Summary
Ici, nous présentons un protocole pour quantifier les particules allergènes chargé par cytométrie de flux. particules de matières particulaires ambiantes peuvent agir en tant que porteurs d'allergènes adsorbées. Nous montrons ici que la cytométrie en flux, une méthode largement utilisée pour caractériser les solides en suspension> 0,5 um de diamètre, peut être utilisé pour mesurer ces particules d'allergène chargé.
Abstract
La cytométrie en flux est une méthode largement utilisée pour quantifier les matières en suspension telles que des cellules ou des bactéries présentes dans une gamme de taille de 0,5 à plusieurs dizaines de micromètres de diamètre. En plus d'une caractérisation des propriétés de diffusion vers l'avant et sur le côté, il permet l'utilisation de marqueurs fluorescents marqués comme des anticorps pour détecter des structures respectives. Utilisation de coloration d'anticorps indirecte, par cytométrie de flux est employé ici pour quantifier le bouleau allergène du pollen (Bet précisément v 1) des particules de 0,5 à 10 um chargé en diamètre dans la matière particulaire inhalable (PM10, la taille des particules ≤10 um de diamètre). les particules PM10 peuvent agir en tant que porteurs d'allergènes adsorbées éventuellement de les transporter vers les voies respiratoires inférieures, où ils pourraient déclencher des réactions allergiques.
Jusqu'à présent, la teneur en allergène P10 a été étudiée au moyen d'une enzyme liée immunosorbant essais (ELISA) et la microscopie électronique à balayage. ELISA mesures de la dissolution et non la particuleallergène liØe. Par rapport à la microscopie électronique à balayage, ce qui permet de visualiser des particules d'allergène chargé, la cytométrie en flux peut en outre quantifier. Comme la teneur en allergènes de l'air ambiant peut dévier du taux de pollen de bouleau, les symptômes allergiques pourraient peut-être une meilleure corrélation avec l'exposition aux allergènes qu'avec les pollens. En conjonction avec les données cliniques, la méthode présentée offre la possibilité de tester dans des expériences futures si des réactions allergiques au bouleau antigènes de pollen sont associés avec le Bet v 1 teneur en allergènes de particules PM10> 0,5 um.
Introduction
La pollution atmosphérique est considérée comme une cause environnementale importante de l'augmentation de l' incidence et la gravité des allergies respiratoires observées au cours des dernières décennies 1-3. De plus, il y avait un intérêt croissant pour la distribution d'allergènes communs 4,5 à poussière.
Le pollen de bouleau peut provoquer le rhume des foins , mais peut aussi être un déclencheur important de l' asthme allergique 8/6. Le total du pollen de bouleau est pas susceptible de pénétrer dans les voies respiratoires inférieures ou se trouvent dans PM10 en raison de sa taille (22 m de diamètre). Cependant, les allergènes de pollen de bouleau comme Bet v 1, le composant majeur du pollen de bouleau allergène, peuvent être libérés après pollen rupture 9 et peuvent se lier à des particules dans l'air ambiant 10, donc peut - être entrer dans les voies respiratoires inférieures. En effet, il a été démontré que MP10 peut contenir des allergènes biologiquement actifs comme démontré par une activation in vitro de basophiles d'un propositus allergique au pollen 11
Bet v 1 Contenu de l' allergène dans des échantillons PM10 a été étudié par l' extraction de l'allergène respectif et la quantification ultérieure avec ELISA 12-14. Avec la technique ELISA, l'allergène dissous a été mesurée, mais la quantité de particules d'allergène chargé restait inconnue. La microscopie électronique à balayage a révélé des particules d'allergène chargé , mais n'a pas permis la quantification 10,15.
La présente étude utilise une cytométrie de flux pour quantifier la proportion de particules P10 de Bet v 1 chargés dans des échantillons d'air ambiant. En raison de la limite de détection du cytomètre que les particules supérieures à 0,5 pm peuvent être examinées. La> 0,5 um fraction de PM10 sera encore appelé PM10> 0,5.
Protocol
NOTE: Ce protocole décrit la coloration indirecte des particules PM10 avec un anticorps monoclonal (anticorps IgG1 monoclonal de souris, clone MA-3B4) contre Bet v 1, la principale composante de l'antigène de pollen de bouleau, plus un Allophycocyanin (APC) marqué au anticorps secondaire (anti -Mouse anticorps IgG1, le clone A85-1) et l'analyse subséquente sur un cytomètre de flux. Avec d'autres anticorps appropriés disponibles, ce procédé pourrait être étendu à la détection d'autres antigènes liés à des particules dans l'air ambiant.
