere rør til varme blok.
13. Gentag trin 5,10-5,11 med rør 3 og 5,12 med røret 10.
14. Gentag trin 5,10-5,13 med 1 min intervaller (08:10, 07:10, etc.) indtil spektre indsamles for alle ubehandlede tilstand prøver, og narkotika er blevet tilføjet alle narkotika tilstand prøver. Brug en ny spids for hver pipette skridt for at undgå krydskontaminering.
15. Ved 5 min - 10 sek, begynde at blande rør 8 (lægemiddel tilstand) forsigtigt med P200 pipette, tilsættes 90 ul cellesuspension til særskilt kuvette for narkotika behandlet gødning og fluorometer.
16. Anskaf FRET spektrum (se trin 5.11 for indstillinger).
17. Gentag trin 5,15-5,16 med 1 min intervaller (04:10, 03:10, etc.) for de resterende stof tilstand prøver (rør 9 - 12).
18. Efter eksperiment slutter, gem projektfiler, vaskes kuvetter med ultrarent _H2O, og re-lager rør til næste tilstand. Vær omhyggelig med at undgå krydskontaminering i vask trin. Ændre tip på _H2O flaske samt på vakuumledningen i mellem vaskene.

6. Data Analysis

1. Gem og eksport datafiler i SPC format der skal anvendes til analyse. Analyse programmer er tilgængelige for download fra Sivaramakrishnan Labs websted publikation.
2. Opret sti filer til analyse software som omfatter analyse programmer (v9, V15), utransficerede prøver filer (se trin 5.6 for utransficerede celle spektrum samling), OUTPUT datafil, og kommaseparerede værdier (CSV) filer til indtastning af data.
3. Indtast følgende oplysningeri CSV-fil (se prøve i tabel 3) og udpege respektive betingelser for hver prøve, herunder:
   Filnavn - individuelle SPC graf filer
   Receptor - udpege som GPCR konstruktion blev testet (f.eks Β2)
   Binder - udpegede hvilket peptid variant af konstruktionen blev afprøves (, S)
   Agonist - udpege ubehandlet (N) eller narkotika behandlet (D) betingelser
   Directory - stien mappe, hvor SPC filer gemmes, normalt organiseret efter dato
   OD - indspillet optisk tæthed på prøve fra spektrofotometer
4. Indtast filnavne for utransficerede prøver (trin 5.6) til at subtrahere puffer og spredende støj fra prøver.
5. Indtast betingelser i analyseprogram.
6. Kør programmer til at analysere prøver inden for de enkelte forhold (V9) og på tværs af forhold (v15).
7. Udeluk eksempelfiler som er tilsyneladende outliers i datasættet, eller justere for subtraktion ved at øge eller sænke OD-værdi af indobbelt filer.
8. Eksport af data til output-fil for at få adgang til beregnet FRET nøgletal (525 nm / 475 nm).
9. Beregn ΔFRET ved at trække den gennemsnitlige FRET ratio for ubehandlet tilstand fra de enkelte FRET nøgletal for behandlede (narkotika) betingelser.

Representative Results

En generaliseret skematisk af eksperimentet oprettet og udførelse er detaljeret i figur 3.

For at detektere et FRET ændring i det snævre dynamikområde af sensoren, er det afgørende at holde sig til nuancerne i systemet skal overholdes. Cellernes kvalitet er bydende nødvendigt at proteinekspression samt sammenhæng i prøveudtagning. Figur 1 Funktioner billeder af dyrkede celler, der vokser på en sammenhængende monolag (10X), der er optimal for seks brønde plettering og transfektion figur 1 (a), og celler, der vokser i sammenklumpede mønstre der fører til dendritiske figurer Figur 1 (b), der ikke anbefales til konsekvent plating. Transfektionsbetingelser kan også optimeres for at opnå reproducerbare ekspression. Flere forhold er blevet optimeret til den anbefalede transfektionsreagens bruges her. Tabel 1 detaljer disse betingelser til formindskede serum medier. DNA og transfektion reagent nøgletal.

