Introduction
Somieten zijn de eerste segmenten gevormd in het langwerpig lichaam as ontwikkeling gewervelde dieren en zijn de voorlopers van de wervelkolom, ribben en dermis weefsel, en van spier- en endotheelcellen. Tijdens somitogenesis, epitheliale somieten vormen van de ongesegmenteerd presomitische mesoderm (PSM) (beoordeeld in referentie 1). Dit proces wordt geregeld door de "segmentatie klok", die bestaat uit een netwerk van oscillerende genen en eiwitten, vooral die van het Notch signaling pathway. De segmentatie klok bestaat uit diverse negatieve feedback loops, waarbij de pulserende productie van Notch activiteit binnen een enkele cel 2 in te schakelen (beoordeeld in de referenties 3-6). Terwijl de intracellulaire wijze van oscillatie goed gekarakteriseerd, is nog grotendeels onbekend hoe deze oscillaties in de PSM weefsel worden gecoördineerd. Het is onlangs aangetoond, door middel van zowel experimentele en theoretische studies, dat deze oscillaties zijn Essential om het proces van somitogenesis en dat de Notch route speelt een cruciale rol in het proces van zowel segmentering en oscillerende genexpressie 7, 8. Er is echter op grote schaal gemeld dat Notch receptor 1 (Notch1) en Delta-achtige ligand (Dll) -1 statische gradiënten in de PSM 9, 10, 11.
Onze hypothese dat Notch-afhankelijke trillingen van de PSM segmentatie klok afhangen van het periodiek activeren van de belangrijkste route Notch receptor en ligand, Notch1 en Dll1 respectievelijk over de muis PSM. De conclusies van eerdere studies die een statische rostrale-caudale gradiënt van deze eiwitten waren dus vanwege voorspellen we, een gebrek aan gevoeligheid van immunokleuring technieken. Zij waren dan ook niet aan de schommelingen van Dll1 en Notch1 low-level op te sporen in de staart PSM.
We hebbene een methode ontwikkeld om nader te onderzoeken deze factoren combineren experimentele gegevens mathematische modellen om een mechanisme waardoor de oscillaties van de eiwitten van klokcomponenten worden in de PSM 12 gecoördineerd voorspellen.
Het algemene doel van deze methode is het opsporen en kwantificeren lage dynamische eiwitexpressie in de PSM en de expressie profielen van eiwitten van belang in kaart uit de betrekking van de bekende klok gen Lunatic fringe (Lfng). Aangezien een cyclus van de segmentatie klok in de muis embryo duurt 2 uur in beslag, zijn verschillende monsters nodig zijn om een volledige spatiotemporele profiel van Dll1 en Notch1 eiwit expressie te bouwen tijdens een Lfng trilling in het PSM. We hebben dus dit protocol te houden met de high-throughput detectie van low-level eiwitexpressie in whole-mount, contralaterale PSM explantaten ontwikkeld. Echter kan deze techniek ook nuttig voor studies t te bedragenhat gericht op low-level eiwit dynamiek karakteriseren binnen een embryonaal weefsel dat kan worden opgesplitst in contralaterale helften.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in het kader van project licentie nummer 6004219 in strikte naleving van de Dieren (Scientific Procedures) Act van 1986 en het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken gedragscodes voor het gebruik van dieren in wetenschappelijke procedures.
1. PSM Explantatie Dissection
- Haal de staart weefsel van embryo's die door de getimede paring van wild-type (CD1) muizen 13. In het kort, op embryonale dag (E) 10,5, euthanaseren de zwangere donor muis in een kooldioxide-kamer. Oogst de baarmoeder hoorn en plaats het in 1x steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing in overeenstemming met kantoor aan huis License procedures of gelijkwaardige plaatselijke regels. Breng de baarmoeder hoorn om een weefselkweek schotel met verse, steriele PBS. Voer alle verdere dissectie stappen in deze oplossing.
- Onder een stereomicroscoop, snijd de dikke gespierde membraan van de baarmoeder hoorn met behulp van gebogen schaar en uitpakken elk embryo zorgvuldig met behulp van fijne pincet. Wees voorzichtigzodat de staart weefsel niet hierbij beschadigd. Met behulp van gebogen schaar en fijne tang, ontleden weg de vruchtzak van elk embryo, het verzorgen van het embryo niet te beschadigen.
