Introduction
Somites הם הקטעים הראשונים נוצרו ציר הגוף מתארך בפיתוח בעלי חוליות והם המבשרים של עמוד השדרה, צלעות, ורקמות הדרמיס, כמו גם של שריר ותאי האנדותל. במהלך somitogenesis, somites אפיתל יוצרים מן mesoderm presomitic unsegmented (PSM) (הנסקרת ב Reference 1). תהליך זה מוסדר על ידי "שעון הפילוח," אשר מורכב מרשת של גנים וחלבונים תנודתית, בעיקר מקרבים את מסלול איתות Notch. שעון הפילוח מורכב לולאות משוב שליליות שונות, אשר מאפשרות ייצור pulsatile פעילות Notch בתוך תא בודד 2 (הנסקרת ב הפניות 3 - 6). בעוד השיטה של תנודת תאיים מאופיינת היטב, הוא עדיין ברובו לא ידוע כיצד תנודות אלה מתואמים על פני רקמת PSM. הוכח לאחרונה, באמצעות שני מחקרים ניסיוניים ותיאורטיים, כי תנודות אלה הם essential לתהליך somitogenesis וכי מסלול Notch ממלא תפקיד מכריע בתהליך של שני פילוח ביטוי גנים תנודתית 7, 8. עם זאת, זה כבר דווח בהרחבה כי Notch קולטן 1 (Notch1) ודלתא דמוי ליגנד (DLL) -1 יש הדרגתיים הסטטי PSM 9, 10, 11.
החוקרים שיערו כי תנודות תלויי Notch של השעון פילוח PSM תלוי הפעלה תקופתית של הקולטן ליגנד מסלול Notch הראשי, Notch1 ו Dll1, בהתאמה, על פני PSM העכבר. המסקנות של מחקרים קודמים שדיווחו על שיפוע מקורי, זנב סטטי של החלבונים האלה נבעו, אנו צופים, חוסר הרגישות בטכניקות immunostaining. הם ולכן לא יכלו לזהות תנודות ברמה הנמוכה של Dll1 ו Notch1 ב PSM הזנב.
אנחנו havדואר המציא שיטה יותר מקרוב הגורמים הללו, שילוב נתוני ניסוי עם מודלים מתמטיים כדי לחזות מנגנון שבאמצעותו התנודות של החלבונים של רכיבי שעון מתואמים ברחבי PSM 12.
המטרה הכללית של שיטה זו היא לזהות ולכמת ברמה נמוכה, ביטוי חלבון דינמי PSM ולמפות את פרופילי הביטוי של חלבונים בעלי עניין על פי הביטוי של הגן השעון הידוע, השוליים הסהרוריים (Lfng). מאז מחזור אחד של השעון פילוח בעובר העכבר לוקח 2 שעות כדי להשלים, דגימות שונות נדרשים לבנות פרופיל spatiotemporal ביטוי מוחלט חלבון Dll1 ו Notch1 במהלך תנודה אחת Lfng ב PSM. אנחנו ובכך פתחנו בפרוטוקול זה כדי לאפשר זיהוי תפוקה הגבוהה של ביטוי חלבון ברמה הנמוכה כל ההר, explants PSM הנגדי. עם זאת, הטכניקה הזו גם יכולה להיות שימושית עבור t מחקריםכובע שואף לאפיין דינמיקת חלבון ברמה הנמוכה בתוך כל רקמה עוברית כי ניתן לפצל לשני חצאים נגדיים.
Protocol
כל הניסויים בוצעו תחת מספר רישיון פרויקט 6004219 ב הקפדה על בעלי החיים (הליכים מדעיים) Act of 1986 קודי משרד הפנים בבריטניה עיסוק עבור השימוש בבעלי חי נהלים מדעיים.
1. PSM explant Dissection
- השג את רקמת הזנב מעוברים המיוצר על ידי הזדווגות מתוזמן של wild-type (CD1) עכברים 13. בקצרה, ביום עוברי (E) 10.5, להרדים את העכבר התורם בהריון בתא פחמן דו חמצני. קציר קרן הרחם ולמקם אותו לתוך שנאגר מלוח פוספט סטרילית 1x פתרון (PBS) בהתאם לנהלי רישיון של משרד פנים או חוקים מקומיים מקבילים. מעבירים את קרן הרחם כדי בצלחת בתרבית רקמה המכילה PBS טרי, סטרילי. ביצוע כל הצעדים לנתיחה שלאחר מכן בתמיסה זו.