1. PM10 Échantillonnage
- Recueillir PM10 dans l' air ambiant de polytétrafluoroéthylène (PTFE) filtres à l' aide d' un échantillonneur à faible volume avec un taux de 2,3 m 3 / h (Figure 1) d'écoulement. Une caractérisation du dispositif de prélèvement utilisé pour les expériences décrites ici se trouve dans le 16. Durée dépend de la quantité de PM10 nécessaire (généralement entre 1 et 10 jours).
- A la fin de la période d'incubation, enlever le filtre de l'échantillonneur et le gel au moment de-20 ° C jusqu'à utilisation.
Figure 1. Faible volume de PM10 échantillonneur. Exemple d'un faible volume de sampler PM10. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Retrait 2. PM10 et nombre de particules
- Laissez le dégel du filtre PTFE pendant environ 5 min. Ensuite, mettez le filtre dans un polystyrol propre boîte de Petri (figure 2A). Prenez une nouvelle boîte de Pétri pour chaque filtre, si plus d'un filtre est traité.
- Par la suite, recouvrir le filtre en PTFE avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ce protocole est établi pour une concentration en PM10 finale de 8x10 6 particules par ml (voir l' étape 3.3). Pour obtenir au moins que la concentration, utiliser le volume empirique suivante de PBS pour superposer le filtre avec: Si le temps de collecte PM10 était < 2 jours, utiliser 2 ml. Pour des temps d'incubation ≥ 2 jours, utiliser 4 ml.
NOTE: Afin d'augmenter la concentration en particules de la suspension PM10, suspensions de différents filtres peuvent être mis en commun, si cela est approprié. - Tenez le filtre de PTFE avec des pincettes et brosse avec une brosse à dents électrique avec une tête sensible à la brosse pendant 1 min (figures 2B, 2C). Transférer la particule-PBS-suspension, ci-après appelée suspension PM10, à un tube de réaction propre.
Figure 2. PM10 retrait avec une brosse à dents électrique. Un filtre de polytétrafluoroéthylène avec échantillonné PM10 est placé dans une boîte de Pétri polystyrol (A) et est recouvert avec 4 ml de PBS. Ensuite, MP10 est enlevée avec une brosse à dents électrique (B: avant le brossage et C: après le brossage pendant 1 min).= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Mesurer la concentration de particules P10, par exemple par utilisation d'un compteur de particules. Diluer un volume adéquat de PM10 suspension tels que 50 ul dans 10 ml de tampon de mesure isotonique, mesurer trois fois et calculer le nombre total moyen de particules par ml. Veillez à utiliser un compteur de particules qui permet de détecter des particules de la taille pertinente.
3. Bet v 1 Coloration
- Calculer le nombre de tubes de réaction nécessaires pour l'analyse de l'échantillon: au moins trois tubes de réaction sont nécessaires: (i) un tube contenant l'échantillon uniquement (contrôle natif), (ii) un tube avec l'échantillon plus un anticorps secondaire (contrôle négatif) et ( iii) un tube avec un échantillon plus anticorps primaire et secondaire (échantillon spécifique). Si elles sont mesurées pour la première fois, préparer au moins deux tubes de réaction (i) (ii),et (iii) d'avoir assez de matériel pour régler correctement les paramètres cytomètre (voir étape 4.1).
- Calculer la quantité de suspension MP10 nécessaire pour le nombre de tubes de réaction. Chaque tube de réaction nécessite 50 ul de la suspension.
- Ajuster la concentration en particules mesurée à l' étape 2.4 pour le volume de suspension calculée à l' étape 3.2 à une concentration finale de 8x10 6 particules par ml par addition d' une quantité appropriée de PBS.
NOTE: La suspension de PM10 restant peut être congelé à -20 ° C pour des expériences futures, bien que pour ce protocole fraîchement préparé suspension PM10 est recommandé. - Bloquer la liaison non spécifique en complétant la suspension MP10 avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) à une concentration finale de 0,02%, à l'aide d'une solution mère telle que 1% de BSA préparée avec du PBS. Vortex incuber brièvement et pendant 20 min à température ambiante.