- Gebruik ofwel een chirurgische naald of gebogen schaar om de staart weefsel van elk embryo oogst door het snijden van het embryo posterior aan de achterzijde ledematen.
- De balans van de staart weefsel ventrale naar beneden met behulp van zowel pincet en een naald. Genereer paren van PSM explantaten uit elke embryonale tail door het ontleden van de staart weefsel in twee helften langs de middellijn; het uitvoeren van een zachte schommelende beweging met een naald. Zorg ervoor dat de neurale buis, notochord en PSM weefsel gelijkelijk worden verdeeld tussen de twee explantaten.
- Pipetteer elk contralaterale PSM explantaat op de onderzijde van een plastic kweekschaal deksel 35 mm in een klein volume van voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium (DMEM-F12 + 0,1% L-glutamine substituut gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum , 10 nM menselijk bFGF, en 1% penicilline / streptomycine). <li> Zet de schaal aan de bovenkant van het deksel en snel omkeren het zo dat de PSM weefsel is opgehangen aan het deksel een "opknoping drop" drager. Cultuur de PSM explantaten in een bevochtigde kamer bij 37 ° C gedurende 1-2 uur.
- Overdracht paren PSM explantaten aan de individuele putjes van een 24 putjes weefselkweekplaat. Incubeer in 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (KT) of 4 ° C overnacht (O / N). LET OP: Paraformaldehyde is giftig, en passende veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen bij het werken met deze oplossing.
Opmerking: Voer alle daaropvolgend wassen en incubatie stappen in een 24-well weefselkweekplaat. - Was het monster putjes in PBS bij kamertemperatuur op een schudplatform, met een fijne plastic Pasteur pipet om de PBS-oplossing op de monsters te wisselen voor verse PBS 3-4 keer. Na verwerking PSM explantaat van elk paar met behulp van immunohistochemie (stap 2) en de andere met fluorescerende in situ hybridisatie voor een bekende klokgen (step 3).
2. Immunohistochemie van PSM Explantaten
- Was één PSM explantaat uit elk embryo paar gegenereerd in stap 1 in 2% Triton X-100 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schudapparaat en spoel monsters kort in PBS. Vervang de PBS op monsters met blokkeeroplossing (2% runderserumalbumine (BSA) en 10% normaal geit serum (NGS) in PBS + 0,1% Tween-20) en incubeer O / N bij 4 ° C op een schudplatform.
OPMERKING: Alle daaropvolgende wast en incubatie stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur op een schommelende platform, tenzij anders vermeld. Wash-oplossingen kunnen gemakkelijk worden veranderd met behulp van een fijne punt plastic of glas Pasteur pipet. - Verdun het gewenste primaire antilichaam / antilichamen in werkende buffer (0,1% BSA, 0,3% NGS en 0,2% Triton X-100 in PBS). In dit voorbeeld verdunnen Dll1 en Notch1 antilichamen 1:25 in werkbuffer.
LET OP: optimalisatie nodig zal zijn om de juiste verdunningsfactor nodig thi bepalens stap als alternatief antilichamen worden gebruikt. - Incubeer explantaten in de antilichaamoplossing gedurende 3-5 dagen bij 4 ° C op een schudplatform. Zorg ervoor dat u een aantal voorbeelden met het werken buffer die geen primaire antilichaam op te treden als secundaire controles antilichaam bevatten.
- Herstel de primaire antilichaamoplossing in een 1,5 ml opslagbuis met een pipet en het op 4 ° C.
OPMERKING: Teruggewonnen primaire antilichaam kan meerdere malen worden gebruikt, afhankelijk van het gebruikte antilichaam. - 2 wasbeurten voeren van de monsters op 5-10 minuten elk in PBS, gevolgd door 3 wasbeurten van 10 minuten elk in 2% Triton X-100 in PBS bij kamertemperatuur op een schudplatform.
- Verdunnen fluorescent gelabelde secundaire antilichaam / antilichamen (epitoop afgestemd op het primaire antilichaam / antilichamen die) in werkende buffer. Voeg desgewenst 20 ug / ml Hoechst 33342 aan deze oplossing om de kernen tegenkleuring.