- תחת סטראו, לחתוך את קרום שהרירי העבה של קרן הרחם באמצעות מספריים מעוקלים ולחלץ כל עובר באמצעות מלקחיים בסדר בזהירות. שמור על עצמךעל מנת להבטיח כי רקמת הזנב אינה פגומה בתהליך זה. בעזרת מספריים מעוקלים מלקחיים בסדר, לנתח משם את השק השפיר מעובר אחד, נזהר שלא לפגוע בעובר.
- השתמש באחת מחט כירורגית או מספריים מעוקלים למסוק רקמת הזנב של כל עובר על ידי חיתוך האחורי העובר ניצני האיבר האחוריים.
- לאזן את מטה הגחון בצד רקמות הזנב הן באמצעות מלקחיים מחט. צור זוגות explants PSM מכל זנב עוברי באמצעות פירוק רקמת הזנב לשני חצאים לאורך קו האמצע; לבצע תנועת נדנדה עדינה עם מחט. ודא כי הצינור, notochord עצביים, ורקמות PSM מתחלקים שווה בשווה בין שני explants.
- פיפטה כל explant PSM הנגדי על החלק התחתון של מכסה צלחת פלסטיק תרבות 35 מ"מ בנפח קטן של טרום התחמם (37 ° C) בינוני תרבות (DMEM-F12 + 0.1% בתוספת תחליף L- גלוטמין עם 10% נסיוב עגל עוברית , 10 bFGF האדם ננומטר, ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין). <li> מניח את הצלחת על החלק העליון של המכסה ובמהירות להפוך אותו כך רקמות PSM מושעה מהמכסה ב "טיפה תלויה" של מדיום. התרבות explants PSM בתא humidified ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 - 2 h.
- זוגות העברת explants PSM אל הבארות הבודדות של צלחת בתרבית רקמת 24 גם. מדגירים את paraformaldehyde 4% ב PBS במשך 1 שעות בטמפרטורת החדר (RT) או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (O / N). זהירות: Paraformaldehyde רעיל, ואת אמצעי בטיחות מתאימים חייב להילקח כשעובדים עם הפתרון הזה.
הערה: בצע את כל השלבים כביסה הדגירה לאחר מכן בצלחת בתרבית רקמה 24 גם. - לשטוף בארות מדגם PBS ב RT על פלטפורמת נדנדה, בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק בסדר להחליף פתרון PBS על הדגימות עבור PBS 3 טרי - 4 פעמים. לעבד explant אחד PSM מכל זוג באמצעות אימונוהיסטוכימיה (שלב 2) ואת הניאון באמצעות אחרים הכלאה באתרו עבור גן שעון ידוע (stEP 3).
2. אימונוהיסטוכימיה של PSM Explants
- לשטוף explant PSM אחד מכל זוג עוברי שנוצר בשלב 1 ב 2% טריטון X-100 ב PBS עבור 1 ש 'ב RT על פלטפורמת נדנדה, ולאחר מכן לשטוף דגימות בקצרה PBS. החזר את PBS על דגימות עם פתרון חסימה (אלבומין 2% שור (BSA) ו -10% בסרום עז נורמלי (NGS) ב- PBS + 0.1% Tween-20) ו דגירה O / N ב 4 ° C על פלטפורמת נדנדה.
הערה: כל השטיפות הבאות וצעדי דגירה בסעיף זה חייבות להתבצע ב RT על פלטפורמת נדנדה, אלא אם כן צוינו אחר. פתרונות לשטוף ניתן לשנות בקלות בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק או זכוכית קנס שקצהו. - לדלל את נוגדני נוגדנים / העיקריים הרצויים במאגר עובד (0.1% BSA, 0.3% NGS, ו -0.2% Triton X-100 ב PBS). בדוגמא זו, לדלל את נוגדני Dll1 ו Notch1 01:25 בעבודת חיץ.
הערה: אופטימיזציה יידרש לקבוע את הגורם לדילול המתאים הנדרש תיים שלב אם משמשים נוגדנים חלופיים. - דגירה explants בפתרון נוגדן עבור 3 - 5 ימים ב 4 ° C על פלטפורמת נדנדה. הקפד לכלול כמה דוגמאות עם עובד מאגר המכיל אין נוגדן ראשוני לשמש שולטת נוגדנים משני.
- שחזור פתרון הנוגדן הראשוני בתוך שפופרת אחסון 1.5 מיליליטר בעזרת פיפטה ולאחסן אותו ב 4 ° C.
הערה: ששוחזר נוגדן ראשוני ניתן להשתמש מספר פעמים, תלוי הנוגדן משמש. - בצע 2 שוטף של דגימות עבור 5 - 10 דקות כל אחד ב PBS, ואחריו 3 שוטף במשך 10 דקות כל אחד ב 2% טריטון X-100 ב PBS ב RT על פלטפורמת נדנדה.
