Summary
Ce protocole décrit la génération de tumeurs de la vessie orthotopique de souris femelles de souris C57BL / 6J et le contrôle de la croissance tumorale.
Abstract
Ce protocole décrit la génération de tumeurs de la vessie chez des souris C57BL / 6J femelles en utilisant la lignée cellulaire de cancer de la vessie murin MB49, qui a été modifiée pour secréter de la prostate humain de l'antigène spécifique (PSA) et la procédure pour la confirmation d'implantation de la tumeur. En bref, les souris sont anesthésiés à l'aide de drogues injectables et sont faits pour mettre en position dorsale. L'urine est libérée de la vessie et de 50 pi de poly-L-lysine (PLL) est lentement instillée à un débit de 10 pl / 20 s en utilisant un cathéter 24 G IV. Il est laissé dans la vessie pendant 20 minutes en bouchant le cathéter. Le cathéter est retiré et PLL est libéré par une légère pression sur la vessie. Ceci est suivi par l' instillation de la lignée cellulaire de cancer de la vessie de souris (1 x 10 5 cellules / 50 ul) à un débit de 10 pl / 20 s. Le cathéter est bouché pour empêcher l'évacuation prématurée. Après 1 h, les souris sont ravivées avec un médicament d'inversion, et la vessie est annulée. Le taux d'instillation lente est important,car il réduit reflux vésico-urétéral, ce qui peut provoquer des tumeurs de se produire dans les voies urinaires supérieures et dans les reins. La lignée cellulaire doit être bien remis en suspension pour réduire l'agglutination des cellules, car cela peut conduire à des tailles de tumeur inégale après l'implantation.
Cette technique induit des tumeurs avec une grande efficacité. La croissance des tumeurs est contrôlée par la sécrétion urinaire de PSA. la surveillance du marqueur PSA est plus fiable que les ultrasons ou l'imagerie par fluorescence pour la détection de la présence de tumeurs de la vessie. Tumeurs chez les souris atteignent généralement une taille maximale ayant un impact négatif sur la santé d'environ 3 - 4 semaines, si non traitée. En surveillant l'évolution de la tumeur, il est possible de différencier les souris qui ont été guéris de ceux qui ne sont pas implantés avec succès des tumeurs. Avec seulement une analyse du point final, ce dernier peut être à tort, supposé avoir été guéri par thérapie.
Introduction
Le but de cette méthode est de générer des tumeurs de la vessie murin orthotopique et de suivre les tumeurs implantées aussi précisément que possible, de sorte que les souris sans implantation de la tumeur ne sont pas pensé pour avoir été durcie à l'analyse du point final. Dans l'ensemble, la méthode indiquée réduira la nécessité d'un grand nombre de souris pour l'analyse expérimentale et assurer une plus grande précision dans la détermination des résultats thérapeutiques.
Le développement d'un modèle orthotopique de cancer est important, car les cellules tumorales implantation sous-cutanée ne récapitulent pas l'environnement de la maladie clinique ou permettent le développement de stratégies thérapeutiques. L'architecture de la vessie permet à l'instillation de thérapies contre le cancer de la vessie directement dans la vessie avec des effets systémiques minimales. Ainsi, les modèles animaux qui récapitulent cet environnement, comme un modèle orthotopique, sont importantes pour évaluer de nouvelles thérapies. Les conclusions tirées de tout dispositif expérimental sont dependent sur les limites du modèle.
Plusieurs techniques ont été mises au point pour la production de tumeurs de la vessie orthotopique chez la souris. Ceux-ci se fondent sur d'endommager la couche de glycosaminoglycanes de la vessie, permettant aux cellules tumorales à implanter. Les techniques utilisées comprennent électrocoagulation, qui se traduit par un point de dégâts dans la paroi de la vessie unique, conduisant au développement de la tumeur sur un site dans la vessie 1,2. Cependant, le taux d'implantation de la tumeur à l'aide électrocoagulation de réussite est dépendante de l'opérateur variant de 10 - 90% et comprend le danger que la paroi de la vessie est percé, ce qui conduit à développer des tumeurs dans la cavité péritonéale. Cautérisation chimique est effectuée en utilisant du nitrate d' argent, ce qui endommage la paroi de la vessie 3. De même, l' acide a été utilisé pour endommager la paroi de la vessie 4. Trypsine a également été utilisé pour endommager la vessie et 5. Ces procédés peuvent entraîner l'apparition de plus d'une tumeur de la vessie.En outre, il existe un risque de dommages importants à la vessie si les produits chimiques sont laissés en contact avec la paroi de la vessie pendant trop longtemps. La méthode développée par Ninalga et al. utilise la poly-L-lysine chargée positivement (PLL) 6 molécules à recouvrir la paroi de la vessie; ce qui permet les cellules tumorales chargées négativement à coller à la couche de glycosaminoglycanes de la vessie. Ce procédé conduit généralement à plus d'une tumeur en développement dans la vessie, mais l' implantation des tumeurs est à 80 - 100% 4,7. Techniquement, il est aussi la procédure la plus simple à réaliser. Pour garantir que les tumeurs qui se développent sont assez même taille, il est important que les cellules tumorales ne sont pas regroupés dans les grandes touffes avant l'implantation.