OPMERKING: Optimalisatie kan nodig zijn om de juiste verdunningsfactor hoeft deze stap bepalen. In deze example, een verdunningsfactor van 1: 400 werd meestal gebruikt. - Centrifugeer de secundaire antilichaamoplossing gedurende 10 minuten bij 16 xg om de vorming van antilichamen aggregaten voorkomen. Voeg 250-500 pl van het secundaire antilichaamoplossing elke monsterholte, verzorgen de laatste paar microliter van de oplossing, welk antilichaam aggregaten bevatten te gebruiken.
- Wordt het monster plaat met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te minimaliseren en incubeer de monsters in de secundaire antilichaamoplossing gedurende 3-5 dagen bij 4 ° C in het donker.
- Voordat proeven monteren, was de monsters tweemaal gedurende 10 min elk in 0,1% Tween-20 in PBS (PBST) en eenmaal gedurende 5 min in PBS bij kamertemperatuur op een schudapparaat (zie stap 4).
3. Fluorescent in situ hybridisatie (FISH) van PSM Explantaten
- Indien opgeslagen in een andere vat, draagt de resterende contralaterale PSM explantaten aan de individuele putjes van een 24 putjes weefselkweekplaat.
- Was de monsters voor10 min in 50% ethanol in PBST, en voer vervolgens 2 wassingen gedurende 10 min elk in 100% ethanol op een schommelende platform bij RT om het weefsel te dehydrateren.
OPMERKING: Alle daaropvolgende wast en incubatie stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur op een schommelende platform, tenzij anders vermeld. - Hydrateren het weefsel door wassen gedurende 10 minuten in 50% ethanol in PBST, gevolgd door wassen tweemaal gedurende 5 minuten elk in PBST.
OPMERKING: Stappen 3.2 en 3.3 noodzakelijk fixatie stappen vereist voor dit protocol en kan niet worden weggelaten. - Incubeer de monsters met 10 ug / ml proteïnase K in 0,1% Tween-20 in PBS (PBST) gedurende 5 minuten zonder schudden. Snel verwijderen van de proteinase K en spoel de monsters kort met PBST voordat post-vaststelling van het weefsel gedurende 30 minuten in 4% formaldehyde + 0,1% glutaaraldehyde in PBST. LET OP: Zowel formaldehyde en glutaaraldehyde zijn giftig, en passende veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen bij het werken met deze oplossingen.
OPMERKING: De volgende wassenen incubatiestappen met 50% en 100% hybridisatie mixen (stappen 3,6-3,9) worden uitgevoerd zonder roeren. - Na wassen van de monsters tweemaal gedurende 10 min elk in PBST wassen monster eenmaal in 50% hybridisatiemengsel (geschikt voor intronic probes: 50% formamide, 5x zout-natriumcitraat (SSC), 5 mM EDTA, 50 ug / ml tRNA, 0,2% Tween-20, 0,1% SDS en 100 ug / ml heparine) in PBST bereid bij kamertemperatuur. Incubeer de monsters in deze oplossing gedurende 10 minuten bij 65 ° C zonder schudden.
- Spoel de monsters tweemaal met voorverwarmde (65 ° C) hybridisatiemengsel voordat de monsters te incuberen in hybridisatiemengsel gedurende ≥ 2 uur (tot 48 uur) bij 65 ° C (langere incubatietijden verbeteren het resulterende signaal-ruis contrast) . Verwijder de hybridisatie mix van de vorige stap, en vervangen 0,25-0,5 ml voorverwarmde (65 ° C) hybridisatiemengsel bevattende een digoxigenine (DIG) gemerkt anti-sense RNA-probe met een bekende segmentatie klokcomponent.
NIETE: Zo werd een intron Lunatic fringe (Lfng (i)) probe gebruikt in een concentratie van 20 ul / ml op beginnende Lfng mRNA te detecteren. De verdunning die in deze stap probe-afhankelijk en zullen optimalisatie vereisen. - Dicht de plaat middels plakband om verdamping te voorkomen en incubeer de monsters in de probe gedurende twee nachten bij 65 ° C.