- Pour chaque échantillon devant être analysé par cytométrie de flux, le transfert de 50 ul de la suspension de l'étape 3.4 à courant alternatiftube de réaction maigre. Ajouter un anticorps monoclonal de souris contre Bet v 1 à une concentration finale de 0,02 ug / ul dans les tubes de réaction désignés pour la coloration spécifique, vortex brièvement et laisser incuber pendant 60 min à température ambiante.
- Laissez les tubes de réaction avec la suspension PM10-BSA désigné pour le contrôle natif et le contrôle négatif aussi rester pendant 60 min à température ambiante.
- Laver tous les échantillons par addition de 500 ul de PBS supplémenté avec 0,02% de BSA dans chaque tube de réaction, vortex et centrifuger brièvement les échantillons par la suite à 4700 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant soigneusement à l'aide d'une pompe à vide.
- Répétez l'étape 3.6.
- Déterminer la quantité totale d'anticorps anti-IgG1 de souris marquée au secondaire APC nécessaire: 1 ug d'anticorps dissous dans 50 ul de PBS supplémenté avec 0,02% de SAB par tube de réaction. Diluer la quantité appropriée de l'anticorps avec le volume respectif de PBS supplémenté avec 0,02% de BSA.
- Ajouter 50 pi d'anticorps secondaire dilué dans tous les tubes de réaction à l'exception du tube de réaction désigné pour le contrôle natif. Compléter le dernier avec 50 ul de PBS additionné de 0,02% de BSA. Tourbillonnaire tous les échantillons pendant quelques secondes.
- Incuber tous les échantillons pendant 30 minutes dans l'obscurité.
- Répétez l'étape deux fois 3.6.
- Ajouter 50 ul de PBS à chaque réaction tube vortex et analyser les échantillons sur un cytomètre de flux.
4. Analyse par cytométrie en flux
- Utilisation de la commande native, ajuster les paramètres suivants cytomètre pour optimiser l'analyse des données.
- En utilisant la diffusion vers l'avant (FSC) contrôleur de seuil affiché sur le panneau de commande de l'appareil, régler le seuil de FSC à la valeur la plus faible (200) et commencer l'analyse.
- En utilisant le régulateur de tension de dispersion, ajuster le FSC et scatter latéral (SSC) de cette façon que toutes les particules PM10 peuvent être détectées et que la population de particules est situé approximativement dans ee milieu de l'axe du FCS et dans la moitié inférieure de l'axe de PVC.
- En utilisant le régulateur de tension de fluorescence, régler la tension de l'APC et une autre tension de fluorescence comme isothiocyanate de fluorescéine (FITC), qui ne produit pas à la même longueur d'onde comme APC, le cas échéant. Assurez-vous que toutes les particules sont visibles dans la moitié inférieure des deux axes de fluorescence.
- Consécutivement, examiner chaque échantillon, y compris le contrôle natif et stocker les données FSC, SSC, APC et FITC d'au moins 10.000 particules par échantillon.
- Évaluer les données avec le logiciel respectif. teneur en allergène adsorbé spécifique dans l'échantillon peut être quantifiée de deux façons:
- Analyser l'intensité de fluorescence APC de toutes les particules (valeur médiane) en tant que mesure de Bet v 1 charge sur toutes les particules PM10.
NOTE: Si l'échantillon spécifique contenait allergène, APC intensité de fluorescence devrait augmenter dans l'échantillon spécifique par rapport au témoin négatif. En revanche, d'autres Fluorintensités de escence (par exemple., FITC d'intensité de fluorescence) ne devrait pas changer de manière significative. - Calculer le pourcentage de particules PM10 avec anti-Bet v 1 anticorps lié. Ainsi, dans le contrôle négatif, définir une grille autour des particules considérées APC positif, copier et coller cette porte dans l'échantillon spécifique et soustraire le pourcentage de particules positives APC dans le contrôle négatif du pourcentage de particules positives APC dans l'échantillon spécifique.
- Analyser l'intensité de fluorescence APC de toutes les particules (valeur médiane) en tant que mesure de Bet v 1 charge sur toutes les particules PM10.