Afin d'évaluer l'efficacité thérapeutique, il est préférable d'effectuer cette étude sur des souris avec des tumeurs assez de taille similaire. Ainsi, un système de détection qui permet de quantifier la bonne taille de la tumeur rapidement après l'implantation est importante. Plusieurs stratégies ont abeillen utilisé pour évaluer les tumeurs. Ceux - ci comprennent l' imagerie par résonance magnétique (IRM) 8-10, la fluorescence 11, bioluminescence 12,13, ultrasons 14, et le dosage immuno-enzymatique (ELISA) 15,16. Tandis que l'IRM et les ultrasons ne nécessitent pas de modifications des cellules tumorales, il existe un besoin d'un équipement et d'agents de contraste pour l'IRM sensibles. Les dosages par fluorescence, luminescence- et à base d'ELISA nécessitent une modification des cellules tumorales pour exprimer des protéines marqueurs qui peuvent être détectés par ces méthodes. Pour la fluorescence, un substrat est nécessaire pour la détection de l'activité de la luciférase; ainsi, il y a une étape supplémentaire et une augmentation des coûts. Les deux luminescence et fluorescence nécessitent un équipement spécialisé. Pour produire la fluorescence, la protéine fluorescente verte (GFP) de cyclisation qui est catalysée par l'oxygène moléculaire, est nécessaire. Ainsi, l'expression de la GFP peut être variable au sein d'une masse tumorale en fonction de l'accès à l'oxygène, ce qui en fait un marqueur peu fiable
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Protocol
Tous les travaux des animaux adhéré aux directives du Comité des soins et l'utilisation des animaux institutionnels (IACUC) sur l'utilisation des animaux et de manutention (numéro de protocole 084/12) à l'Université nationale de Singapour.
1. Croissance des cellules MB49-PSA in vitro et de mesure PSA Sécrétion
- Maintenir murine cancer de la vessie cellules MB49-PSA 15 dans complet du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 2 mmol / L de L-glutamine et 0,05 mg / mL de pénicilline-streptomycine dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. Ajouter 200 pg / ml d'hygromycine B pour maintenir la pression de cellules sécrétrices de PSA sélection.
- Pour déterminer la sécrétion de PSA, la plaque 1 x 10 6 cellules dans une plaque de culture à 6 puits et incuber à 37 ° C en présence de 5% de CO2 pendant 48 heures.
- Deux jours plus tard, de recueillir le surnageant pour la mesure du PSA.
- En utilisant une pipette Pasteur, transférer le supernatant à un tube de 15 ml de la centrifugeuse.
- Centrifuger pendant 5 min à 250 xg pour éliminer les cellules flottantes et les débris. Si le dosage du PSA est effectué sur un autre jour, stocker le surnageant à - 30 ° C dans un microtube de 1,5 ml. Sinon, passez à l'étape suivante immédiatement.
- Déterminer la concentration de PSA en utilisant un PSA libre humain ELISA kit 7.
- Énumérer les cellules étalées.
- En utilisant une pipette Pasteur, laver les cellules doucement avec 1 ml de DMEM. Aspirer et complètement supprimer les médias.
- Ajouter 1 mL de milieu frais et gratter doucement avec un racleur de cellules pour déloger les cellules du puits.
- Transférer les cellules dans un tube de microcentrifugation et remettre en suspension les soigneusement pour assurer une suspension à cellule unique.
- Mélanger des volumes égaux de la suspension cellulaire et une solution de bleu trypan à 0,4%. Compter les cellules vivantes (qui ne prennent pas le colorant) à l'aide d'un hémocytomètre.
- Calculer l'expression de PSA en ngde PSA / ml de milieu / 10 6 cellules. L'expression de PSA de cellules MB49-PSA pour l' implantation chez la souris est 80-120 ng / mL / 10 6 cellules.
2. Détermination de la sensibilité des mesures de PSA par ELISA et analyse PCR en temps réel
- Plate cellules MB49-PSA dans un milieu complet DMEM dans une plaque de culture à 6 puits avec différentes quantités de cellules MB49 parentales telles qu'il ya un maximum de 1 x 10 6 cellules par puits (ie, 10 0, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 ou 10 6 cellules MB49-PSA sont mis en culture avec 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, 0 ou 10 cellules MB49, respectivement).
- Un jour plus tard, recueillir le surnageant pour la mesure du PSA, comme décrit dans l'étape 1.3. Déterminer la concentration de PSA en utilisant un PSA libre humain ELISA kit 7.
- Extraire l'ARN à partir des cellules.
- lyser lecellules directement dans la plaque en ajoutant 1 ml de réactif d'extraction d'ARN.
- Incuber pendant 5 min à température ambiante et à transférer le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugation. Ajouter 0,2 mL de chloroforme et vortex les échantillons vigoureusement pendant 15 s. Incuber pendant 3 minutes à la température ambiante.
- Centrifuger les échantillons à 12000 xg pendant 15 min à 4 ° C. transférer avec précaution la phase aqueuse supérieure (0,5 ml) dans un nouveau tube sans déranger l'interphase.
- Ajouter 0,5 ml d'alcool isopropylique. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Centrifuger les échantillons à 12000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Enlever le surnageant complètement, sans perturber le précipité d'ARN au niveau du fond du tube.
- Laver le culot une fois avec 1 ml d'éthanol à 75%. Centrifuger à 7500 xg pendant 5 min à 4 ° C. Retirez tout l'éthanol et laisser le culot sécher à l'air pendant 10 minutes.
- Dissoudre l'ARN dans 30 ul d'eau sans nucléase. Incuber pendant 5 min à 60 ° C pour augmenter la sortelubility.
- Quantifier l'ARN en mesurant l'absorbance en utilisant la lumière ultraviolette (UV), la spectroscopie à 260 nm (A260). Pour évaluer la pureté de l'ARN, mesurer l'absorbance à 280 nm (A280) et calculer le rapport A260 / A280 qui devrait être supérieur à 1,6.
- Reverse-transcription d'ADNc de 2 pg d'ARN.
- Préparer le mélange réactionnel sur de la glace et de le transférer dans des tubes de 0,2 ml.
- Centrifuger brièvement les tubes à centrifuger le contenu et d'éliminer les bulles d'air.
- Charger les tubes dans le cycleur thermique et effectuer la transcription inverse dans les conditions suivantes: 60 min à 37 ° C, puis 5 min à 95 ° C. Une fois la course terminée, conserver les échantillons d'ADNc à 4 ° C.