- לדלל שכותרתו fluorescently משני נוגדן / נוגדנים (epitope בהתאמה אל הנוגדן הראשוני / נוגדנים בשימוש) בעבודת חיץ. בנוסף, אפשר להוסיף 20 מיקרוגרם / מ"ל Hoechst 33,342 כדי פתרון זה counterstain את הגרעינים.
הערה: אופטימיזציה ייתכן שתידרש כדי לקבוע את הגורם לדילול המתאים הנדרשים בשלב זה. בדואר זהxample, גורם דילול של 1: 400 בדרך כלל היה בשימוש. - צנטריפוגה הפתרון נוגדנים משני למשך 10 דקות ב 16 XG כדי למנוע היווצרות של אגרגטים נוגדן. הוסף 250 - 500 μL של פתרון נוגדנים משני מדגם זה היטב, נזהר שלא להשתמש מיקרוליטר האחרון של הפתרון, אשר עשוי להכיל אגרגטים נוגדן.
- מכסה את צלחת המדגם ברדיד אלומיניום כדי למזער את חשיפת אור דגירת דגימות פתרון הנוגדנים משני עבור 3 - 5 ימים ב 4 ° C בחושך.
- לפני לדגום הרכבה, לשטוף את דגימות פעמיים במשך 10 דקות כל אחד 0.1% Tween-20 ב PBS (PBST) ופעם במשך 5 דקות ב PBS ב RT על פלטפורמת נדנדה (ראה שלב 4).
3. פלורסנט הכלאה באתרו (FISH) של PSM Explants
- אם מאוחסן כלי חלופי, להעביר את explants PSM הנגדי הנותרים על בארות בודדים של צלחת בתרבית רקמה 24 גם.
- שטוף את הדגימות עבור10 דקות באתנול 50% ב PBST, ולאחר מכן לבצע 2 שטיפות במשך 10 דקות כל אחד ב 100% אתנול על פלטפורמת נדנדה ב RT כדי לייבש את הרקמה.
הערה: כל השטיפות הבאות וצעדי דגירה בסעיף זה חייבות להתבצע ב RT על פלטפורמת נדנדה, אלא אם כן צוינו אחר. - רעננותם הרקמה ידי שטיפה במשך 10 דקות באתנול 50% ב PBST, ואחריו כביסה פעמיים במשך 5 דקות כל אחד ב PBST.
הערה: שלבי 3.2 ו -3.3 צעדי קיבעון נדרשים עבור פרוטוקול זה ולא ניתן להשמיט. - דגירה דגימות עם K proteinase 10 מיקרוגרם / מ"ל ב Tween-20 0.1% ב PBS (PBST) במשך 5 דקות ללא תסיסה. להסיר במהירות את proteinase K ולשטוף את דגימות בקצרה עם PBST לפני שלאחר תיקון הרקמה למשך 30 דקות ב glutaraldehyde 4% פורמלין + 0.1% ב PBST. זהירות: שניהם פורמאלדהיד glutaraldehyde הם רעילים, אמצעי בטיחות מתאים יש לנקוט בעת עבודה עם פתרונות אלה.
ההערה: הכביסה הבאהצעדי דגירה מעורבים 50% ו -100 תערובות הכלאת% (שלבי 3.6 - 3.9) צריכים להתבצע ללא תסיסה. - לאחר שטיפת דגימות פעמיים במשך 10 דקות כל אחד ב PBST, לשטוף את דגימות פעם לערבב הכלאה 50% (מתאים בדיקות רצפי האינטרונים: לפוראמיד 50%, 5x ציטראט מלוחים-נתרן (SSC), 5 מ"מ EDTA, 50 מיקרוגרם / מ"ל tRNA, 0.2% Tween-20, 0.1% SDS, ו -100 מיקרוגרם / מ"ל הפרין) ב PBST מוכן ב RT. דגירת הדגימות בפתרון זה למשך 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס ללא תסיסה.
- שוטפים את דגימות פעמיים עם מחומם מראש (65 ° C) לערבב הכלאה לפני דוגרים דגימות בתמהיל הכלאה עבור ≥ 2 שעות (עד 48 שעות) בשעה 65 ° C (פעמים הדגירה כבר לשפר את האות לרעש בניגוד וכתוצאה מכך) . הסר את תערובת הכלאה מהשלב הקודם, ולהחליף אותו עם 0.25 - 0.5 מ"ל של טרום התחמם (65 ° C) לערבב הכלאה המכיל digoxigenin (DIG) -labeled בדיקה RNA אנטי תחושה נגד רכיב השעון פילוח ידוע.
