Summary
El cerebro canino es un modelo valioso en el que estudiar la neurogénesis adulta. Aquí se presentan son los protocolos para aislar y amplificar las células adultas caninos hipocampo precursoras neurales a partir de tejido cerebral primario.
Protocol
De acuerdo con Nueva Gales del Sur, Australia la ley, el tejido cerebral post mortem fue adquirido de los perros adultos sacrificados por razones no relacionadas con el estudio.
1. Preparación del medio de cultivo
- Preparar una solución de gelatina al 0,1% mediante la adición de 0,1 g de polvo de gelatina a 100 ml de agua destilada y se agita a 37 ° C hasta que se disuelva. Esterilizar la solución por irradiación UV durante 15 min. Este medio puede entonces ser almacenado a 4 ° C durante un máximo de 1 mes.
- Preparar una proporción de 3: 1 de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y mezcla de nutrientes F12 mediante la adición de 167 ml de F-12 a 500 ml de DMEM (4,5 g / L de D-glucosa). Añadir 6.7 ml de solución de penicilina / estreptomicina (para una concentración final 1%). Este medio se puede almacenar en la oscuridad a 4 ° C durante un máximo de 1 mes.
- Preparar 500 ml de medio de suero mediante la combinación de 440 ml de DMEM (4,5 g / L de D-glucosa), 5 ml de L-alanil-L-glutamina dipéptido (200 mM), 5 ml de penicilina / estreptomicina y 50 ml de bovino fetale suero (FBS). Este medio se puede almacenar en la oscuridad a 4 ° C durante un máximo de 1 mes.
- medio de crecimiento completo consiste en Neural Stem Cell (NSC) medio basal y proliferación neuronal Suplemento-A (NS-A), 2% de FBS, 2 mg / ml de heparina, 20 ng / factor de crecimiento epidérmico ml (EGF) y 10 ng / ml factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF). Hacer este medio fresco, inmediatamente antes de la disección del cerebro, y se calienta a 37 ° C en un baño de agua.
2. Extracción del cerebro
- Comenzar la extracción dentro de las 6 horas post mortem mediante la esterilización de la superficie dorsal de la cabeza del perro con povidona yodada.
- El uso de un bisturí, hacer una incisión longitudinal a lo largo de la línea media sagital, a través de toda la superficie dorsal del cráneo, para exponer los músculos maseteros subyacentes. La longitud de este corte dependerá de la especie y la edad del perro.
- En las fronteras rostral y caudal del cráneo, de forma adicional de 5 - 10 cm cortes perpendiculares en ambos lados, paseing detrás de los ojos y los oídos, respectivamente, para permitir que la piel se refleja totalmente.
- El uso de un bisturí, separar los músculos maseteros de su apego a la cresta sagital del cráneo y raspar cualquier tejido conectivo restante del cráneo.
- El uso de un hueso sierra oscilante cortó la tapa del cráneo en una línea circunferencial. El uso de una sonda o un escalpelo cortar los archivos adjuntos restantes con la dura, y luego retirar con cuidado la tapa del cráneo para exponer la superficie dorsal del cerebro.
Precaución: El grosor del hueso varía en diferentes regiones en el cráneo, por lo que se debe tener cuidado de no penetrar demasiado profundo y dañar el cerebro subyacente. - Cortar la médula espinal mediante la inserción de un bisturí entre las vértebras cervicales superiores.
- Con una mano para levantar suavemente el cerebro, utilizar un bisturí para liberar cuidadosamente el cerebro de la fosa craneal y cortar los nervios que conectan y los vasos sanguíneos situados en su parte ventral. levante suavemente la blluvia fuera del cráneo y en un recipiente de DPBS.
Precaución: Los grandes bulbos olfatorios del cerebro canino pueden extenderse profundamente en la fosa craneal anterior. Se debe tener cuidado al retirar el cerebro con el fin de preservar estas estructuras.
3. La disección del hipocampo
- Enjuague el cerebro en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) para eliminar la sangre y colocarlo lado dorsal hacia abajo sobre una placa de Petri de 150 mm.
- bisecar lentamente el cerebro longitudinalmente a través del plano sagital medial utilizando un cuchillo cerebro húmedo y un único segmento que utiliza toda la longitud de la hoja. No aplique una presión adicional a la baja, o usar un movimiento de sierra, ya que esto puede dañar el tejido.