- Conserver les échantillons à - 30 ° C pour le stockage à long terme.
- Effectuer une analyse PCR en temps réel pour PSA et cytoplasmique beta actine. actine beta est utilisé pour normaliser les échantillons. Effectuer le test sur 100 ng d'ARN de transcription inverse dans un pla 96 puitste. Doser tous les échantillons en triple. Effectuer 40 cycles avec les paramètres suivants: 2 min à 50 ° C, 10 min à 95 ° C, 15 s à 95 ° C pour la dénaturation et 1 minute à 60 ° C. Réglez la limite inférieure de détection à un seuil de cycle (CT) de 35; Ainsi, tout échantillon ayant une valeur au-delà de CT 35 est considéré comme non détectable.
3. Le maintien de la tumorigénicité de MB49-PSA Cell Line
NOTE: L'exposition prolongée croissance in vitro conduit à une perte de tumorigénicité. Pour maintenir tumorigénicité, la lignée cellulaire MB49-PSA est repiqué par le biais de la souris au moins une fois tous les 2 ans.
- Cellules.
- La récolte des cellules à croissance exponentielle, en les grattant doucement avec un racleur de cellules stérile. Mélanger des volumes égaux de la suspension cellulaire et une solution de bleu trypan à 0,4%. Compter les cellules vivantes en utilisant un hémocytomètre. Ne pas implanter si plus de 20% des cellules sont mortes.
- Calculer la quantité de cellules vivantes requis (1 x 107 cellules / ml) et de les transférer à un tube de 15 ml centrifugeuse. Centrifuger à 250 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant. Re-suspendre le culot cellulaire dans DMEM supports vierges. Répétez le lavage trois fois pour éliminer toute trace de FBS avant l'implantation.
- Maintenir la suspension de cellules sur de la glace jusqu'à ce que les souris soient prêts pour l'implantation.
- Implanter des cellules tumorales par voie sous cutanée chez la souris sur le flanc dorsal.
- Anesthésier un 4 à 6 semaines d'âge souris C57BL6 / J à l'aide d'un mélange d'anesthésiques kétamine et de médétomidine (75 mg / kg et 1 mg / kg, respectivement), injectée par voie intrapéritonéale à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.
- Rasez le flanc droit d'exposer la peau.
- En utilisant une paire de pinces, soulever la peau pour le séparer du muscle sous - jacent et injecter 0,1 ml de la suspension de cellules (1 x 10 6 cellules) par voie sous- cutanée avec une aiguille 24 G. Lors du retrait de l'aiguille, pincer le site d'injection pendant 5 à 10 s de telle sorte que les cellules tumorales nepas de fuite hors du site d'injection.
- Revive la souris avec une injection sous-cutanée de atipamézole (1 mg / kg) à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.
- Surveiller la croissance de la tumeur tous les deux jours en mesurant le diamètre de la tumeur en utilisant des étriers. Le volume tumoral est calculé en utilisant la formule v = (ab 2) / 2, où "a" est la dimension la plus longue et "b" est la largeur perpendiculaire, à la fois en mm.
- Lorsque le volume de la tumeur est d' au moins 50 mm 3 (environ 7 jours), euthanize la souris avec du CO 2. Exciser la masse tumorale avec une paire de pinces et ciseaux stériles dans des conditions aseptiques et dans DMEM.
- Dans une plaque de culture à 6 puits, émincer la tumeur en petits morceaux à l'aide de scalpels stériles. Utilisez un piston de seringue mL 1 comme un «pilon» pour désagréger davantage la tumeur.
- Ajouter 3 ml de DMEM complet et maintenir les cellules dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Une fois que les cellules adhèrent à la plate-e (entre un et deux jours), retirez le support, les débris et les cellules non-adhérentes en aspirant doucement avec une pipette Pasteur stérile. Laver deux fois avec DMEM. Prenez soin de ne pas perturber les cellules.
- Ajouter 1 ml de DMEM et récolter les cellules en les grattant avec un racleur de cellules. Pour sélectionner et développer des colonies isolées, compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et la plaque 1 cellule par puits dans une plaque de culture à 96 puits. Des cellules de culture dans du DMEM avec 200 pg / ml d' hygromycine B à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Changer les médias et l'antibiotique tous les 4 - 5 jours. Surveiller les cellules jusqu'à ce qu'ils soient à environ 80-90% confluentes. Re-plaque des cellules sur une 24 plaque de culture par pipetage pour déloger les cellules du puits.
- Une fois que les cellules dans la plaque de culture 24 puits sont confluentes, les déloger en grattant avec un grattoir à cellules et la plaque eux dans une plaque de culture 6 puits.
- Cribler les clones différents pour PSA sécrétion, comme décrit dans l'étape 1. cryo-préservation du clone avec le secret de PSA plus haution et l'utiliser pour des expériences de souris futures.
4. Implanter la tumeur
NOTE: Chaque souris est implanté avec 1 x 10 5 cellules MB49-PSA dans 50 pl de DMEM supports vierges dans la vessie. En raison de l'espace mort dans le cathéter, toujours préparer un volume supplémentaire (au moins 100 pi supplémentaires par souris). Une approche alternative serait d'utiliser une seringue remplie d'air tel que décrit par Kasman et al. 5 plutôt que d' une seringue remplie.
- Cellules.
- Un jour avant l'implantation, lorsque les cellules sont d'environ 80% de confluence, le passage des cellules tumorales MB49-PSA dans un milieu complet DMEM (supplémenté avec 10% de SVF, 2 mmol / L de L-glutamine, 0,05 mg / mL de pénicilline-streptomycine et 200 pg / ml d' hygromycine B) à 37 ° C et 5% de CO 2 à un rapport de division de 1: 2.