- Met behulp van een fijne punt plastic Pasteur pipet, herstellen van de sonde voor hergebruik en op te slaan bij 20 ° C. Spoel de monsters tweemaal met voorverwarmde (65 ° C) na hybridisatiemengsel (50% formamide, 0,2% Tween-20, en 1 x SSC) voor het wassen van de monsters twee keer gedurende 20 min elk bij 65 ° C in pre- opgewarmd post-hybridisatie mix.
- Was de monsters gedurende 15 minuten bij 65 ° C in voorverwarmde 50% hybridisatiemengsel in 0,1% Tween-20 in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBST). Spoel de monsters tweemaal met TBST voor het wassen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in TBST op een schudplatform.
- Pre-incubeer de explantaten in blocking oplossing (TBST + 2% blokkerende buffer reagens (BBR) + 20% warmtebehandeld geit serum) gedurende minimaal 2 uur. Vervang deze oplossing met verse blokkerende oplossing die een 1: 200 verdunning van mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaam. Incubeer de monsters O / N bij 4 ° C.
- Na het antilichaam incubatie, spoel de monsters 3 keer met TBST bij kamertemperatuur en overbrengen naar individuele putjes van een nieuwe 24-well weefselkweekplaat. Was de explantaten met TBST 3 keer per 1 uur.
- Op dit punt, breng de monsters in 0,5 ml opslagbuizen of individuele putjes van een 48 putjes weefselkweekplaat het vereiste volume van het Tyramide signaalversterking (TSA) detectiereagentia in de volgende stappen te verminderen.
- Incubeer monsters TSA amplificatiebuffer (zie de lijst reagentia) bij KT gedurende 1 min zonder schudden gebruik zo klein mogelijk volume, zodat de monsters volledig ondergedompeld in de oplossing.
- Voeg TSA reagens (zie deLijst reagentia) om het monster amplificatie buffer bij een verdunning van 1:50. Vlug de oplossing te mengen totdat TSA reagens gelijkmatig verdeeld, bedek de platen of buizen in aluminiumfolie en incubeer de monsters gedurende 60-90 minuten in het donker.
- Verwijder de TSA amplificatie oplossing en was de monsters in TBST 3 maal gedurende 5 minuten elk. Breng de explantaten naar een 24-well weefselkweekplaat met het wassen in TBST volume verhogen en incubeer de monsters in 1% waterstofperoxide gedurende 1 uur. Was de monsters met TBST 3 maal gedurende 5 minuten elk, en daarna tweemaal gedurende 5 minuten elk met PBST voorafgaand monsters monteren (zie stap 4).
4. Monstervoorbereiding for Imaging
- Bereid een geladen adhesie glaasje per paar explantatie door toevoeging van 0,12 mm dik imaging afstandhouders, die voorkomen dat de monsters niet plat gedrukt door toevoeging van een dekglaasje. Verwijder de beschermfolie van het ene oppervlak van een afstandhouder en plaats deze klevende zijde naar beneden op een glasplaatje cursortoetsen firmly de spacer aan de dia af te dichten.
LET OP: Voor de resterende stappen, zich inspannen om de monsters bij weinig licht of in het donker te houden aan fotobleken te voorkomen. Pipet explantaat paren op een voorbereide dia met een glazen Pasteur pipet in het centrum van de afstandhouder, zodat de ontleed zijde van het explantaat tegenover de slede. Schik contralaterale paren van explantaten naast elkaar. - Verwijder zoveel vloeistof als mogelijk van de glijbaan met een glazen Pasteur pipet en lont uit het resterende vocht rondom de monsters met behulp van een stuk van gevouwen pluisarme vloeipapier.
- Laat de monsters te houden aan de glijbaan voor 45 - 60 s, totdat het weefsel begint kleverig en doorzichtig te verschijnen. Gedurende deze tijd, verwijder het resterende lijm voering van het tussenstuk met behulp van een tang. Sta niet toe dat de monsters te drogen.
- Voeg een grote druppel dubbele functie inbedmiddel en clearingoplossing (0,5% p-fenyleendiamine en 20 mM Tris, pH 8,8, in 90% glycerol) bij de monsters binnen het centrumvan de afstandhouder. LET OP: Deze oplossing wordt bruin / zwart wanneer toegestaan om oxideren.