- La colocación de cada hemisferio medial hasta la superficie, diseccionar el hipocampo utilizando un bisturí y pinzas finas, y la transfiere a una placa de cultivo de tejidos de 35 mm.
4. Aislamiento de células precursoras neuronales
- Picar la temitir las muestras utilizando una hoja de bisturí en aproximadamente 1 mm 3 piezas.
- Transferir el tejido en un tubo de 15 ml, añadir 2 ml de 0,1% de tripsina EDTA, y se incuba durante 7 min en un baño de agua a 37 ° C.
- Detener la reacción enzimática mediante la adición de 4 ml de medio de suero al tubo. Se precipitan de la suspensión por centrifugación a 100 xg durante 7 min y separar el sobrenadante.
- Resuspendió el precipitado en 300 l de DPBS, y mecánicamente disociado pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, usando una punta de pipeta 1.000 l, hasta que se forme homogeneizado lisas.
- Añadir 14 ml de medio de suero al tubo y pasar la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras. Se precipitan de la suspensión por centrifugación a 100 xg durante 7 min, eliminar el sobrenadante, y resuspender en medio de crecimiento completo.
5. Neurosphere Cultura
- A partir de la suspensión celular obtenida en el aislamiento, contar el número de células viables mediante exclusión con colorante azul de tripano y un hemocitómetro.
- Diluir la suspensión de células en medio de crecimiento completo y semillas en las células 1 x 10 5 / cm 2 en los pocillos no revestidos de una placa de 6 pocillos.
- Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 y> 95% de humedad durante 14 - 28 días, reemplazar 50% de los medios de crecimiento cada 7 días. Medir el diámetro de las neuroesferas con regularidad. Si se permite que crecer más allá de 100 m de diámetro, la muerte celular y la diferenciación espontánea puede ocurrir dentro de las neuroesferas.
6. El paso Neurosphere
- Para pasaje como un cultivo flotante, cuando las neuroesferas alcanzan aproximadamente 100 micras de diámetro, se combinan todos los medios de comunicación neurosphere que contiene en un solo tubo. Se precipitan por centrifugación a 100 xg durante 7 min y separar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado en 1 ml de 0,1% de tripsina EDTA y se incuba durante 7 min en un baño de agua a 37 ° C. pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo 100 veces, utilizando una punta de pipeta de 200 l, para asegurar dissociatien de las neuroesferas.
- Detener la reacción enzimática mediante la adición de 5 ml de medio de suero al tubo y centrifugar a 100 xg durante 7 min.
- Eliminar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio de crecimiento completo y contar el número de células viables utilizando Trypan exclusión de colorante azul y un hemocitómetro.
- Diluir la suspensión de células en medio de crecimiento completo y semillas en las células 1 x 10 5 / cm 2 en los pocillos no revestidos de una placa de 6 pocillos. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 y> 95% de humedad durante 14 - 28 días, en sustitución de 50% de los medios de crecimiento cada 7 días.
7. adherente cultivo de células precursoras neuronales
- Añadir un volumen suficiente de solución de gelatina 0,1% para cubrir la superficie de una placa de cultivo tisular y la curación en una incubadora a 37 ° C durante 1 hr antes de procesar las neuroesferas para cultivo adherente.
- A partir del cultivo de neuroesferas flotante, combinar todos los medios de comunicación en un solo tubo. Sedimentar los neurospheres por centrifugación a 100 xg durante 7 minutos y eliminar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado en 1 ml de 0,1% de tripsina EDTA y se incuba durante 7 min en un baño de agua a 37 ° C. pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo 100 veces, utilizando una punta de pipeta de 200 l.
- Añadir 5 ml de medio de suero para detener la reacción enzimática y centrifugar a 100 xg durante 7 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio de crecimiento completo y contar el número de células viables utilizando Trypan exclusión de colorante azul y un hemocitómetro.
- Se diluye la suspensión celular en medio de crecimiento completo, retire la gelatina a partir de los frascos de cultivo de tejidos y sembrar las células en células de 1 x 10 4 / cm2.
- Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 y> 95% de humedad. Reemplazar los medios de comunicación, calentado, medios de cultivo completos frescas cada tres días hasta que el cultivo alcanza aproximadamente el 80% de confluencia (después de aproximadamente 7 días).