- Le jour de la procédure, la récolte des cellules en les grattant doucement avec un racleur de cellules stérile. Mélanger des volumes égaux de la suspension cellulaire et0,4% trypan solution bleue. Compter les cellules vivantes en utilisant un hémocytomètre. Ne pas implanter si plus de 20% des cellules sont mortes.
- Calculer la quantité de cellules vivantes requis (2 x 10 6 cellules / ml) et de les transférer dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Centrifuger à 250 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant. Re-suspendre le culot cellulaire dans DMEM supports vierges. Répétez le lavage trois fois pour éliminer toute trace de FBS avant l'implantation.
- Maintenir la suspension de cellules sur de la glace jusqu'à ce que les souris soient prêts pour l'implantation.
- Laisser le 4 à 6 semaines vieille femelle C57BL / 6J à acclimater pendant une semaine avant la procédure. Tous les travaux des animaux doit être effectué dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir des conditions stériles.
- Peser chaque souris et injecter l'anesthésie (75 mg / kg de kétamine et 1 mg / kg médétomidine) par voie intrapéritonéale à 0,1 ml par 10 g de poids corporel. Poids corporel doit être comprise entre 17 et 22 g. Confirmer anesthetization en observant pas response après une pincée d'orteil.
- Pour l'identification, marquer l'oreille à l'aide d'un poinçon de l'oreille.
- Injecter une solution ou un composé de sodium lactate de Hartmann par voie intrapéritonéale à 0,1 ml par 10 g de poids corporel toutes les 1 - 2 h pour hydratation.
- Appliquer une pommade ophtalmique stérile pour les deux yeux à l'aide d'une ampoule de coton stérile, car le réflexe de clignement est perdue sous anesthésie et les yeux sécher. Renouveler si nécessaire.
- Poser la souris en position couchée sur des serviettes en papier sur le dessus d'un paquet de chaleur (activé par contact avec l'air) pour maintenir la température du corps et du ruban adhésif les pattes arrière vers le bas.
- Avec un doigt, appliquer une légère pression à la région abdominale inférieure et recueillir l'urine de la vessie dans un tube à centrifuger de 1,5 ml. Cet échantillon sert de la valeur basale de PSA urinaire.
- Retirer stérile poly-L-lysine (PLL) dans une seringue de 1 ml et fixer un 24 calibre de cathéter intraveineux, avec le stylet à aiguille retirée. Appliquer du lubrifiant sur la pointe du cathéter et insert le cathéter à travers l'urètre dans la vessie en utilisant une pince pour guider le cathétérisme. Arrêtez-vous lorsque la résistance se fait sentir. NOTE: Les chercheurs devraient discuter avec leur personnel vétérinaire sur la nécessité de l'utilisation d'un gel lubrifiant avec un anesthésique pour instillations intravésicale et l'utilisation de post-procédure analgésiques.
- Instiller 50 pi de PLL lentement, à une vitesse de 10 pi toutes les 20 s, pour éviter reflux vésico-urétéral 18. Laisser le cathéter dans la vessie pendant 20 minutes avec un bouchon pour empêcher l'écoulement hors.
- Au bout de 20 min, retirer le cathéter et évacuer la vessie de tout contenu en appuyant doucement sur la région abdominale inférieure. L'utilisation d'un vide seringue de 1 ml, rincer tout contenu restant hors du cathéter.
- Mélanger les cellules MB49-PSA soigneusement par pipetage et les retirer dans une seringue de 1 ml. Fixer le cathéter et appliquer du lubrifiant. Instiller 50 pi de 1 x 10 5 cellules à un rythme lent de 10 ul toutes les 20 s. Remplacer le bouchon surle cathéter. Donner des souris de contrôle 50 pi de solution saline.
- Après 1 h, retirer les cathéters et évacuer la vessie de tout contenu. Retirez le ruban adhésif sur les pattes de derrière et placer la souris sur leurs côtés ventraux. Revive les souris par voie sous-cutanée par injection du médicament d'inversion (1 mg / kg atipamézole) à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.
- Surveiller la souris jusqu'à ce que la motilité est observée. Remettre les souris dans leurs cages.
- A l'issue d'un protocole de détection de tumeurs (sections 5, 7 ou 8), euthanize les souris en utilisant du CO 2. la détection des tumeurs post-mortem est décrite dans la section 6.
5. Suivi croissance tumorale avec ELISA
REMARQUE: La présence et la croissance tumorale chez des souris est surveillée en mesurant la sécrétion de PSA dans l'urine. Les chercheurs devraient consulter leur personnel vétérinaire sur le suivi de la santé animale et le bien-être après l'implantation de la tumeur et les points limites.
- Il existe deux méthodes pour recueillir l'urine de souris.
- Recueillir l'urine pendant la nuit en plaçant une seule souris dans une cage métabolique individuel conçu pour séparer l'urine des matières fécales. Si la mise en place n'a pas de réfrigération, ajouter un inhibiteur de protéase (100 ul) dans le tube de prélèvement d'urine pour empêcher la dégradation de PSA durant la nuit. Cependant, le nombre de cages métaboliques disponibles limite l'utilité de cette méthode de collecte d'urine.
- Où il est logistiquement impossible d'utiliser des cages métaboliques (comme dans les salles de ABSL2), recueillir l'urine tache à l'aide d'un doigt pour exercer une légère pression sur la région abdominale inférieure, tandis que les souris sont anesthésiées comme décrit à l'étape 4.2.1. Cela se fait habituellement avant la thérapie est inculquée. D'après notre expérience, au moins 150 pi d'urine peut être collectée 1 h après l'anesthésie.
- Immédiatement placer l'urine recueillie sur la glace. Hématurie peut être visible à partir de la deuxième semaine après l'implantation de la tumeur. Les échantillons fortement hémolysés peuvent affecter l'analyse ELISA. Par conséquent, l'urinedoit être placé sur la glace et traitée rapidement après la collecte.