לֹאE: לדוגמה, השוליים הסהרוריים רצפי האינטרונים (Lfng (i)) בדיקה שימש בריכוז של 20 μL / מ"ל לזהות Lfng mRNA המתהווה. הדילול בשימוש בשלב זה בדיקה תלויה ידרוש אופטימיזציה. - חותם את הצלחת באמצעות סרט דביק על מנת למנוע אידוי דגירת דגימות פתרון הבדיקה לשני לילות על 65 מעלות צלזיוס.
- בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק קנס שקצהו, לשחזר את החללית לשימוש חוזר ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס. שוטפים את דגימות פעמיים עם מחומם מראש (65 ° C) תמהיל שלאחר הכלאה (לפוראמיד 50%, 0.2% Tween-20, ו 1x SSC) לפני הכביסה דגימות עוד פעמיים במשך 20 דקות כל אחד ב 65 מעלות צלזיוס מראש חמם לערבב כלאה-פוסט.
- שטפו את דגימות במשך 15 דקות ב 65 מעלות צלזיוס לערבב הכלאה מראש חימם 50% ב Tween-20 0.1% תמיסת מלח טריס שנאגרו (TBST). שוטפים את דגימות פעמיים עם TBST לפני הכביסה למשך 30 דקות ב RT ב TBST על פלטפורמת נדנדה.
- טרום דגירה explants ב bloפתרון cking (TBST + 2% חסימת מגיב חיץ (תב"מ) + 20% נסיוב עז-טיפול בחום) למשך תקופה מינימלית של 2 שעות. חלף פתרון זה עם פתרון חסימה טרי המכיל דילול 1: 200 של peroxidase חזרת (HRP), מצומדות נוגדן אנטי digoxigenin. דגירה דגימות O / N ב 4 ° C.
- לאחר דגירת הנוגדנים, יש לשטוף את הדגימות 3 פעמים עם TBST ב RT ולהעבירם בארות בודדות של צלחת בתרבית רקמה חדשה 24 גם. שטפו את explants עם TBST 3 פעמים במשך שעה 1 כל אחד.
- בשלב זה, להעביר את הדגימות לתוך צינורות אחסון 0.5 מיליליטר או הבארות הבודדות של צלחת בתרבית רקמת 48-גם כדי להפחית את הנפח הנדרש של הגברת אות Tyramide ריאגנטים זיהוי (TSA) בשלבים הבאים.
- דגירת דגימות במאגר הגברת TSA (ראה רשימת החומרים הכימיות) ב RT עבור 1 דקות ללא שימוש תסיסת נפח קטן ככל האפשר, על מנת להבטיח כי הדגימות שקועות לגמרי הפתרון.
- הוסף מגיב TSA (ראהרשימה ריאגנטים) למאגר הגברת המדגם ב דילול של 1:50. במהירות לערבב את הפתרון עד מגיב TSA מופץ באופן שווה, לכסות את הצלחת או צינורות בנייר אלומיניום, דגירה דגימות במשך 60 - 90 דקות בחושך.
- הסר את פתרון הגברת TSA ולשטוף את דגימות TBST 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד. מעבירים את explants חזרה לצלחת בתרבית רקמה 24 גם כדי להגביר את עוצמת הקול לשטוף דגירה דגימות מי חמצן 1% ב TBST במשך 1 שעה. שטוף את הדגימות עם TBST 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם PBST לפני לדגום הרכבה (ראה שלב 4).
לדוגמא הכנת 4. הדמיה
- כן שקופית זכוכית הדבקה אחד מחויבת עבור כל זוג explant ידי הוספת מפרידי הדמיה עבה 0.12 מ"מ, אשר מונעים את הדגימות להימחץ על ידי התוספת של coverslip. הסר את האונייה הדבקה ממשטח אחד של spacer ומניח אותו בצד דבק למטה על גבי זכוכית נושאת, לחיצת firmly לאטום את spacer לשקופית.
הערה: לקבלת השלבים הנותרים, להשתדל לשמור על דגימות באור נמוך או בחושך כדי למנוע photobleaching. זוגות explant פיפטה לשקופית מוכנה בעזרת פיפטה פסטר זכוכית בתוך במרכז spacer, להבטיח כי הצד הגזור של explant פונה שקופית. מסדרי זוגות נגדיים של צד explants זה לצד זה. - להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר משקופית בעזרת פיפטה זכוכית פסטר פתיל את כל לחות שיורית סביב הדגימות באמצעות פיסת נייר טישו נמוך מוך מקופל.