8. Neural ensayo de formación de colonias
- Combinar Neural Colony célula formadora de componentes de medios (NCFC) Ensayo: NCFC medio con suero libre, proliferación NS-A, y la solución de colágeno (3 mg / ml). Suplemento de este medio con 2 mg / ml de heparina, 20 ng / ml de EGF y 10 ng / ml bFGF.
- Tras la disociación tejido del hipocampo resuspender las células en la colonia de los nervios que forman el medio de ensayo, pre-calentaron a 37 ° C en un baño de agua. Semillas de las células a una densidad clonal de 1,1 x 10 5 células / ml en una placa de cultivo de 35 mm.
- Se incuban las células en esta matriz de colágeno semi-sólido a 37 ° C, 5% de CO 2 y> 95% de humedad. Cultura durante 28 días, en sustitución de 50% de los medios de crecimiento cada 7 días.
9. La diferenciación de las células precursoras neuronales
- Añadir un volumen suficiente de 5 g / cm solución 2 laminina para cubrir la superficie de una placa de cultivo de tejidos y la curación en una incubadora a 37 ° C durante 24 horas antes de procesar las células de diferenciaciónción.
Nota: Eliminar la solución de laminina y enjuagar la superficie recubierta dos veces en DPBS inmediatamente antes de la siembra. - Cuando pases, la semilla de la suspensión de células a 1 x 10 4 células / cm 2 en DMEM-F12 (3: 1) medios (pre-calentado a 37 ° C) suplementado con 20 ng / ml de EGF y 40 ng / ml bFGF en el laminina recubierto placa de cultivo.
- Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 y> 95% de humedad y permiten que las células proliferen durante 3 días.
- Para diferenciar las células precursoras neurales adherentes, después de 3 días reemplazar los medios de comunicación con los medios de diferenciación que contienen DMEM-F12 (3: 1) los medios de comunicación pre-calentado a 37 ° C, suplementado con 10 ng / ml cerebro factor neurotrófico derivado (BDNF).
- Durante la diferenciación reemplazar 50% de los medios cada 3 días. La diferenciación se produce gradualmente a lo largo de aproximadamente 21 - 28 días.
Precaución: Una vez que las células han comenzado a diferenciarse, solamente reemplazar 50% de los medios de comunicación en un enlace de Timí como la exposición al aire puede tener un efecto perjudicial sobre la salud de las células.
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Representative Results
Mediante el uso de vitro neuronales precursoras ensayos in, la neurogénesis y las poblaciones de células precursoras neurales fueron caracterizados y comparados a través del eje dorsoventral del hipocampo canino adulto. las células precursoras neurales derivadas de tejido del hipocampo aisladas formadas flotante neuroesferas dentro de los 14 días de aislamiento, alcanzando un diámetro de 100 micras en un 28 días de cultivo. Neuroesferas derivadas de dorsal y ventral aislados no mostraron ninguna diferencia en el tamaño medio, y después de la disociación enzimática en células individuales, podrían ser pasados como cultivos de neuroesferas flotante. neuroesferas flotantes secundarias de ambas regiones del hipocampo fueron capaces de formar un plazo de 5 días a partir de pasaje. Cuando se sembraron a células / cm 2 1 x 10 4 a 0,1% de gelatina recubierta frascos de cultivo, las células precursoras neurales también fueron capaces de proliferar como monocapas adherentes (Figura 1A). No se observaron diferencias morfológicas between dorsal y células precursoras neuronales del hipocampo ventral y ambos cultivos adherentes fueron capaces de someterse a más de 10 duplicaciones de población sin ningún observado se desaceleración en el paso de tiempo (Figura 1B). Nestina y Sox2 la expresión génica de células madre neurales en cultivo adherente no fue significativamente diferente a lo largo del eje dorsoventral del hipocampo (Figura 2). Más extensa caracterización de genes y la expresión de la proteína, lo que confirma la identidad precursoras neurales de estas células, se informó en nuestros datos publicados 7.
El uso de un adaptado Neural colonia de ensayo de formación de 4,6 se evaluó la frecuencia de células precursoras neuronales con el fin de cuantificar las diferencias potenciales en las poblaciones de células precursoras neurales a través de la dorsal y ventral subregiones del hipocampo canina. Las células se sembraron a una densidad clonal en una matriz de colágeno semi-sólido que se opone a la fusión celular, y se cultivaron durante 28 días (Figura 3A F = 96,8; p = 0,001; Figura 3B ).
