Introduction
Сомиты первые сегменты, образованные в удлинении оси тела в развивающихся видов позвоночных и являются предшественниками позвоночника, ребер, и ткани дермы, а также мышц и эндотелиальных клеток. Во время сомитогенеза, эпителиальные сомиты образуются из несегментированной пресомитной мезодерме (PSM) (обзор в ссылке 1). Этот процесс регулируется «Дробление часов», состоящую из сети колебательные генов и белков, в основном, принадлежащие к сигнальной Паз пути. Сегментация часов состоит из различных негативных петель обратной связи, которые позволяют производить пульсирующую активности Notch в пределах одной ячейки 2 (обзор в ссылках 3 - 6). В то время как внутриклеточный метод колебаний хорошо характеризуется, она до сих пор в значительной степени неизвестно, каким образом эти колебания координируются через ПСМ ткани. Недавно было показано, с помощью экспериментальных и теоретических исследований, что эти колебания являются эссенциял в процессе сомитогенезе и что пути Notch играет решающую роль в процессе сегментации как и колебательный экспрессии гена 7, 8. Тем не менее, он был широко сообщалось , что рецептор Notch 1 (Notch1) и дельта-подобный лиганд (Dll) -1 имеют статические градиенты в PSM 9, 10, 11.
Мы предположили, что Notch-зависимые колебания сегментации ПСМ часов зависят от периодической активации основного рецептора затрагивающего пути Notch и лиганда, Notch1 и Dll1, соответственно, через ПСМ мыши. Выводы предыдущих исследований, которые сообщили статический ростральной-каудальном градиент этих белков были обусловлены, мы предсказываем, к отсутствию чувствительности в технике иммуноокрашивания. Поэтому они не в состоянии обнаружить колебания низкого уровня Dll1 и Notch1 в хвостовом PSM.
Мы ВГАе разработал метод более тщательно изучить эти факторы, сочетая экспериментальные данные с математическим моделированием для прогнозирования механизм , посредством которого колебания белков тактовых компонентов координируются через PSM 12.
Общая цель этого метода заключается в выявлении и количественной оценки низкого уровня, динамическую экспрессию белка в PSM и сопоставить профили экспрессии белков , представляющих интерес , по выражению известного гена часов, Lunatic Fringe (Lfng). Поскольку один цикл сегментации часов у эмбрионов мышей занимает 2 часа , чтобы закончить, различные образцы необходимы для построения полного пространственно - временной профиль экспрессии белка Dll1 и Notch1 в течение одного Lfng колебаний в PSM. Таким образом, мы разработали этот протокол, чтобы для обнаружения с высокой пропускной способностью экспрессии белка низкого уровня в целом монтажа, контрлатеральных эксплантов PSM. Тем не менее, этот метод также может быть полезным для исследований тшлем целью охарактеризовать динамику белка низкого уровня в любой эмбриональной ткани, которые можно разделить на контралатеральной половины.
Protocol
Все эксперименты проводились в рамках проекта лицензии № 6004219 в строгом соответствии с животными (научные процедуры) Закона 1986 года и коды Великобритании Home Office, Практическое руководство по использованию животных в научных процедур.
1. PSM эксплантата Вскрытие
- Получить хвост ткани из эмбрионов , полученных в заданное время спаривания дикого типа (CD1) мышей 13. Если коротко, то на эмбриональный день (E) 10,5, усыпить беременной мыши доноров в камере диоксида углерода. Урожай рог матки и поместить его в раствор стерильно 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) в соответствии с процедурами лицензирования Министерства внутренних дел или эквивалентных местных правил. Передача рога матки к культуре блюдо ткани, содержащей свежие, стерильные PBS. Выполнить все последующие шаги рассечение в этом растворе.
- Под стереомикроскопа, перерезать толстую мышечную оболочку рога матки с помощью изогнутых ножниц и извлечения каждого эмбриона тщательно с использованием тонких щипцов. Береги себячтобы гарантировать, что хвостовой ткани не повреждается в этом процессе. Используя изогнутые ножницы и тонких щипцов, отсечь амниотической мешок из каждого эмбриона, следя за тем, чтобы не повредить зародыш.
- Используйте либо хирургические иглы или изогнутые ножницы, чтобы собрать хвост ткани каждого эмбриона путем разрезания эмбриона кзади задних зачатки конечностей.
- Баланс хвоста ткани вентральной стороной вниз с использованием как пинцет и иглу. Генерация пары PSM эксплантов из каждого эмбрионального хвоста путем рассечения хвоста ткани на две половины вдоль средней линии; выполнить легкое качательное движение с помощью иглы. Убедитесь в том, что нервная трубка, хорда и ПСМ ткани делятся поровну между двумя эксплантов.