- אפשר הדגימות לדבוק לשקופית עבור 45 - 60 s, עד הרקמה מתחילה להופיע דביק שקוף. במהלך תקופה זו, הסר את האונייה הדבקה הנותרים מן spacer באמצעות מלקחיים. אל תאפשרו דגימות להתייבש.
- הוסף טיפה גדול של mountant כפול פונקציה פתרון סליקה (0.5% p-phenylenediamine ו -20 מ"מ טריס, pH 8.8, גליצרול 90%) על דגימות בתוך מרכזשל spacer. הערה: פתרון זה הופך חום / שחור כאשר מותר לחמצן.
- בזהירות במקום coverslip עגול (לא. 1.5) ברחבי דגימות, על מנת להבטיח כי mountant מופץ באופן שווה וכי כל הקצוות של coverslip ליצור קשר עם spacer. מניח את השקף-החליק כיסוי במהופך על נייר אריזה דק נמוך מוך.
- מהדקים היטב על מנת להבטיח כי coverslip שומרת באופן מלא spacer ושכל mountant עודף מוסר. חזור על הפעולה עד אין כתמים mountant יותר בעיתון.
- נקי לתייג את השקופית (ים) כראוי, ולאחסן אותם בחושך עד הדמיה, לטווח קצר ב -20 ° C או לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת השקופיות מאחסון, ולאפשר להם להפשיר לחלוטין לפני ההדמיה.
- תמונת הדגימות הרכובות באמצעות מיקרוסקופ confocal עם רכישת אריחי מטרה בהגדלה גבוהה. תמונה זוגות explant באמצעות טבילה אובייקטיבי שמן 40X ב 4 מיקרומטר z-במרווחים באמצעות 488 ננומטר, 568 ננומטר ו 647 ננומטר לייזר liנס כדי להלהיב את ירוק, אדום, ומרחיקות אדום fluorophores, בהתאמה, מועסקים לחלבון וזיהוי mRNA במחקר זה 12.
הערה: תמונות רעפים נתפרו שלאחר הרכישה כדי ליצור תמונה אחת לניתוח.
ניתוח תמונה 5. שלאחר הרכישה
- השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי להגדיר אזור של אינטרס בתוך PSM של כל מדגם הניסיון.
- כדי לכמת רמות ביטוי, רקע לחסר ותמונות סף לרמה של מדגם שליטה לא-יסודי לפני כימות שלאחר מכן. להגדיר מוצא, ציר, ואת יחידת אורך עבור כל דגימה.
- חשב את עוצמת הקרינה כפונקציה של מיקום לאורך ציר rostro- זנב המנורמל עבור כל אחת מדגימות M 12. לאחר נרמול מגרשים בעוצמה, למקם את הצד פרופילים עוצמת ידי צד לקבל f מטריקס עוצמת (i, j) המתאר את עוצמת בבית i
6. סידור זמני של דוגמאות
- כדי להסיק סידור זמני של רכיב שעון ידוע, להגדיר מטריצת עוצמתו. לאחר מכן, לארגן מחדש את העמודות של המטריצה העוצמת כדי להשיג דפוס תקופתי במסגרת זמן נתונה. כדי לעשות זאת, להגדיר את הפונקציה
כאשר A (ו j; k) מייצג את פונקצית autocorrelation של j ה עמודה של F ו A T היא פונקצית autocorrelation היעד, נבחרה כדי לאכוף את המחזוריות הזמנית של הדפוס, שניתן על ידי
- השתמש מטרופוליס-הייסטינגס (או אחר אלגוריתם מזעור) 12 לזהות את סדר הדגימות למזער את g הפונקציה. לכן, לקבוע את הסדרM דגימות הממקסם את המחזוריות הזמנית של רכיב שעון ידוע.
- באמצעות הסידור הזמני המוסק של דגימות M, לבנות רשם גלי הורה עבור דפוס הביטוי של ערוץ שותף 12.
Representative Results
פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של פרופיל spatiotemporal של חלבון של עניין לצד שעתוק גני שעון העכבר PSM 12. לדוגמא, Dll1 (איור 1A-C) Notch1 (איור 1D-F) ביטוי חלבון מוצגים להתנדנד מתוך בתיאום עם השעתוק המתהווה של גן שעון פילוח Notch מוסדר Lfng. כימות Dll1, Notch1, ו Lfng (i) עוצמת אות ביחס אנטרו-אחורי (AP) הציר של PSM (איור 1G) מגלה דינמיקת ביטוי תנודתית ברורה עבור מטרות אלה (איור 1H-J). פרופיל spatiotemporal ביטוי חלבון Dll1 ו Notch1 לאורך כל מחזור השעון הם דמיינו בבירור לכמת באמצעות פרוטוקול זה באמצעות ניתוח תמונה שלאחר הרכישה של נתוני תמונת רקמה קבועים ברזולוציה גבוהה.