Når alle data er blevet indsamlet og oplysninger i CSV-filen til analyse (se prøve i tabel 3), de genererede resultater vil ligne Raw FRET spektre data vist i figur 4 (a), og den normaliserede, gennemsnitlige FRET spektre vist i figur 4 (b). I figur 4 de røde spektre er de ubehandlede prøver og den blå de lægemiddelbehandlede prøver. Alle de Raw FRET spektre i figur 4 (a) har tilstrækkelig signal-støj interval for konsistent dataanalyse (dvs.., CPS ved 450 nm sammenlignet med CPS ved 475 nm). Med dette interval, spektrene er glattere og vandet peak fra prøven (Raman top er ved 500 nm) er også minimal. Lave ekspressionsniveauer resultere i en fremtrædende vand peak, der forstyrrer dataanalyse. Data normaliseres ved 475 nm, indstilling af CPS af denne værdi til 1,0 (figur 4 (b)). I dette datasæt for β _2-AR-10 Nm-Gαs peptid sensor, der er en signifikant ændring på 525 nm læse mellem ubehandlede (rød) og behandlet (blå) prøver. Den ΔFRET Ændringen beregnes ud fra FRET forhold (525 nm / 475 nm) af disse datasæt og er tilgængelige via OUTPUT-filen.

Hvis proteinekspression er lav, er der ringe transfektionseffektivitet, eller lav celledensitet i kuvetten til fluorescens læsning, spektre kan forekomme mere støjende, som vist i figur 5. Sammenlignet med figur 4 (a) signal-til-støj interval for denne datasæt er ikke ideel, ved ca. 1,0 -. 1,6, med CPS _max på 4 x 10 ⁵ Dette lave ekspressionsniveau bidrager til den takkede spektre ses i rådata figur 5 (a), men dataene er stram og i stand til at være normaliseret Figur 5 (b). Selvom vandet toppe (~ 500 nm) ikke line op helt mellem datasæt figur 5 (b) denne exeksperimentere stadig er brugbart til analyse. figur 6 repræsenterer et eksperiment, der er utilstrækkelig til analyse. Mens signal-støj af prøven er ca. 2 - 3 i for behandlet (blå) og ubehandlede (røde) prøver, celledensitet i kuvetten tværs prøver er for lav (450 nm værdi på 1 x 10 ⁵⁾ Figur 6 ( a). Dette skaber et problem i baggrunden subtraktion og normalisering Figur 6 (b), og spektre ikke justere. Subtraktion kan justeres for prøver ved forøgelse eller formindskelse OD i tabel 3. Men selv med lav celletæthed, peak vand (~ 500 nm) bliver meget større og mere støjende Figur 6 (c) og inhiberer dette datasæt fra yderligere analyse.

Figur 1. Eksempel på Cultured cellevækst. Celler, der vokser i et monolag (en) Er ideelle til konsekvent plating og transfektion. Celler, der synes at vokse i klumper eller med dendritiske mønstre (b) må ikke plade konsekvent i seks-brønde, kan vise dårlig transfektion effektivitet, og kan skabe uoverensstemmelser i amplituden af FRET spektrum. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Repræsentant dataanalyse for β _2-AR-10 nm-Gαs Peptide ± Drug. Repræsentant billede af rådata (a) og normaliseret, gennemsnitsdata (b) opsamles med β _2-AR-10 nm-Gαs peptid sensor med ubehandlede (rød) prøver og behandlet (blå) spler efter 5 minutters inkubation med 100 uM isoproterenol bitartrat. FFP _max emission ved 475 nm, YFP _max emission ved 525 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Analyse af Poor Protein Expression med Raw og normaliserede data. Støjende rådata spektre (a) er et resultat af lave ekspressionsniveauer, lav celletæthed per prøve, og / eller dårlig transfektion effektivitet konstruktion. Dette datasæt er stadig tolkes som normaliseret (b), selv om det ikke er ideelt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6. Analyse af Low Cell Density i Fluorometer Cuvette med Raw og Normalized datasæt. Den lave celledensitet per prøve, set i rå data (a) komplicerer vand / baggrund subtraktion (b, c) og gør dette datasæt tolke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tilstand	0.5x	0,7x	1x	2x	2x *
DNA	1 ug	1.4 pg	2 ug	4 ug	4 ug
Reducerede serum medier	100 pi	70 pi	100 pi	100 pi	200 pi
transfektionsreagens	3 pi	4.2 pi	6 pi	6 pi	12 pi
* Bemærk: Anbefales til usædvanligt vanskelig konstruktion. Der bør udvises forsigtighed, da denne tilstand fremkalder høj celledød.