- Пипетировать каждый контралатеральной PSM эксплантов на нижней стороне пластика культуральную чашку крышкой 35 мм в небольшом объеме предварительно нагретом (37 ° С) культуральной среды (DMEM-F12 + 0,1% L-глутамина, заменителем, дополненной 10% фетальной сыворотки теленка , 10 нМ человеческого Bfgf, и 1% пенициллина / стрептомицина). <li> Поместите блюдо на верхней части крышки и быстро переверните его так, чтобы ткань PSM подвешен крышки в "висячей капли" среды. Культура эксплантов ПСМ в увлажненной камере при 37 ° С в течение 1 - 2 ч.
- Передача пар PSM эксплантов на отдельные лунки 24-луночного планшета для культуры ткани с. Выдержите в 4% параформальдегид в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) или 4 & deg; C в течение ночи (O / N). ВНИМАНИЕ: параформальдегид является токсичным, а также надлежащие меры предосторожности должны быть приняты при работе с этим решением.
Примечание: Выполнить все последующей промывкой и инкубацию шаги в 24-луночный планшет для тканевых культур с. - Отмывки образца скважин в PBS при комнатной температуре на качающейся платформе, с помощью тонкой пластиковой пипетки Пастера для обмена раствора PBS на образцах свежей PBS 3 - 4 раза. Процесс один PSM эксплантов из каждой пары с помощью иммуногистохимии (этап 2) , а другой с помощью флуоресцентной гибридизация для гена известны часы в (улер 3).
2. Иммуногистохимия PSM эксплантов
- Промыть один PSM эксплантов из каждой пары эмбрионального сгенерированного на шаге 1, в 2% Тритон Х-100 в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре на ротационном платформе, а затем промыть образцы на короткое время в PBS. Заменить PBS на образцах с блокирующим раствором (2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 10% сыворотки нормальной козьей (NGS) в PBS + 0,1% твин-20) и инкубировать O / N при 4 ° С на качающейся платформе.
Примечание: Все последующие промывает и стадии инкубации в этой секции должны быть выполнены при комнатной температуре на ротационном платформе, если не указано иное. растворы для промывки могут быть легко изменены с помощью остроконечного пластика или стекла пипетки Пастера. - Развести желаемых первичных антител / антитела в рабочем буфере (0,1% BSA, 0,3% NGS, и 0,2% Тритон Х-100 в PBS). В этом примере, разбавленные антитела Dll1 и Notch1 1:25 в рабочем буфере.
Примечание: Оптимизация потребуется для определения соответствующего коэффициента разбавления требуется в This шаг, если используются альтернативные антитела. - Выдержите эксплантов в раствор антител в течение 3 - 5 дней при температуре 4 ° С на качающейся платформе. Не забудьте включить некоторые образцы с рабочим буфером, не содержащий первичное антитело, чтобы действовать в качестве контроля вторичных антител.
- Восстановление раствора первичного антитела в трубке хранения 1,5 мл с помощью пипетки и хранить его при температуре 4 ° С.
Примечание: Восстановленные первичное антитело может быть использовано несколько раз, в зависимости от используемого антитела. - Выполните 2 промывками образцов в течение 5 - 10 мин каждый в PBS, а затем 3 промывок в течение 10 мин каждый в 2% Тритон Х-100 в PBS при комнатной температуре на ротационном платформе.
- Развести флуоресцентно меченого вторичного антитела / антитела (эпитоп соответствием с первичным антителом / использовали антитела) в рабочем буфере. При желании можно добавить 20 мкг / мл Hoechst 33342 к этому раствору, чтобы контрастное ядер.
Примечание: Оптимизация может потребоваться, чтобы определить соответствующий коэффициент разбавления, необходимое на этом этапе. В этом еXample, коэффициент разбавления 1: был обычно используется 400. - Центрифуга раствор вторичного антитела в течение 10 мин при 16 XG, чтобы предотвратить образование агрегатов антител. Добавить 250 - 500 мкл вторичного раствора антител к каждому образцу скважины, следя за тем, чтобы не использовать последние несколько микролитров раствора, который может содержать агрегаты антител.
- Накройте образец пластины с фольгой, чтобы свести к минимуму воздействия света и инкубировать образцов в растворе вторичного антитела в течение 3 - 5 дней при температуре 4 ° С в темноте.
- До крепления образца мыть образцы дважды в течение 10 мин каждый раз в 0,1% Tween-20 в PBS (PBST) и один раз в течение 5 мин в PBS при комнатной температуре на ротационном платформе (этап 4).
3. Флуоресцентные В гибридизация (FISH) ПСМ эксплантов
- При хранении в альтернативном судне, передавать оставшиеся контралатеральной эксплантов PSM на отдельные лунки 24-луночного планшета для культуры ткани с.