together.within-page = "1"> 
איור 1: במרחב ובזמן ויזואליזציה וכימות של Dll1 דינמיקה ביטוי חלבון Notch1. (AF) זוגות של explants משש E10.5 עוברי (AF) מראה את הפריסה המרחבית של חלבון Dll1 (AC) או חלבון Notch1 (DF) במחצית אחת לצד זיהוי של Lfng מראש mRNA (Lfng (i)) ב מקביל חצי נגדי של כל זוג. לוחות מסודרים לפי שלב 1 (A ו- D), שלב 2 (B ו- E), ואת שלב 3 (C ו- F) של מחזור שעון פילוח, כפי שנקבעו על ידי הפרופיל המרחבי של Lfng (i) ביטוי. היקף תחומי ביטוי Dll1 (ירוק), Notch1 (אדום), ו Lfng (i) (אפור) לאורך ציר אנטרו-האחורי של PSM יש בeen שמתווה ברים בצבעים. הקווים המקווקווים מסמנים את עמדותיהם של somite נוצר ולאחרונה (הים), את הקצוות החיצוניים של PSM, ואת הרקמה העצבית הסמוכה (C ו- E). ברים סולם (בפינה השמאלית התחתונה של כל לוח, AF) מייצגים 100 מיקרומטר. (ז) עלילה בעצמה לדוגמא המתארת את הווריאציה הצירית בעוצמת אות ברחבי PSM. הנתונים זממו משני זוגות explant מראה Lfng מראש mRNA (קו מקוצר שחור) ב explant אחד לעומת חלבון Notch1 (אדום) ב explant הנגדי (עובריים 1), וכן Lfng מראש mRNA (קו מוצק שחור) אחר explant לעומת חלבון Dll1 (ירוק) explant הנגדי (העובר 2). עוצמת אות נמדדת (ציר y) זממה נגד עמדה צירית (ציר x; קדמי PSM [א] אל PSM ימין האחורי [טז] שמאלה). (H) רשם גלים מראה את הפריסה המרחבית של Dll1, Notch1, ו Lfng (i) על פניPSMs רב. כל שורה של רשם הגלים מייצגת את עוצמת האות של explant PSM פרט. שורות מסודרות ברצף זמני על פי התפלגות spatiotemporal של Lfng מראש mRNA (I) חלוקת spatiotemporal של Dll1, Notch1, ו Lfng (i) באמצעות תנודות שעון מרובות הוא מדומה על ידי הרחבה התקופתית של הנתונים המוצגים (H) , המדגיש את אופיו תנודתית של דינמיקת ביטוי Dll1 ו Notch1. (J) pulsatile Notch1 חלבון ביטוי זנב PSM מודגש על ידי גדלה של אזור התחום רשם גלים הווירטואליים שמוצגים (I). שונה מן ההפניה 12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: כימות של Dynamics במרחב ובזמן של ביטוי חלבון Dll1 ו Notch1. (א) עלילה בעצמה למשל מתארת וריאציה צירית בעוצמת אות ברחבי PSM. נתונים זממו משני זוגות explant מראה Lfng מראש mRNA (קו מקוצר שחור) ב explant אחד לעומת חלבון Notch1 (אדום) במחצית explant הנגדי, כמו גם Lfng מראש mRNA (קו מוצק שחור) בתוך explant וחצי מתוך זנב שני לעומת חלבון Dll1 (ירוק) במחצית explant הנגדית של הזנב השני. עוצמות נמדדות (ציר y) הם זממו נגד עמדה צירית (ציר x; מקורי [א] ימינה זנב [טז] שמאלה). (BH) Kymographs להראות את הפריסה המרחבית של Notch1, Dll1, NiCd, ו Lfng (i) על פני PSMs רבים. (B ו- C) NiCd (ב ') Dll1 (C) ביטוי בסעיפים PSM; (D ו- E) Lfng (i) (ד) ו Dll1 (<strong> E) חצי explant נגדיים; (F ו- G) Lfng (i) (F) Notch1 (G) לחצאים explant הנגדי. מהתייחסות 12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה רגישה לבצע ניתוח כמותי של דינמיקת ביטוי חלבון ברמה הנמוכה תנודתית ב explants E10.5 עכבר PSM. פרוטוקול חזק עבור שני אימונוהיסטוכימיה ניאון הכלאה באתרו (FISH) ואחריו ברזולוציה גבוהה כל הר הדמית confocal, ולאחר מכן על ידי ניתוח תמונה ופילוח זמני של kymographs ליצור מפת spatiotemporal של ביטוי חלבון פני PSM. יחס אות לרעש גבוה זיהוי חלבוני mRNA הוא חיוני כדי להבטיח את הצלחת של טכניקה זו. יש להקפיד להחליף את כל הפתרונים ביסודיות וביעילות במהלך השלבים לשטוף וכדי לשמור על הטמפרטורה של 65 מעלות שוטף C בשלבים הרלוונטיים של שלב 3. זה כדאי ביותר לקחת את הזמן למקור נוגדנים יעילים ו בדיקות RNA נגד מטרות של עניין ועל מנת לבדוק ריאגנטים אלה ביסודיות על דגימות כל הר לפני תחילת בפרוטוקול זה.