Tabel 1. transfektionsbetingelser. Denne tabel indeholder de optimerede betingelser for reagenser til transfektioner i 2 ml brønde i HEK-293T-celler ved anvendelse af den anbefalede transfektionsreagens.

celle Buffer
Bind	Reagens	Kommentarer
9 ml	ultrarent DNase / RNase-frit vand
1 ml	HBS (10x), pH 7,4, opbevares ved 4 ° C:
	200 mM HEPES
	50 mM KCI
	450 mM NaCl
	20 mM CaCl2 - H2O
	10 mM MgCl2 - H2O
100 pi	20% D-glucose
15 pi	aprotinin (1 mg / ml i dH2O)	forhindre nedbrydning
15 pi	leupeptin (1 mg / ml i dH 2 O)	forhindre nedbrydning
100 pi	ascorbinsyre (100 mM i dH2O) *	stabilisere agonist
	* Tilføje umiddelbart før du begynder assay
Drug Buffer
Bind	Reagens	Kommentarer
9 ml	ultrarent DNase / RNase-frit vand
1 ml	HBS (10x), pH 7,4, opbevares ved 4 ° C:
	200 mM HEPES
	50 mM KCI
	450 mM NaCl
	20 mM CaCl2 - H2O
	10 mM MgC <sub> 2 - H 2 O
100 pi	ascorbinsyre (100 mM i dH2O) *	stabilisere agonist
	* Tilføje umiddelbart før du begynder assay

Tabel 2. Buffer Bestanddele. Denne tabel viser de anvendte reagenser til at gøre både Cell Buffer and Drug Buffer til anvendelse i eksperimentet. Foretag begge buffere friske hver dag af forsøget; butik Cell Buffer ved 37 ° C, og Drug puffer ved stuetemperatur.

Tabel 3. Eksempel på CSV-fil til analyse. Denne prøve datafil fremhæver posten indstillet efter et eksperiment. Flere eksperimenter kan indtastes i samme CSV-fil og kan skelnes under "Additive 'kolonne, hvis det er nødvendigt. Hverrækken skal udfyldes med følgende oplysninger:
Filnavn - individuel SPC graf filer Receptor - udpege som GPCR konstruktion blev testet (f.eks Β2)
Binder - udpegede hvilket peptid variant af konstruktionen blev afprøves (, S)
Agonist - udpege ubehandlet (N) eller narkotika behandlet (D) betingelser
Directory - stien mappe, hvor SPC filer gemmes, normalt organiseret efter dato
OD - indspillet optisk tæthed på prøve i spektrofotometer
Klik her for at se en større version af denne tabel.

Discussion

Den stramme dynamikområde FRET målinger i dette system forstærker behovet for følsomme kvalitetskontrol i alle trin i denne protokol. De vigtigste skridt til at sikre en vellykket FRET eksperiment er 1) celledyrkning, 2) transfektion 3) proteinekspression og 4) rettidig, præcis koordinering under analysen udførelse.