Representative Results
Bet v 1 allergène adsorption sur PM10> 0,5 particules a été quantifiée par coloration d'anticorps indirecte et analyse subséquente sur un cytomètre de flux. Un échantillon PM10 de haute saison pollinique a servi comme modèle. Comme indiqué dans l' étape 3.1, le contrôle négatif constitué de particules PM10 incubées avec APC anticorps secondaire marqué seulement (figure 3A). Les particules PM10 colorées avec anti-Bet v 1 anticorps ainsi que l' anticorps secondaire affichent les allergènes particules chargées (figure 3B). Comme il est décrit à l'étape 4.3, deux moyens de quantification de la charge d'allergènes ont été utilisées: D'une part, la valeur médiane de l'intensité de fluorescence de l'APC de toutes les particules ont été analysées étant 137 pour le témoin négatif et 904 pour l'échantillon spécifique. D'autre part, le pourcentage de particules avec anti-Bet v 1 anticorps lié a été déterminée: Une porte a été fixé autour des particules positives APC dans le contrôle négatif et par la suite copied et collé dans l'échantillon spécifique. Dans le contrôle négatif, 3% des particules PM10> 0,5 ont été considérés comme APC positive. Ce pourcentage de particules faussement positifs a été soustrait du pourcentage de particules positives dans l'échantillon spécifique conduisant ainsi à 77,5% APC P10 positif> 0,5 particules dans l'échantillon spécifique. Pour démontrer que la liaison de l'anticorps anti-Bet v 1 d'anticorps observé est spécifique, la capacité de liaison a été bloquée avec l'antigène correspondant avant la coloration. Cette diminuée de liaison de l'anti-Bet v 1 anticorps de 69%, si quantifiée par APC intensité de fluorescence, et de 84%, si quantifiée par pourcentage de Bet v 1 PM10 positif> 0,5 particules (figure 3C).
Figure 3. liés aux particules Bet v 1 allergène peut être visualisé par cytométrie en flux. APC intensité de fluorescence d'un échantillon PM10 de haute poTrès llen colorées uniquement avec l'APC anticorps secondaire marqué (A), colorées avec l'anticorps anti-Bet v 1 d'anticorps primaire et ensuite avec de l'APC anticorps secondaire marqué (B) et , après blocage de l'anticorps primaire avec recombinant Bet v 1 antigène (C ). La porte P APC + a été créé autour des particules considérées APC positive (affichée en rouge) et les pourcentages respectifs sont donnés. Ce chiffre a été légèrement modifiée du 11. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Pour tester si cette méthode pourrait être adoptée pour révéler des différences dans la quantité de adsorbé Bet v 1 contenu de PM10> 0,5 échantillons de haute et de basse saison du pollen, 13 échantillons PM10 de haute et 6 échantillons PM10 de basse saison de pollen ont été analysés. Figure 4dépeint des différences significatives dans l'intensité de fluorescence de l' APC et de la proportion de Bet v 1 PM10 positif> 0,5 particules d'échantillons de PM10 de haute saison de pollen par rapport à des échantillons de PM10 de faible saison pollinique. Les deux méthodes de quantification par les présentes ont montré des résultats similaires.
Figure 4. Les échantillons PM10 de basse et haute saison de pollen diffèrent dans leur quantité de adsorbé Bet v 1. Basse saison pollinique PM10 a été échantillonnée en automne / hiver 2013 (n = 6), haute saison pollinique PM10 en mai 2012 et 2013 (n = 13). (A) L'intensité de fluorescence APC de PM10> 0,5 particules de haute saison pollinique était significativement plus élevé que d' une faible saison pollinique (médiane / min / max haute saison pollinique: 796/313/1097; médiane / min / max faible saison pollinique: 197 / 85/277). (B) PM10 de haute saison pollinique contenait significantly plus Bet v PM10 1 positif> 0,5 particules que les PM10 de faible saison pollinique (médiane / min / max haute saison pollinique: 45,2 / 18,5 / 74,5; médiane / min / max faible saison pollinique: 11,8 / 4,4 / 19,8). Box parcelles présentent des valeurs médianes (ligne intérieure de la boîte), 25. et 75. percentiles, respectivement (frontières inférieure et supérieure de la boîte) et les valeurs minimales et maximales (moustaches). *** P <0,001 par rapport à faible saison pollinique, test de Mann Whitney U. Ce chiffre a été légèrement modifiée du 11. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Une étape critique du protocole est l'utilisation d'un filtre approprié pour la collecte de particules PM10 de l'air ambiant (voir l'étape 1.1). Le filtre doit être suffisamment solide pour supporter le brossage avec une brosse à dents électrique, et tous les matériaux filtrants remplissent cette exigence. Le protocole de coloration a été établie avec une concentration de 8x10 6 particules par ml de particules P10. Toutefois, si le matériau est limité et la mise en commun des échantillons ne convient pas, la méthode sera probablement fonctionner aussi bien, mais les concentrations d'anticorps (voir étapes 3.5 et 3.8) pourraient avoir à régler.