- Plaats voorzichtig een cirkelvormige dekglaasje (nr. 1.5) aan de overkant van de monsters, ervoor te zorgen dat de afdekmedium gelijkmatig wordt verdeeld en dat alle randen van het dekglaasje contact maken met de afstandhouder. Plaats het-cover gleed slide op zijn kop op een aantal low-lint vloeipapier.
- Stevig aandrukken zodat het dekglaasje volledig achter de afstandhouder en overtollig inbedmiddel wordt verwijderd. Herhaal dit totdat er geen meer inbedmiddel vlekken het papier.
- Schoon en het etiket van de dia ( 's) op de juiste wijze, en bewaar ze in het donker tot beeldvorming, op korte termijn bij -20 ° C of op lange termijn bij -80 ° C. Na het verwijderen van de dia's uit de opslag, zodat zij volledig ontdooien voor de beeldvorming.
- Het imago van de gemonteerd monsters met behulp van een confocale microscoop met betegelde overname en een hoog doel vergroting. Afbeelding het explantaat paren met een 40x olie-immersie objectief bij 4 pm z-intervallen middels 488 nm, 568 nm en 647 nm laser-lines om de groene, rode en ver-rode fluoroforen, respectievelijk gebruikt voor eiwit- en mRNA detectie in dit onderzoek 12 wekken.
LET OP: Betegelde beelden werden gestikt na de overname tot een enkel beeld voor analyse vormen.
5. Post-acquisitie Image Analysis
- Met beeldanalyse software om een gebied van belang in de PSM van elke experimentele monster bepalen.
- Om expressieniveaus, subtract achtergrond en drempel beelden kwantificeren van het niveau van een niet-primaire controlemonster vóór verder kwantificatie. Definieer een oorsprong, een as, en een lengte-eenheid voor elk monster.
- Bereken de fluorescentie-intensiteit als functie van positie langs het genormaliseerde rostro-caudale as voor elk van de M 12 monsters. Na normaliseren van de intensiteit percelen, plaats de intensiteitsprofielen naast elkaar en krijgen een intensiteit matrix f (i, j) de intensiteit op de i beschrijft
6. Temporal bestellen van Monsters
- Temporele bestelling van een bekende klokcomponent afleiden definieert de intensiteit matrix. Vervolgens volgorde van de kolommen van de matrix intensiteit teneinde een in de tijd periodiek patroon te verkrijgen. Om dit te doen, bepalen de functie
waarin A (fj; k) representeert de autocorrelatiefunctie van de jde kolom F en A T een doelwit autocorrelatiefunctie gekozen aanwezig om de periodiciteit van het patroon af te dwingen, gegeven door
- Gebruik Metropolis-Hastings (of een andere minimalisering algoritme) 12 om de volgorde van de monsters die de functie g minimaliseren identificeren. Aldus bepalen de volgorde van deM monsters die de temporele periodiciteit van een bekende klok component maximaliseert.
- Met behulp van de afgeleide temporele volgorde van de M monsters, bouwen een geordende kymograaf voor de expressie patroon in de gepartnerde kanaal 12.
Representative Results
Dit protocol maakt de visualisatie van de spatiotemporele profiel van een eiwit van belang naast klok gentranscriptie in de muis PSM 12. Bijvoorbeeld, Dll1 (Figuur 1 A-C) en Notch1 (figuur 1D-F) eiwitexpressie zijn vertegenwoordigd uit synchroon oscilleert met de ontluikende transcriptie van het Notch-gereguleerde segmentatie klokgen Lfng. Kwantificering van Dll1, Notch1 en Lfng (i) signaalintensiteit ten opzichte van de antero-posterieure (AP) as van de PSM (figuur 1G) blijkt duidelijk oscillerende expressie dynamiek voor deze doelen (Figuur 1H-J). De spatiotemporele profiel van Dll1 en Notch1 eiwitexpressie gedurende de klokcyclus duidelijk gevisualiseerd en gekwantificeerd met behulp van dit protocol via de post-acquisitie beeldanalyse van vaste weefsel beelddata met een hoge resolutie.