Cell sundhed og vedligeholdelse / plating kvalitet kan have en betydelig indvirkning på signal-til-støj af eksperimentelle system og dårlig celle sundhed kan gøre det umuligt at opdage enhver konsekvent ændring i FRET. Konservativt, celler er sundest for cirka 20 passager, selvom dette kan variere baseret på cellelinie, håndtering og dyrkningsbetingelser. Når cellerne har svært vokser som en sammenflydende monolag, eller begynde at vokse konsekvent i flere dendritiske mønstre (se figur 1 (b)), vil eksperimentel baggrundsstøj blive påvirket negativt. Omhyggelig celle vedligeholdelse, herunder rutinemæssig media ændringer og regelmæssigt fjerne ikke-klæbende celler og snavs fra vedligeholdelse plader, vil øge kvaliteten af ​​cellerne for seks-godt plating og transfektioner. Cell klumper, der skader transfektionseffektiviteten, effektivt kan adskilles i enkelte celler ved trypsinisering af vedligeholdelse plader: behandle 10 cm sammenflydende retter med 10 ml 0,25% trypsin i 30 sek, fjerne trypsin men lad ca. 200 pi, sted fad i 37 ° C inkubator til 2 - 3 min. Celler vil komme ud skålen meget let og er mindre modtagelige for sammenklumpning.

Det er afgørende at optimere transfektion trin til dette eksperiment. Six-brønde skal ideelt set 60 - med 80% sammenflydende til effektiv transfektion og optimal udtryk. Hvis for få celler har levet (<60%), vent ca. 2 - 6 timer til transfektion, eller indtil mindst 70% af cellerne overholdes. Six-brønde, der er over-sammenflydende (> 80%) vil også reducere transfektionseffektiviteten. Transfektion ved laverecellekonfluens øger celledød sats. DNA-koncentration og renhed er også kritiske (se trin 1.2). Brug lav koncentration og / eller dårlig kvalitet DNA-præparater påvirker negativt transfektionseffektivitet transfektionsbetingelser kan justeres pr konstruktion, se tabel 1 for yderligere oplysninger.

Nøjagtig og konsekvent overvågning af protein-ekspression ved hjælp af en cellekultur fluorescens mikroskop er endnu et afgørende skridt i denne proces. Selvom dette trin er underlagt individuel vurdering, er det muligt at anvende andre teknikker, såsom mikroskopi, til at overvåge ekspression over tid kvantitativt, selvom de ikke er beskrevet detaljeret her. For konstruktioner, vi har testet med succes i vores system, udtryk tager cirka 18-36 timer at nå den optimale udtryk. Det er vores erfaring, konstruerer, at displayet dårlig udtryk i denne tid vindue sjældent bedre efter 40 timer. Konstruktionerne har vi udgivet med ikke har vist tegn på degradation, men dette kan være et problem for nogle GPCR'er. I vores analyser, sensor nedbrydning findes i transfektions- gange over 30 timer. Sensor integritet kan testes ved hjælp af YFP / FFP-forhold: 525 nm læsning fra YFP-ophidset (490 nm) spektrum, og 475 nm læsning fra CFP-ophidset (430 nm) spektrum. For indstillinger, se trin 4.6. Anbefalede nøgletal YFP / FFP er i størrelsesordenen 1,7 - 2,0, med en ideel forhold på 1,8. Denne værdi afhænger af den omtrentlige to gange større lysstyrke YFP forhold til CFP14. En integreret sensor med minimal nedbrydning vil derfor indeholde både fluorophorer og har YFP: CFP forhold på ca. 2: 1. Efter sensor kvalitet er blevet bekræftet, er det vigtigt at bekræfte proteinlokalisering og ekspression på plasmamembranen. Signifikant intracellulær ekspression kan være et resultat af enten proteinnedbrydning, internalisering, eller igangværende handel af proteinet. Monitor-konstruktioner over tid for at se, om ekspression forstærkes ved plasmamembranen. Den næste critical udfordring i ekspression er transfektionseffektiviteten. Ca. 70% + transfektionseffektivitet er nødvendige for en tilstrækkelig signal-til-støj detektering i denne fluorometer system. Hvis færre celler transficeres, kan mængden af ​​signal-til-støj stadig være detekterbar, men vil være meget mindre konsistent mellem prøverne i en FRET eksperiment. Det vil hæmme nøjagtig dataanalyse inden for det snævre dynamikområde af systemet. Ekspressionsniveauer også udgør en væsentlig forhindring for at opnå rigelig signal-til-støj under eksperimentet. For ekspressionsniveauer kan påvises ved fluorometeret, forholdet mellem signal mellem 475 nm og 450 nm (celle spredning) på 1,5 er tilstrækkeligt til at detektere en ændring i FRET, vil imidlertid optimal ekspression har et forhold på ca. 2.0+. For reference, er β2-AR data indsamlet i et signal-til-støj området fra 4 x 10 ⁵ CPS (450 nm) til 1 x 10 ⁶ cps (475 nm), signal-til-støj-forhold på 2,5. Dette forhold vil medvirke til at reducere mængden af ​​variabiheden mellem prøver, som også kan påvirke dataanalyse. Disse ekspressionsniveauerne er også omfattet af den følsomhed og optimal tilpasning af de fluorometer optik; andre systemer kan kræve forskellige parametre for tilstrækkelig signal-til-støj optimering.