- Centrifuger les tubes d'urine à 6700 xg pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer les cellules ou les débris.
- Pour normaliser la différence de la production d'urine entre les souris, aliquote l'urine dans de nouveaux tubes et de les stocker à -30 ° C jusqu'à ce que l' exécution des analyses pour PSA en utilisant un kit ELISA 7 et de la créatinine en utilisant un kit de dosage 7. Même si les souris ne produisent pas de PSA, il existe un faible niveau de liaison non spécifique détectée en utilisant la méthode ELISA. Pour les échantillons à être considérés comme positifs, le seuil doit être fixé à des valeurs supérieures à la normale chez les souris + 3 écarts type (SD) 15.
6. Détection de présence de la tumeur avec la PCR en temps réel
- A la fin, disséquer la cavité abdominale de la souris et de localiser la vessie. Exciser la vessie et le placer dans un cryovial. Congeler immédiatement dans de l'azote liquide.
- Extraire l'ARN en homogénéisant les tissus dans un extr d'ARNréactif d'action.
- Effectuer une analyse de transcription inverse et de PCR en temps réel pour PSA, comme décrit ci-dessus dans la section 2.
7. Suivi croissance tumorale avec Imaging Fluorescence
- Étiquette 1 x 10 7 cellules MB49-PSA avec un colorant fluorescent proche infrarouge 19.
- Re-plaque et récolter les cellules marquées sur les jours 4, 7, 11, 14, 18, et 21 pour vérifier si les cellules conservent la viabilité et la fluorescence par cytométrie en flux 20.
- Implanter les cellules MB49-PSA marquées dans des vessies de souris, comme décrit ci-dessus dans la section 4.
- Surveiller la croissance de la tumeur en utilisant un système d'imagerie par fluorescence tous les deux jours.
- Le jour de l'imagerie, peser et anesthésier les souris en utilisant un mélange d'anesthésiques kétamine et de médétomidine (75 mg / kg et 1 mg / kg, respectivement), injectée par voie intrapéritonéale à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.
- Rasez la zone abdominale pour exposer la peau.
- Placer la souris dans la chambre d'imagerie et d'acquérirles images des vessies en utilisant le logiciel fourni avec le système d'imagerie.
- Revive les souris par voie sous-cutanée par injection d'un médicament d'inversion (1 mg / kg atipamézole) à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.
8. Suivi croissance tumorale avec haute fréquence d'imagerie par ultrasons
- tumeurs implants chez la souris, comme décrit ci-dessus dans la section 4.
- Tous les deux jours, de surveiller la croissance des tumeurs en utilisant l'imagerie par ultrasons.
- Le jour de l'imagerie, peser et anesthésier les souris en utilisant un mélange d'anesthésiques kétamine et de médétomidine (75 mg / kg et 1 mg / kg, respectivement), injectée par voie intrapéritonéale à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.
- Rasez la zone abdominale pour exposer la peau.
- Instiller 100 ul de 0,9% stérile saline dans la vessie à l'aide d'un calibre 24 IV cathéter. La solution saline se distendre la vessie et améliorer la visibilité pendant la imagerie par ultrasons.
- Placer la souris sur la plate-forme d'ultrasons et d'appliquer un gel conducteur au labdomen eurs.
- Abaisser la sonde de poche à la peau et acquérir des images en mode B de la vessie sur la plate - forme d'imagerie 21.
- Revive les souris par voie sous-cutanée médicament d'inversion d'injection (1 mg / kg atipamézole) à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.
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Representative Results
PSA sécrétion à partir de cellules MB49 a varié avec le milieu de croissance. MB49-PSA est cultivé dans DMEM médias parce que cela se traduit par une sécrétion accrue de PSA (figure 1A). Afin de déterminer la sensibilité du PSA ELISA et PCR en temps réel, un nombre différent de MB49-PSA sécrétant les cellules ont été mélangées avec des cellules parentales MB49. PSA ELISA détecte un minimum de 1 x 10 5 cellules PSA sécrétant / 1 x 10 6 cellules (figure 1B), tandis que l' analyse par PCR en temps réel détecte 100 cellules PSA sécrétant / 1 x 10 6 cellules (figure 1c). Ainsi, la PCR en temps réel est plus sensible que l'ELISA, mais elle ne peut être réalisée sur toute la vessie. Cela limite son utilité à l'analyse du point final. Le procédé PLL des résultats de l' implantation de la tumeur dans les tumeurs multiples (figure 2A) de développement dans la vessie. Tant la collecte du jour au lendemain de l' urine en utilisant des cages métaboliques (figure 2B (figure 2B, panneau inférieur) peuvent être utilisés pour mesurer PSA par ELISA. Pour toutes les études sur l'animal, le poids de la souris est noté en tant que mesure de la santé (figure 2C, panneau supérieur), et le PSA urinaire est contrôlée sur une base hebdomadaire (figure 2C, panneau inférieur) en tant que mesure de la croissance tumorale. Il existe généralement une bonne corrélation entre le poids de la souris et la taille de la tumeur, telle que mesurée par PSA. Les souris avec de grandes tumeurs commencent à perdre du poids (figure 2C, les souris 3 et 5). Certaines souris observées à la figure 2C peuvent avoir une grosse tumeur , mais affiche encore un poids corporel normal. Ainsi, le poids seul est pas une mesure suffisante de la croissance tumorale. PSA est un bon marqueur de substitution de la croissance tumorale (Figure 3A-D). Les souris ont été euthanasiées environ 3 à 5 jours après l' analyse d'urine pour le PSA au jour 14. Les images de la vessie , des sections transversales présentent la taille de la tumeur et le jour 14 PSA / créatinine x 10 6 rea correspondantding. La variation de la taille de la tumeur est liée au traitement, la souris a reçu. Figure 3, panneaux AD représentent des souris à partir de 3 bras de traitement différents. Une stratégie alternative à la modification du PSA de cellules est le marquage des cellules avec un colorant. Cette stratégie permet d'éliminer la nécessité d'une transformation et la sélection cellulaire. Étiquetage des cellules MB49-PSA avec un colorant fluorescent est facile à réaliser (figure 4A), et dans le suivi in vitro a montré la promesse en termes de survie du signal, en dépit de la réplication des cellules (figure 4B et C). Cependant, l'imagerie in vivo n'a pas été retenue, car la charge de la souris a également eu une fluorescence rouge naturel (figure 4D), ce qui a donné lieu à une fluorescence non spécifique dans la région abdominale. Une comparaison a été effectuée entre l'imagerie par ultrasons, PSA sécrétion urinaire, et l'analyse PSA point final. L' échographie de la vessie (figure 5A-H) a été bonne pour identifierde grosses tumeurs, mais il n'a pas été un tel succès avec de petites tumeurs.