Bajo condiciones de diferenciación, las células precursoras neurales caninos adherentes mostraron alteraciones progresivas en la morfología general, el desarrollo de procesos más largos y más elaborados. Expresión de proteínas para neuronal (βIII-tubulina) y (proteína ácida fibrilar glial; GFAP) glial marcadores también aumentó después de la diferenciación (Figura 4). No hay diferencia significativa observada en el número de células marcadas positivamente entre dorsal y ventral aislamientos. Nuestros datos publicados anteriormente corrobora estos cambios en la expresión de proteínas, lo que demuestra la sobre regulación de los genes asociados junto con la baja regulación de los nervios genes precursores durante el período de 28 días de diferenciación 7.
Figura 1:. Las células del hipocampo caninos In Vitro La expansión de las células adultas Canine hipocampo Neural precursoras adultas neuronales precursoras aisladas de la dorsal y de las regiones del hipocampo ventral se expanden como neuroesferas flotantes (A) o como (B) una monocapa adherente (C) como un. monocapa adherente estas células precursoras neurales podrían sufrir el paso de más de 10 veces sin disminución significativa en la duplicación de la velocidad. n = 5; escala = 50 micras. Modificado de la cifra publicada el 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2:. La expresión génica en células proliferantes Canine Adult hipocampo Neural precursores Expresión de genes de células madre neurales (A) nestina y (B) Sox2 se confirmó en las células del hipocampo caninos adultos neuronales precursoras en condiciones de cultivo de proliferación adherentes. La expresión de estos genes era equivalente tanto en la dorsal y células del hipocampo ventral derivado. fibroblastos caninos adultos se utilizan como una línea de control para comparar las diferencias en la expresión génica relativa. n = 5; barras de error = SEM. Modificado de la cifra publicada el 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Neural formadoras de colonias de ensayo (A)Las células adultas caninos neuronales precursoras, sembradas a una densidad clonal en una matriz de colágeno semi-sólido, neuroesferas se forman dentro de 28 días de cultivo. (B) las células precursoras neurales derivadas de hipocampo dorsal generan significativamente mayor número de neuroesferas por unidad de área que las derivadas de el hipocampo ventral. n = 5; barras de error = SEM; escala = 50 micras. Modificado de la cifra publicada el 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. La inmunocitoquímica de células diferenciadas para adultos canina hipocampo neuronal precursores Cuando cultivadas en BDNF durante 28 días, para adultos canina precursores neuronales, tanto del hipocampo dorsal y ventral se diferencian en neuronas maduras (po βIII-tubulinasitive) y gliales (tipos) de células GFAP positivas. n = 5; escala = 50 micras. Modificado de la cifra publicada el 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los protocolos descritos aquí están optimizados para mantener las condiciones de cultivo favorables para maximizar la viabilidad celular. La velocidad y el cuidado durante la extracción, el aislamiento y la expansión es de importancia crítica. Un paso crítico para el establecimiento de expansión monocapa adherente es la disociación efectiva de las neuroesferas primarias. Después de la aprobación, insuficientemente disociados neuroesferas pueden generar neuroesferas flotantes secundarias. Durante el cambio de los medios de comunicación, estas neuroesferas pueden ser removidos, disocian y se volvieron a sembrar para el paso monocapa adherente. A la inversa, si la viabilidad celular después de la disociación está por debajo de 80%, esto puede ser indicativo de pipeteado excesiva durante la disociación. células precursoras neuronales y, en particular sus homólogos diferenciados, son sensibles a los cambios de pH fuera del intervalo fisiológico, y la exposición a aire. La observación de la repentina muerte celular generalizada puede ser atribuible a estos factores. En consecuencia, un paso crítico en los medios de comunicación Changes es para los medios de comunicación para hacerse nuevo cada vez, y por sólo 50% del volumen que ser reemplazado. Por último, mientras que los factores mitogénicos EGF y bFGF apoyar la supervivencia y la proliferación de precursores neuronales del hipocampo en condiciones libres de suero in vitro 22,23, la respuesta celular a estos mitógenos es dependiente de la edad de desarrollo de células y la concentración mitogénica 24,25 altamente. Por lo tanto, lo que garantiza la variación experimental mínima en estos componentes es crucial para la generación, cultivos celulares reproducibles consistentes.