Celler er ekstremt følsomme overfor tid og temperatur. Når den eksperimentelle procedure er begyndt, skånsom håndtering er vigtigt at undgå celledød. kan træffes særlige logistiske foranstaltninger til at fremskynde processen og undgå rettidige fejltagelser, herunder forberede arbejdet station, og sørg alt udstyr fungerer korrekt, og planlægning ud målene i forsøget på forhånd. Det er ideelt at bruge celler inden for 30 min af høst, og i vores system, er denne protokol udføres inden for 20 min. Når teknikken er styr på den, specielt transfektion optimering og håndelag af selve motion, dette forsøg kan anvendes til at sammenligne forskellige konstruktioner mod hinanden, generere dosis-respons kurver, og sensoren kan udvides til fuld længde G-protein.

Selvom FRET sensor bruges her er en unik udvikling i GPCR FRET sensorer, er denne specifikke forsøgsopstilling detaljeret som et godt karakteriseret assay for gennemførelsen af ​​sensoren. Fluorometeret-baseret assay tillader en stor population af celler, der skal vurderes i hvert forsøg og er ikke afhængig af oprenset protein eller membran preps, fastholder derfor et in vivo miljø. Denne eksperimentelle design er også blevet optimeret til at detektere meget små ændringer, der ses i systemet ved agonist stimulering af GPCR'en.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor	Addgene	47438	https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Fermentas/Fisher Sci	FERK0503	Elute in 2 mM Tris elution buffer
HEK-293T-Flp-n cells	Life Technologies	R78007
Trypsin (0.25%)	Life Technologies	25200056
DMEM- high glucose	Life Technologies	11960-044	Warm in  37 °C water bath before use
FBS, certified, Heat inactivated, US origin	Life Technologies	10082147
Glutamax I 100x	Life Technologies	35050061
HEPES	Corning	MT25060CL
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Reduced serum media; Bring to RT before use
XtremeGene HP transfection reagenet	Roche	6366236001	Highly recommended for its consistency. Bring to RT before use
FluoroMax 4	Horiba		Use with FluorEssence V3.8 software
3-mm path length quartz cuvette	Starna	NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)	May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna
Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump	Fisher Scientific	13-874-826	Warm to 37 °C before use
Thermomixer Heat Block	Eppendorf	22670000	Warm to 37 °C before use
Ultrapure DNA/RNAse free water	Life Technologies	10977015	Use at RT
D(+)-glucose, anhydrous	Sigma	G5767
aprotinin from bovine lung	Sigma	A1153
leupeptin hemisulfate	EMD	10-897
L-ascorbic acid, reagent grade	Sigma	A0278
(-)-isoproterenol (+)-bitartrate	Sigma	I2760	Use fresh aliquot each experiment