Figure 1. PSA Sécrétion à partir de cellules MB49-PSA et la détermination des limites de détection par ELISA et analyse PCR en temps réel. (A) 1 x 10 6 MB49-PSA cellules ont été cultivées dans des milieux de croissance différents, et PSA sécrétion dans le surnageant a été détectée 2 jours plus tard par ELISA. Les milieux de culture étaient les suivantes: RPMI FBS- (RPMI), le milieu RPMI avec prime FBS (milieu RPMI (P)), le milieu RPMI avec un mode alternatif de FBS (milieu RPMI (H)) et de DMEM avec du FBS (DMEM). cellules MB49-PSA cultivées en milieu DMEM avaient plus la sécrétion de PSA. (B) Des cellules MB49-PSA (10 6 cellules pour 1 cellule) ont été mélangées avec des cellules parentales (1 MB49 de cellules à 10 6 cellules) et plaquées pendant 24 h. PSA ELISA a été effectué sur le surnageant, et l'ARN a été extrait des cellules. Un minimum de 1 x 10 5 6 cellules PSA-sécrétant étaient détectables par ELISA. (C) 100 cellules sécrétant PSA / 1 x 10 6 cellules sont détectables par analyse par PCR en temps réel. Les valeurs de l'axe des y représentent la RQ moyenne (de quantification relative) ± écart-type. Les valeurs RQ sont des changements de pliage relatifs, obtenus en normalisant les valeurs de PSA au gène de la bêta d'actine C T et par rapport à une vessie de commande qui est fixé à 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Vessie la croissance tumorale et la détection. (A) L' examen histologique d'une vessie 13 jours après l' implantation de la tumeur. La vessie en paraffine, est sectionné et coloré à l'hématoxyline (bleu foncé), qui stains les noyaux, et éosine (rose), qui colore les composants cellulaires restants. Le PSA / créatinine x 10 6 valeur de cette vessie aux jours 5 et 13 sont présentés comme 7/2688. Le grossissement est à 44.8X. La barre d'échelle représente 1 mm. (B) urine a été recueillie soit par des souris en plaçant dans des cages métaboliques pendant la nuit et le transfert de l'urine du tube de collecte dans des tubes de 2 ml (panneau supérieur) ou par on-the-spot de collecte d'urine de souris anesthésiées (panneau inférieur) dans des tubes de 1,5 mL , qui ont ensuite été transférés dans des tubes de 0,6 ml. (C) après implantation de la tumeur, le poids des souris a été contrôlée deux fois par semaine (panneau supérieur). PSA urinaire a été mesurée pour surveiller l'implantation et la croissance tumorale chez la souris (panneau inférieur). L'axe des y PSA / crea représente PSA urinaire normalisée à la créatinine x 10 6. Les souris ont été terminées une fois il y avait une perte de plus de 20% du poids corporel. Note: l'expression du gène de PSA a été détectée dans la vessie de souris 2 à 40 jours, quand il était termi NATed, même si elle avait une faible PSA urinaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 PSA et de la vessie croissance tumorale. (AD) Des coupes histologiques de vessies de souris récoltées au jour 19 (A et B), jour 17 (C) et le jour 13 (D) après l' implantation de la tumeur. Le jour 4 et le jour 13 ou 14 jours PSA urinaire / créatinine x 10 6 valeurs pour chaque vessie est indiqué sur le côté droit de chaque image dans le format jour 4 / jour 13 ou 14. Le PSA urinaire / valeurs de créatinine augmente avec la taille de la tumeur . Les souris ont reçu des images différentes thérapies AD représentant les différences de taille de la tumeur. Le grossissement est à 41.4X. La barre d'échelle représente 1 mm.cible "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55078/55078fig3large.jpg" = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Profil des cellules MB49-PSA marqué avec un Fluorescent Dye. (A) Les cellules colorées ont été analysées par cytométrie en flux avant l' étalement. Les cellules marquées ont été récoltées tous les deux jours pour analyser l'intensité du colorant fluorescent. (B) Pourcentage de cellules MB49-PSA marquées au sein de la porte P2 de (A) à l'étiquetage des jours spécifiés. (C) L' intensité du colorant fluorescent mesuré par l' intensité moyenne de fluorescence (MFI) du signal. (D) Images de souris 10 jours après l' implantation, étiquetés cellules MB49-PSA en utilisant un système d'imagerie in vivo en ont montré une fluorescence non spécifique dans la région abdominale.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Ultrasound Images de murins Bladders. Vessies de souris (A) avant l' implantation de la tumeur et (B) 8 jours après implantation de la tumeur. (C) à (H) sont des images échographiques de souris vessies deux semaines après l' implantation. PSA / crea: PSA urinaire normalisée à la créatinine (10 6). gène PSA: l'expression du gène de PSA dans les vessies (log RQ) sont indiqués pour chaque vessie. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| PSA urinaire | fluorescence Imaging | Ultrasound Imaging | |
| Les étapes (temps nécessaire) | Anesthetize souris. Recueillir 110 ul d'urine. (~ 1 h) Effectuer PSA ELISA (temps d'incubation total: 2 h 30 min) dosage de la créatinine (temps d'incubation: 5 min) | Anesthetize souris. Rasez la fourrure sur la région abdominale. Effectuer l'imagerie. | Anesthetize souris. Rasez la fourrure sur la région abdominale. Sonder et instiller 100 ul de solution saline dans la vessie. Appliquer le gel conducteur pour abaisser l'abdomen et obtenir des images ultrasonores. |
| L' équipement spécialisé | Lecteur de plaque ELISA (longueur d'onde de 450 nm et 510 nm) | Système d'imagerie | Ultrasound Imaging System |
| Modification des cellules tumorales | required (PSA exprimant) | Requis (fluorescence) | Non requis |
| Avantages | Fiable | Simple et rapide | Peut détecter de grosses tumeurs |
| Limites | Ne peut pas obtenir assez d'urine Une valeur négative ne signifie pas absence de tumeur (PSA analyse de l'expression du gène augmente la sensibilité, mais est limitée à la fin du point d'analyse) | Une sélection rigoureuse de colorant fluorescent est nécessaire pour éviter un bruit de fond. | Vous ne pouvez pas détecter de petites tumeurs. Une souris à la fois. |
Tableau 1. Comparaison des méthodes de suivi de la croissance tumorale dans Bladders Souris.