שינויים ופתרון בעיות
בין הנושאים העיקריים שעשויים להיות נתקל בעת ביצוע בפרוטוקול זה להתעורר מחיל ואיכות זיהוי אות עניים. זו תלויה במידה רבה על היעילות של נוגדנים או בדיקות RNA המשמש את הצעדים אימונוהיסטוכימיה או FISH בפרוטוקול, בהתאמה. מספר צעדים שונים עשויים לדרוש אופטימיזציה לפני מושגת זיהוי קליטה מתאימה. אחת סיבות נפוצות לגילוי אות מסכן היא קיבעון פסול; זוהי חובתו או PFA או PFA הטריים מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע משמש כדי לתקן את הדגימות. אורכו של קיבעון יכול גם לדרוש אופטימיזציה, תלוי חללית הנוגדן או RNA בשימוש. עבור נוגדנים, מומלץ לעקוב אחר ההוראות של היצרן במידת האפשר, ואילו עבור בדיקות RNA, אנו מייעצים התייעצות של הספרות שפורסם.
s = "jove_content"> במחקר זה, השתמשנו בדיקה רנ"א במיוחד מזהה את הרנ"א הראשוני של גן השעון Lfng. בשל חוסר השפע היחסי, זיהוי של mRNA טרום Lfng מצריך תקופה ארוכה של דגירה עם החללית בתמהיל כלאה המכיל ציטראט מלוח-נתרן 5x (SSC) לגילוי אות טוב. אותם התנאים עשויים לחול על בדיקות אחרות מאתרות mRNAs הביע בחולשה, אבל מניסיוננו, זיהוי של מטרות mRNA יציבות יותר עשוי לדרוש צעד הכלאת בדיקה קצר יותר וריכוזי SSC נמוכים בתמהיל ההכלאה (למשל, SSC 1.3x). עבור שתי אימונוהיסטוכימיה ודגים, הפרוטוקול חייב להיות מותאם ראשון על עובר כולו, ואת הריכוז האופטימלי של נוגדנים או בדיקה צריך להיקבע באופן אמפירי.
מגבלות של הטכניקה
כאמור, ההצלחה של טכניקה זו תלויה במידה רבה על איכות החלבון וזיהוי mRNA. Wדואר התווה כמה הצעות איך חלבון וזיהוי mRNA ניתן לשפר, אבל בהיעדר זיהוי אות ניאון באיכות גבוהה, אין דרך הניסוי יכול להמשיך. מספר מטרות חלבון כי ניתן לנתח בכל דגימת רקמה הוא מוגבל על ידי הרזולוציה ספקטרלית של המיקרוסקופ confocal ועל ידי אפיטופים של הנוגדנים בשימוש. במחקר זה, הצלחנו להשתמש עד שלושה אפיטופים לגילוי חלבון לצד כתם DNA על כל דגימה 12. פרוטוקול זה רק מאפשר זיהוי של יעד אחד mRNA, למרות שיטות חלופיות נוכחיות יכולות להיות מועסקות על מנת להגדיל את זה ל עד שלוש מטרות 14.
משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
השיטה המתוארת כאן מספקת טכניקה רגישה לזהות תנודות חלבון ברמה נמוכה כל הר explants PSM. כימות של דינמיקה אלה היאניתן על ידי ביצוע FISH עבור גן שעון ידוע מקביל explants הנגדי. ספריה של kymographs נוצרת כי ניתן לארגן על מחזור שעון פילוח אחד, המדגיש את הדינמיקה ביטוי spatiotemporal של יעד של עניין בתוך מסגרת זמן זו. הבדל מפתח בטכניקה זו על פני אחרים הוא עושה שימוש רב באוטומציה חישובית להורות ערכות נתונים גדולות ובזמן, המתירה את דינמיקת ביטוי spatiotemporal של רכיבי שעון רומן להיות מנותחת משוא פנים. לדוגמה, טכניקה זו סיפק תובנות לגבי האופן שבו חלבונים Dll1 ו Notch1 תנודות שלהם הם שיתוף מוסדר ברחבי PSM כולו. שיטות חלופיות בהקשר זה גם יש לסמוך על immunostaining, אבל הם לא לזהות את תנודות קטנות ברמות חלבון Dll1 ו Notch1 ב PSM הזנב כי ניכרו באמצעות שיטה זו. במקום זאת, הם דיווחו על שיפוע יציב של ביטוי כי הוא חזק ביותר באזור המקורי 9
יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג הטכניקה
לאחר פרוטוקול זה כבר שולט, ניתוח ביטוי תפוקה גבוהה יכול להתבצע עבור כל חלבון של עניין PSM.explants PSM המופק המלטות עכבר כמה יכול להיות מעובד בו זמנית כדי ליצור את מספר הדגימה הגבוהה הדרושים לניתוח. למרות שאנו רק השתמשנו עוברות wild-type במחקרים אלה, ניתן לבצע ניתוח זה באמצעות עוברים מהונדסים גנטי על מנת להעריך את החשיבות של גורמים אחד או יותר על דינמיקת ביטוי חלבון. מעבר PSM, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למערכות אחרות שבן מורכבים משני חצי נגדיים ויכול לשמש כדי לזהות ברגישות דינמיקת ביטוי חלבון ברמה הנמוכה תנודתית. אחת הדוגמאות עבורו פרוטוקול זה יכול להיות מותאם היא חקר ביטוי חלבון דינמי בצינור העצבי העכבר, מאז חצאים הנגדי יכול להיווצר ותרבותי, ופעילות Notch הוכח להיות גם בהווה חשוב patterning 15. אנו מעודדים קבוצות אחרות כדי להתאים את הפרוטוקול למערכות אחרות וכדי לספק משוב לשיפור בעתיד.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מלגת הלימודים MRC כדי RAB, גידול מלגת הלימודים MRC כדי CSLB, ומענק פרויקט WT כדי JKD (WT089357MA). העבודה נתמכה גם על ידי פרס אסטרטגי Trust ברוך (097,945 / Z / 11 / Z). אנו מודים לד"ר א Kremmer על מתנת סוג של נוגדן Dll1 וד"ר O. Pourquie עבור בדיקת RNA Lfng.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 11320033 | |
| GlutaMAX™-1 (100x) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 35050 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10270106 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140122 | |
| anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^ | BD Pharmingen | 552466 | |
| anti-rat polyclonal Dll1 antibody^* | N/A | N/A | |
| Lfng intronic anti-sense RNA probe^* | N/A | N/A | |
| 16% paraformaldehyde | Pierce (ThermoFischer Scientific) | PI28908 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche (Sigma-Aldrich) | 31158 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Made in house | N/A | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Normal goat serum (NGS) (heat-treated) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 16210072 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFischer Scientific | H3570 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Saline-sodium citrate (SSC) | Sigma-Aldrich | 93017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | |
| tRNA | Roche (Sigma-Aldrich) | 101095 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Made in house | N/A | |
| Blocking Buffer Reagent | Roche (Sigma-Aldrich) | 11096176001 | |
| anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody | Roche (Sigma-Aldrich) | 11207733910 | |
| Tyramide signal amplification (TSA) kit | Perkin Elmer | NEL744001KT | |
| *The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources. | |||
| ^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader. | |||
References
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139 (4), Cambridge, England. 625-639 (2012).
- Krol, A. J., Roellig, D., et al. Evolutionary plasticity of segmentation clock networks. Development. 138 (13), Cambridge, England. 2783-2792 (2011).
- Dequéant, M. -L., Ahnert, S., et al. Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock. PLoS ONE. 3 (8), 2856 (2008).
- Bailey, C., Dale, K. Somitogenesis in Vertebrate Development. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-15 (2015).
- Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. Somitogenesis. Development. 139 (14), Cambridge, England. 2453-2456 (2012).
- Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock. Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).
- Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites. PLoS Genetics. 5 (9), 1000662 (2009).
- Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock. eLife. 4, 05842 (2015).
- Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis. Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).
- Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis. Cell. 149 (2), 295-306 (2012).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nature communications. 3, 1141 (2012).
- Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM. Development. 141 (24), Cambridge, England. 4806-4816 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), 160 (2007).
- Denkers, N., García-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos. Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).
- Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo. Development. 142 (13), Cambridge, England. 2291-2303 (2015).