Figuur 1: Ruimte-tijd visualisatie en kwantificering van Dll1 en Notch1 Protein Expression Dynamics. (AF) Paren van explantaten zes E10.5 embryo (AF) met de ruimtelijke verdeling van Dll1 eiwit (AC) of Notch1 eiwit (DF) in één helft langs de detectie van Lfng pre-mRNA (Lfng (i)) in overeenkomstige contralaterale helft van elk paar. Panelen zijn gerangschikt volgens Fase 1 (A en D), fase 2 (B en E), en fase 3 (C en F) van de segmentatie klokcyclus, zoals bepaald door de ruimtelijke profiel van Lfng (i) expressie. De omvang van de expressie domeinen Dll1 (groen), Notch1 (rood) en Lfng (i) (grijs) langs de antero-posterior as van de PSM hebben bEen afgebakend door gekleurde balken. De gestippelde lijnen bakenen de positie van de laatst gevormde somieten (s), de buitenranden van de PSM en de aangrenzende neurale weefsel (C en E). Schaal bars (linksonder van elk paneel, AF) vertegenwoordigen 100 urn. (G) Een voorbeeld intensiteit plot beeltenis van de axiale variatie in de intensiteit van het signaal over de PSM. De data wordt begrensd door twee explantaat paren geeft Lfng pre-mRNA (zwarte hash lijn) in een explantaat opzichte Notch1 eiwit (rood) in de contralaterale explantaat (Embryo 1), alsmede Lfng pre-mRNA (zwarte doorgetrokken lijn) in een explantaat tegenover Dll1 eiwit (groen) in de contralaterale explantaat (Embryo 2). Gemeten signaalintensiteit (y-as) uitgezet tegen axiale positie (x-as; anterior PSM [A] naar rechts en achterste PSM [P] links). (H) Een kymograaf die de ruimtelijke verdeling van Dll1, Notch1 en Lfng (i) overtalrijke PSMs. Elke rij vertegenwoordigt de kymograaf de signaalintensiteit van een PSM explantaat. Rijen zijn gerangschikt in chronologische volgorde volgens de spatiotemporele verdeling van Lfng pre-mRNA (I) De spatiotemporele verdeling van Dll1, Notch1 en Lfng (i) via meerdere klok oscillaties wordt gesimuleerd door de periodieke uitbreiding van de in data (H) , aandacht voor de oscillerende aard van Dll1 en Notch1 uitdrukking dynamiek. (J) Gepulseerde Notch1 eiwitexpressie in de caudale PSM wordt benadrukt door vergroting van het gebied afgebakend in de virtuele kymograaf aangegeven in (I). Gewijzigd ten opzichte van Reference 12. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kwantificering van de Ruimte-tijd dynamieken van Dll1 en Notch1 Protein Expression. (A) Een voorbeeld intensiteit plot geeft axiale variatie in de intensiteit van het signaal over de PSM. Gegevens begrensd door twee explantaat paren geeft Lfng pre-mRNA (zwarte hash lijn) in een explantaat opzichte Notch1 eiwit (rood) in de contralaterale explantaat helft, en Lfng pre-mRNA (zwarte doorgetrokken lijn) in een half explantaat van een tweede staart in vergelijking met Dll1 eiwit (groen) in de contralaterale explantaat helft van de tweede staart. Gemeten intensiteit (y-as) uitgezet tegen axiale positie (x-as; rostrale [A] naar rechts en caudale [P] links). (BH) kymographs tonen de ruimtelijke verdeling van Notch1, Dll1, NiCd, en Lfng (i) over tal van PSMs. (B en C) NICD (B) en Dll1 (C) expressie van PSM secties; (D en E) Lfng (i) (D) en Dll1 (<strong> E) in contralaterale explantaat helften; (F en G) Lfng (i) (F) en Notch1 (G) in contralaterale explantaat helften. Van Reference 12. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Het huidige protocol beschrijft een gevoelige methode voor de kwantitatieve analyse van low-level eiwit expressie en oscillerende dynamiek presteren in E10.5 muis PSM explantaten. Een robuuste protocol voor zowel immunohistochemie en fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) wordt gevolgd door een hoge resolutie whole-mount confocale beeldvorming, en vervolgens door beeldanalyse en temporele segmentatie van kymographs een spatiotemporele kaart van eiwitexpressie over de PSM te genereren. Een hoog signaal-ruisverhouding in eiwit en mRNA detectie is essentieel voor het succes van deze techniek garanderen. Zorg moet worden genomen om grondig alle oplossingen effectieve uitwisseling tijdens de wasstappen en de temperatuur van de 65 ° C wassingen in de stadia van stap 3. Het is het meest voordelig om de tijd werkzame antilichamen en RNA probes tegen de bron nemen doelwitten van belang zijn en om deze reagentia te testengrondig op de hele-mount monsters vóór het begin van dit protocol.