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Discussion
Les étapes les plus critiques dans le protocole sont: 1) maintenir avec succès la tumorigénicité de la lignée cellulaire; 2) assurant mesurable PSA sécrétion avant l'implantation des cellules tumorales chez la souris; 3) la génération d'une suspension à cellule unique pour l'implantation de manière à réduire la variation de la taille de la tumeur; et 4) instiller des cellules à une vitesse lente pour éviter reflux vésico-urétéral, ce qui entraîne une tumeur implantation de cellules dans le rein.
Après passage prolongée in vitro, des cellules MB49 / MB49-PSA peuvent perdre leur tumorigénicité, comme le démontre leur incapacité à produire des tumeurs chez les souris. Cela pourrait être un facteur de confusion quant à savoir si ou non les souris sont guéris après le traitement. En l'absence de tumeurs, il est impossible de différencier les souris guéries par une thérapie de souris guéries spontanément en raison des tumeurs immunogéniques ou de souris sans tumeur du tout parce que la lignée cellulaire est dans l'impossibilité de former des tumeurs. Une façon de contrer ce problème consiste à re-passage des cellules dans des souris en produisant sub-cutanée des tumeurs. Si cette re-repiquage est effectué trop souvent, les tumeurs trop agressives sont générées. Un bel équilibre est nécessaire pour déterminer le moment où les cellules doivent être re-repiquées. En règle générale, avant une importante série d'expériences, la lignée cellulaire est relancé puis implanté chez des souris sous-cutanée pour confirmer leur capacité à former des tumeurs. Les tumeurs sont surveillés pendant plusieurs semaines pour s'assurer qu'il n'y a pas de guérison spontanée. Cependant, si des guérisons spontanées sont observés, alors le protocole de l'étape 3 doit être effectuée. De même, la capacité des cellules MB49-PSA pour produire PSA doit toujours être confirmé avant que les cellules sont utilisées pour l'implantation de la tumeur.
PSA urinaire peut être utilisée pour surveiller la croissance des tumeurs de la vessie établies en utilisant des cellules MB49-PSA. Toutefois, une valeur négative ou "normale" urinaire PSA ne signifie pas nécessairement une absence de cellules tumorales, mais seulement que moins de 1 x 10 5 cellules sont présentes. Comme PSA urinaire est déterminé autour du jour 4au jour 7, les souris qui ne semblent pas avoir une tumeur, en fonction de la valeur normale de souris + 3 SD, peuvent être retirées de l'expérience. Certains de ces souris peuvent développer une tumeur à une date ultérieure. Retrait des souris sans tumeurs assure que les tumeurs sont très similaires en taille avant de commencer tout traitement. Ceci réduit la variation due à la taille de la tumeur en réponse à la thérapie. Une cause majeure de variation de la taille de la tumeur est l'agglutination des cellules avant l'implantation, donc les efforts devraient être faits pour remettre en suspension les cellules avant l'implantation.
Cependant, quand un petit nombre de souris sont utilisées, il peut être nécessaire de garder toutes les souris dans l'étude, même si les tumeurs ne sont pas mesurables par jour 4 - 7. En surveillant PSA le jour 11, il peut toujours être possible de classer ces les souris comme ayant eu des petites tumeurs, et une analyse de point final peut être effectué par rapport à la taille initiale de la tumeur ( en fonction de la présence de PSA mesurable sur urinaire jours 4 - 7 jours par rapport à 11). L'avantage d'être capable de quantifier les tumeursavec des valeurs de PSA est que toutes les souris peuvent être inclus dans l'étude, et la réponse à la thérapie peuvent être déterminées en fonction de leurs valeurs PSA / créatinine par rapport à la taille initiale de la tumeur. Un autre point de préoccupation est reflux vésico-urétéral. Cela peut se traduire par le développement de tumeurs dans les reins. La réduction du volume à instiller de 100 pi à 50 pi et en effectuant l'instillation lentement réduit la probabilité que cela se produise.