Para conseguir la máxima viabilidad, las células deben ser sembradas para la cultura dentro de las 6 horas post mortem. Sin embargo, el cerebro extraído se puede almacenar temporalmente en PBS a 4 ° C. Esta modificación puede permitir para el aislamiento que ser retrasada hasta por 24 horas con una reducción mínima en 26,27 rendimiento celular. factor de crecimiento de la suplementación del medio de cultivo también puede modificarse para aumentar la proliferación o para fomentar la differentiation de tipos de células neuronales específicas. Factor de crecimiento similar a la insulina 1 (a 100 ng / ml) se ha demostrado que tienen un efecto de apoyo sobre las células madre neural de roedores in vitro 28,29, mientras que en virtud de la diferenciación condiciones de los factores pro-neuronal BDNF 30 puede ser utilizado en conjunción con factores tales como la interleucina 7 (a 500 ng / ml) o ácido retinoico (a 0,1 M) para inducir un sesgo hacia el subtipo neuronal o diferenciación glial 31,32.
La decisión de expandir las células precursoras neurales como neuroesferas flotantes o como una monocapa adherente depende en gran medida de las aplicaciones posteriores deseados y las características de cultivo. Mientras que el sistema de cultivo neurosphere es simplista y altamente reproducible, que está limitada en su capacidad de generar poblaciones homogéneas de células. El complejo microambiente dentro de cada esfera puede promover la apoptosis y la diferenciación espontánea, el fomento de una población heterogénea de 33 años, mientras que repfusión orted de neuroesferas que pueden confundir la cuantificación de las poblaciones de células precursoras neurales 34. Además, la disociación mecánica repetido requerido para neurosphere pasaje también puede conducir a estrés perjudicial, senescencia o incluso la muerte celular. El uso de la enzima de disociación alternativa, tal como papaína, puede afectar a la viabilidad celular resultante 16. Por el contrario, el sistema de cultivo monocapa adherente, con la exposición más uniforme a mitógenos ambientales, fomenta una mayor homogeneidad en el tipo de célula y la división más simétrica. Este sistema se ha demostrado que produce un nicho población independiente de células, basado en la expresión de marcadores de células madre clave 35,36. Este sistema requiere el uso de recipientes de cultivo pre-revestidas para promover la adhesión celular. La elección del sustrato de cultivo debe ser cuidadosamente considerada, ya que puede tener efectos significativos en el perfil de la diferenciación de los precursores neuronales cultivadas 25,37.
MARIDOERE presentamos protocolos eficaces para el aislamiento, la expansión y diferenciación de células precursoras del hipocampo adulto caninos neurales a partir de tejido post mortem fresco. Precursores neurales adultas caninos están bajo representadas en la literatura 18; con protocolos completos para su aislamiento y expansión, menos aún 17. Nuestros protocolos pueden servir entonces para aumentar el conocimiento de este modelo animal valioso y representan una adición importante a este modesto número de estudios. De importancia, con nuestro método exclusivo, los precursores neuronales del hipocampo caninos adultos se pueden ampliar con éxito más de 10 duplicaciones de población. Un estudio similar usando precursores neuronales del hipocampo adulto canina informó que neuroesferas más grandes, con pases a 100 - 150 micras de diámetro, dejaron de proliferación más allá de la quinta generación 17. Como se ha indicado en el protocolo, el crecimiento neurosphere excesiva puede estimular la diferenciación y la apoptosis espontánea, que con el paso en serie puede tener led a esta reducción de la capacidad proliferativa. También proporcionamos un protocolo para la expansión de monocapa adherente de esta población de células, como una alternativa al sistema de expansión neurosphere clásica 17-21. Este sistema alternativo ofrece al usuario más control sobre el entorno celular, y amplía significativamente la gama de aplicaciones aguas abajo para estas células, con potencial para la homogeneización fenotípica y dirigida diferenciación neuronal 35,38.
células adultas cultivadas de hipocampo caninos precursoras neurales tienen aplicaciones en una amplia gama de campos de investigación celular y neurobiológicos. El cerebro canino posee una homología más cerca del cerebro humano que los modelos de roedores existentes. Como tal, las células precursoras neurales adultas caninos representan una importante, aunque poco estudiados, de los recursos. Estas células se pueden utilizar para obtener una mayor penetración en los mecanismos detrás de la neurogénesis adulta en los seres humanos, y para el desarrollo de terapias regenerativas que Target este proceso.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
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