Bet v 1 coloration des particules PM10 n'a pas abouti à des populations distinctes de particules colorées positivement et négativement. Cela pourrait être causé par les quantités variables de Bet v 1 allergène adsorbées sur chacune des particules allant de très peu jusqu'à un montant élevé. Cela pourrait entraîner l'expansion du signal d'APC déplaçant ainsi la population verspositivité APC. Comme il est difficile de distinguer les effets positifs des particules négatives, deux méthodes de quantification ont été utilisées pour déterminer les différences dans la teneur en P10> 0,5 spécimens de Bet v 1: (i) la quantification relative en mesurant la médiane APC intensité de fluorescence de toutes les particules et (ii) déterminer le pourcentage de particules positives APC. En ce qui concerne le Bet v 1 charge de particules de pollen basse et haute saison PM10> 0,5, les deux méthodes ont révélé des résultats similaires. Pourtant, la quantification relative par la médiane d'intensité de fluorescence de toutes les particules est recommandée car elle est indépendante de placer la porte et donc probablement moins sujette aux erreurs.
À ce jour , de nombreuses études examinent la teneur en allergènes dans les matières particulaires de l' air ambiant en extrayant l'allergène respectif et la quantification ultérieure avec ELISA 5,12-14,17. Il y a une différence fondamentale entre la procédure décrite ici et le quantification avec ELISA: ELISA quantifie l'antigène extrait et dissous, tandis que la cytométrie de flux analyse l'antigène lié aux particules. Par ELISA Bet v 1 la charge des échantillons testés P10 (n = 8) était inférieure à la limite de détection de 1,2 ng / ml (données non représentées). De même, Buters et d' autres ont identifié pas Bet v 1 dans le PM <2,5 um fraction et seulement environ 7% dans le 10 um> PM> 2,5 um fraction, mais plus de 93% dans le PM> 10 um fraction de l' air ambiant 13. Les résultats du test ELISA de contraste, d'une part, et l'analyse par FACS d'autre part, peuvent être causées par des différences dans la méthode de détection en conjonction avec une sensibilité divergente. Des recherches supplémentaires sont toutefois nécessaires pour bien comprendre cette différence.
Une méthode pour visualiser numérise liée à la particule d'antigène microscopie électronique 10,14. Par microscopie électronique à balayage, Ormstad et al. , Bet v 1 visualisé sur la surface du mat de particules en suspensionparticules de suie r échantillonnées dans la haute saison de pollen et dans une moindre mesure sur les particules échantillonnées dans la basse saison pollinique 15. De plus, les allergènes de pollen, de latex et de ß-glucanes a également été trouvé pour être adsorbée sur les particules de combustion dans l' air ambiant 10. Cette méthode ne permet cependant pas de quantification de l'allergène lié aux particules.
En utilisant la cytométrie de flux, liée à la particule Bet v 1 allergène pourrait être quantifiée. Ainsi, la cytométrie en flux peut offrir une nouvelle façon de caractériser la fraction de 10 à 0,5 um biologique de PM10 comme avec d' autres anticorps appropriés à portée de main, cette méthode pourrait être étendue à la détection d'autres antigènes sur les particules de l' air ambiant, par exemple, les moisissures, les acariens allergènes ou LPS. Comme les particules PM10 adsorber non seulement du matériel biologique, mais également des produits chimiques et des métaux assez facilement, une liaison non spécifique d'anticorps pourrait toutefois poser un problème. Si un nouvel anticorps est testé, une étape critique est de prouver bind spécifiqueing. Cela peut être fait, par exemple, le blocage de la capacité de liaison de l'anticorps spécifique avec l'antigène correspondant 11 avant la coloration.
Comme Bet v 1 contenu de l' air ambiant peuvent différer des taux de pollen de bouleau 12,13,18, les symptômes allergiques pourraient peut - être une meilleure corrélation avec le niveau d'allergène que le pollen compter 14,18. Par conséquent, la méthode présentée conjointement avec les données cliniques permet d'examiner dans des expériences futures si des réactions allergiques au bouleau correspondent à l'allergène Bet v 1 charge de PM10> 0,5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
| low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/hr |
| Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
| electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
| Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
| FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
| FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
| monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
| APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
| SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
| Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55 mm, H 15 mm |
| FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5 ml Polystyrene |
| CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
| Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1.4 ml, PP |
| Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
| Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
| recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |
References
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