Wijzigingen en problemen oplossen
De belangrijkste thema's die zich kunnen voordoen bij het uitvoeren van dit protocol voort uit slecht signaal detectie kracht en kwaliteit. Dit is grotendeels afhankelijk van de werkzaamheid van de antilichamen of RNA probes worden gebruikt voor immunohistochemie of FISH stappen in het protocol, respectievelijk. Een aantal verschillende stappen kan optimalisering vereisen voordat voldoende signaaldetectie bereikt. Een veel voorkomende oorzaak van een slechte signaal opsporing is onjuist fixatie; is het noodzakelijk dat hetzij vers PFA PFA of bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een week wordt gebruikt om de monsters vast. De duur van de fixatie kan ook optimalisatie vereisen, afhankelijk van het antilichaam of RNA probe gebruikt. Antilichamen, is het aangeraden om waar mogelijk de instructies van de fabrikant te volgen, terwijl het voor RNA-probes, adviseren wij de raadpleging van de gepubliceerde literatuur.
Lfng. Vanwege het relatieve gebrek aan overvloed, detectie van Lfng pre-mRNA vereist langere incubatie met de probe in hybridisatiemengsel bevattende 5x zout-natriumcitraat (SSC) voorgoed signaaldetectie. Dezelfde voorwaarden gelden voor andere sondes die zwak uitgedrukt mRNA te detecteren, maar in onze ervaring, kan de detectie van meer stabiel mRNA targets een kortere probe hybridisatie stap en lagere SSC concentraties in de hybridisatie mix (bijvoorbeeld 1.3x SSC) vereisen. Zowel immunohistochemie en FISH, moet het protocol eerst geoptimaliseerd hele embryo en de optimale concentratie aan antilichaam of probe moet empirisch worden bepaald.
Beperkingen van de Techniek
Zoals hierboven vermeld, het succes van deze techniek is sterk afhankelijk van de kwaliteit van het eiwit en mRNA detectie. we zijn verscheidene suggesties uiteengezet hoe eiwit en mRNA detectie kan worden verbeterd, maar in de afwezigheid van hoge kwaliteit fluorescent signaaldetectie, is er geen manier het experiment kan doorgaan. Het aantal targets die in elk weefselmonster kan worden geanalyseerd wordt beperkt door de spectrale resolutie van de confocale microscoop en door de epitopen van de gebruikte antilichamen. In deze studie, waren we in staat om maximaal drie epitopen eiwitdetectie naast een DNA vlek op elk monster 12. Dit protocol maakt alleen de detectie van een doelwit mRNA, hoewel de huidige alternatieve methoden kunnen worden toegepast om dit te verhogen tot maximaal drie doelen 14.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods
De hier beschreven methode biedt een gevoelige techniek om low-level eiwit schommelingen in de hele-mount PSM explantaten detecteren. De kwantificering van deze dynamiek ismogelijk door het uitvoeren van FISH voor een bekende klok gen in overeenkomstige contralaterale explantaten. Een bibliotheek van kymographs wordt gegenereerd dat meer dan een segmentering klokcyclus kan worden georganiseerd, aandacht voor de spatiotemporele dynamiek van een doelwit van belang meningsuiting binnen dit tijdsbestek. Een belangrijk verschil in deze techniek over anderen is het gebruik van computational automatisering tijdelijk bestellen grote datasets, waarbij de spatiotemporele dynamiek van nieuwe klok componenten expressie te analyseren op onpartijdige wijze toelaat. Bijvoorbeeld, deze techniek op voorwaarde inzicht in hoe Dll1 en Notch1 eiwitten en hun oscillaties zijn co-gereguleerde over het hele PSM. Alternatieve methoden in deze context ook ingeroepen immunokleuring, maar ze hadden niet de kleine fluctuaties in Dll1 en Notch1 eiwit niveaus in de caudale PSM dat evident waren met deze methode te detecteren. In plaats daarvan, meldde ze een constante helling van meningsuiting, dat is het sterkst in de rostrale regio 9
Toekomstige toepassingen of richtingen na Mastering the Technique