Un problème associé à des dosages à base d'urine est la collecte d'urine réduite observée sous forme de tumeurs orthotopiques se développent dans la vessie. Alors que l'urine peut être facilement collectées à partir des souris pendant les premières semaines après l'implantation, avec le temps, le volume d'urine recueillis peuvent ne pas être suffisante pour PSA et de créatinine mesures. Le volume minimum d'urine nécessaire est de 110 ul, mais plus est préférable. Ainsi, les lectures de PSA peuvent ne pas être disponibles pour toutes les souris à des points de temps plus tard. En outre, la lyse des globules rouges dans l'urine donne faussementlecture élevée sur le PSA ELISA. Un essai à base non urine peut surmonter ce problème. Malheureusement, bien que l'imagerie de fluorescence est simple à utiliser, nous avons constaté que l'alimentation de la souris avait fluorescence rouge aussi. Cela a donné un bruit de fond élevé contre lequel la vessie ne pouvait pas être facilement vu. Il est possible que l' utilisation d' un colorant ou d'une protéine fluorescente verte peut surmonter ce problème, comme décrit par Sweeney et al. 10 Pour les deux fluorescence et les ultrasons, les souris doivent être rasés sur la face ventrale.
Les images échographiques semblent être aussi bon que l'expression du gène de PSA dans la localisation des tumeurs. Cependant, l'inconvénient d'imagerie par ultrasons est que la vessie doit être distendue lors de l'imagerie pour obtenir une bonne visualisation d'une tumeur. Alors que les images sont claires lorsque la tumeur de la vessie est grand, il est difficile de différencier les petites tumeurs chez les souris de l'absence de tumeurs. Il a été rapporté que les ultrasons peuvent détecter des tumeurs d' environ 1,5 mm de diamètre 22, mais le jour 4après l'implantation, les tumeurs sont beaucoup plus petits que celui-ci. Ainsi, cette méthode ne peut pas être bon pour la détection de tumeurs au jour 4. Le tableau 1 compare les 3 systèmes de surveillance de la tumeur différentes; PSA ELISA est le plus simple à utiliser et ne nécessite pas de systèmes d'imagerie de petits animaux, qui peuvent ne pas être disponibles dans toutes les installations des animaux.
Compte tenu de la grande sensibilité de l'analyse PCR en temps réel de l'expression du gène PSA, il peut être utilisé à la place de l'immunohistochimie pour confirmer si les souris ont été durcies lorsque l'expérience a été arrêtée. Avec immunohistochimie, une tumeur de 0,2 - 0,3 mm est détectable par jour 4 après l' implantation 15. Cependant, ceci est un procédé d'analyse de point final qui ne peut être utilisé pour surveiller l'implantation de la tumeur. Dans cette étude, l' IRM n'a pas été évaluée, mais il a été rapporté pour être en mesure d'identifier la présence de tumeurs au jour 10 après l' implantation 8. En modifiant les cellules pour exprimer la protéine fluorescente verte (GFP), il is possible de confirmer l'implantation de la tumeur au jour 7. Une combinaison de PSA urinaire précoce afin de détecter l'implantation de la tumeur et l'analyse par PCR en temps réel lors de la fin fournit une confirmation de l'implantation de la tumeur et l'efficacité thérapeutique entre les différents groupes de traitement.
Un inconvénient de notre protocole est principalement que le test ELISA ne peut confirmer la présence de tumeurs lorsque le nombre de cellules présentes est inférieure à 10 5 cellules. Ainsi dosages plus sensibles doivent être développées ainsi que des tests plus rapides pour réduire le temps nécessaire pour la détection de PSA. ELISA prend plusieurs heures à effectuer. Un procédé rapide , tel que le dosage de la créatinine , qui est basée sur la méthode de Jaffe 23 et prend environ 5 minutes pour effectuer serait grandement simplifier le contrôle de la croissance tumorale. A cette fin, un procédé enzymatique pour détecter l'activité du PSA a été évaluée, mais il n'a pas été couronnée de succès. L'utilisation de l'or colloïdal et des systèmes d'analyse de nanoparticules à base pourrait réduire le temps nécessaire pour effectuer le test d'unnd augmenter la sensibilité 24. À cet égard, les capteurs d'électrodes à base et des capteurs à base électrochimiques utilisant des nanoparticules ont été développés pour le dosage PSA humain 25-27 et si le coût est raisonnable peut être applicable au modèle animal. Le système d'essai peut également être améliorée en utilisant un système de sécrétion de protéines différentes telles que la GFP ou la luciférase , où le dosage est effectué dans des conditions optimales in vitro plutôt que de dépendre de l' imagerie in vivo , qui dépend de l' oxygénation des tissus.
Alors que la carcinogenèse chimique chez la souris génère des tumeurs présentant une similarité de cancers humains en ce qui concerne les mutations 28, elles prennent plus de temps pour produire et ne sont pas aussi comparables en taille entre les animaux, ce qui nécessite un plus grand nombre de souris qui augmente le coût de l' expérimentation. Lorsque les agents de reconnaissance des protéines humaines de ciblage sont à évaluer, les xénogreffes humaines implantées sous-cutanée dans l'immunodéficience combinée nue ou grave(SCID) est la seule option. Bien que ces modèles fournissent la preuve du concept de la reconnaissance des anticorps, l'absence d'un système immunitaire intact évaluation de l'activation immunitaire entrave. Le développement récent d'un modèle de souris humanisée pour le cancer de la vessie à l' aide des xénogreffes humaines 29, fournit un aperçu immuns, mais que les cellules sont implantées en sous - cutané ne fait pas récapituler l'environnement de la maladie humaine. Il est techniquement difficile de produire des tumeurs orthotopique chez des souris immunodéficientes. Ainsi, le modèle orthotopique syngénique malgré ses limites est toujours un bon modèle pour l'évaluation et le développement de la thérapie pour le cancer de la vessie car il fournit l'emplacement de tissu correct permettant de contrôler l'exposition à la thérapie modélisation de la situation clinique et la capacité d'évaluer l'impact des cellules immunitaires de l'hôte au cours du traitement du cancer. Tout cela combiné avec le développement rapide de la tumeur chez la souris et la possibilité de surveiller les résultats de la croissance tumorale dans un modèle de coût-efficacité.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4 - 6 wk old | |
| Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack - HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24 G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye - VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
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