Zodra dit protocol is onder de knie, kan high-throughput expressie analyse worden uitgevoerd voor een eiwit van interesse in de PSM.PSM explantaten gegenereerd op basis van een aantal muizen nesten kunnen in één keer worden verwerkt om de hoge sample nummer voor de analyse te genereren. Hoewel we alleen gebruikt wildtype embryo's in deze studies, is het mogelijk om deze analyse met behulp van genetisch gemodificeerde embryo uitvoeren om het belang van een of meer factoren dynamiek eiwitexpressie beoordelen. Voorbij de PSM kan dit protocol worden aangepast aan andere systemen die bestaan uit twee helften contralaterale en kan worden gebruikt om gevoelig detecteren lage eiwitexpressie en oscillerende dynamiek. Een voorbeeld waarin dit protocol kan worden aangepast is de studie van dynamische eiwitexpressie in de muis neurale buis, aangezien contralaterale helften kunnen worden geproduceerd en gekweekt en Notch activiteit aangetoond huidige en belangrijk in patroon 15 te zijn. We moedigen andere groepen om dit protocol om andere systemen aan te passen en om feedback te geven voor toekomstige verbetering.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een MRC studententijd aan RAB, een MRC studententijd te CSLB en een WT projectsubsidie om JKD (WT089357MA). Het werk werd ook ondersteund door een Wellcome Trust Strategic award (097.945 / Z / 11 / Z). Wij danken Dr. E. Kremmer voor het soort geschenk van de Dll1 antilichaam en Dr. O. Pourquie voor de Lfng RNA probe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 11320033 | |
| GlutaMAX™-1 (100x) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 35050 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10270106 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140122 | |
| anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^ | BD Pharmingen | 552466 | |
| anti-rat polyclonal Dll1 antibody^* | N/A | N/A | |
| Lfng intronic anti-sense RNA probe^* | N/A | N/A | |
| 16% paraformaldehyde | Pierce (ThermoFischer Scientific) | PI28908 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche (Sigma-Aldrich) | 31158 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Made in house | N/A | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Normal goat serum (NGS) (heat-treated) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 16210072 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFischer Scientific | H3570 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Saline-sodium citrate (SSC) | Sigma-Aldrich | 93017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | |
| tRNA | Roche (Sigma-Aldrich) | 101095 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Made in house | N/A | |
| Blocking Buffer Reagent | Roche (Sigma-Aldrich) | 11096176001 | |
| anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody | Roche (Sigma-Aldrich) | 11207733910 | |
| Tyramide signal amplification (TSA) kit | Perkin Elmer | NEL744001KT | |
| *The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources. | |||
| ^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader. | |||
References
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139 (4), Cambridge, England. 625-639 (2012).
- Krol, A. J., Roellig, D., et al. Evolutionary plasticity of segmentation clock networks. Development. 138 (13), Cambridge, England. 2783-2792 (2011).
- Dequéant, M. -L., Ahnert, S., et al. Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock. PLoS ONE. 3 (8), 2856 (2008).
- Bailey, C., Dale, K. Somitogenesis in Vertebrate Development. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-15 (2015).
- Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. Somitogenesis. Development. 139 (14), Cambridge, England. 2453-2456 (2012).
- Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock. Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).
- Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites. PLoS Genetics. 5 (9), 1000662 (2009).
- Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock. eLife. 4, 05842 (2015).
- Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis. Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).
- Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis. Cell. 149 (2), 295-306 (2012).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nature communications. 3, 1141 (2012).
- Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM. Development. 141 (24), Cambridge, England. 4806-4816 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), 160 (2007).
- Denkers, N., García-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos. Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).
- Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo. Development. 142 (13), Cambridge, England. 2291-2303 (2015).