- Вымойте образцы для10 мин в 50% этанола в PBST, а затем выполняют 2 промывок в течение 10 минут каждый в 100% этанола на качающейся платформе при комнатной температуре обезвоживает ткани.
Примечание: Все последующие промывает и стадии инкубации в этой секции должны быть выполнены при комнатной температуре на ротационном платформе, если не указано иное. - Увлажняет ткани путем промывки в течение 10 мин в 50% этаноле в PBST, с последующей промывкой дважды в течение 5 мин каждый в PBST.
Примечание: Шаги 3.2 и 3.3 необходимые шаги, необходимые для фиксации этого протокола и не могут быть опущены. - Инкубируйте образцы с 10 мкг / мл протеиназы К в 0,1% Tween-20 в PBS (PBST) в течение 5 мин без перемешивания. Быстро удалить протеиназы К и прополоскать образцы кратко с PBST перед тем после фиксации ткани в течение 30 мин в 4% раствор формальдегида + 0,1% глутарового альдегида в PBST. ВНИМАНИЕ: Оба формальдегид и глутаральдегид являются токсичными, а также надлежащие меры предосторожности должны быть приняты при работе с этими решениями.
Примечание: Следующая стиральнаяи стадии инкубации с участием 50% и 100% гибридизационных смеси (шаги 3.6 - 3.9) следует проводить без перемешивания. - После промывки образцов в два раза в течение 10 мин каждый раз в PBST, мыть образцы один раз в 50% смеси гибридизация (подходит для интронных зондов: 50% формамида, 5x цитрат физиологическим раствором натрия (ССК), 5 мМ ЭДТА, 50 мкг / мл т-РНК, 0,2% твина-20, 0,1% SDS и 100 мкг / мл гепарина) в PBST готовили при комнатной температуре. Инкубируйте образцы в этом растворе в течение 10 мин при 65 ° С без перемешивания.
- Промыть образцы дважды с предварительно нагретом (65 ° C) гибридизация смеси до инкубации образцов в гибридизационных смеси в течение ≥ 2 ч (до 48 ч) при 65 ° С (более длительное время инкубации улучшить результирующий сигнал-шум, контраст) , Удалите гибридизационная смесь из предыдущего шага, и заменить его на 0,25 - 0,5 мл подогретого (65 ° C) гибридизация смеси содержащей дигоксигенином (DIG) меченных анти-смысловой РНК-зонда против известного компонента сегментации часов.
НЕЕ: Например, интронного лунатиков (Lfng (I)) зонд был использован в концентрации 20 мкл / мл , чтобы обнаружить возникающую мРНК LFNG. Разбавление используемое на этой стадии является зонд-зависимый и потребует оптимизации. - Уплотнение пластины с использованием липкой лентой для предотвращения испарения и инкубировать образцов в растворе зонда в течение двух суток при температуре 65 ° C.
- С помощью остроконечного пластиковую пипетку Пастера, восстановить зонд для повторного использования и хранить его при температуре 20 ° С. Промыть образцы дважды с предварительно нагретом (65 ° С) после гибридизация смеси (50% формамид, 0,2% твин-20, и 1x SSC) перед стиркой образцов еще два раза в течение 20 минут каждый при 65 ° С в предварительно нагревают после гибридизации смеси.
- Промыть образцов в течение 15 мин при температуре 65 ° С в предварительно нагретый 50% смеси гибридизационного в 0,1% твина-20 в Трис-солевом буферном растворе (TBST). Промыть образцы дважды TBST перед стиркой в течение 30 мин при комнатной температуре в TBST на качающейся платформе.
- Предварительно инкубировать эксплантов в БлоCking раствор (TBST + 2% блокирующим буферным раствором реагента (BBR) + 20% термообработанного козьей сывороткой) в течение как минимум 2 ч. Заменить этот раствор свежим блокирующим раствором, содержащим 1: 200 разбавление с пероксидазой хрена (HRP) анти-дигоксигенином антитела. Инкубируйте образцы O / N при температуре 4 ° С.
- После инкубации антитела, ополоснуть образцов 3 раза TBST при комнатной температуре и передавать их на отдельные лунки нового 24-луночного планшета для культуры ткани. Промыть эксплантов с TBST 3 раза в течение 1 ч каждый.
- На данный момент, передать образцы в 0,5 мл пробирки для хранения или отдельные лунки 48-луночного планшета для культуры ткани с, чтобы уменьшить необходимый объем реагентов для обнаружения сигнала усиления Tyramide (TSA) в следующих шагах.
- Инкубируйте образцы в АСП амплификации буфере (список реагентов) при комнатной температуре в течение 1 мин без перемешивания с использованием в качестве небольшого объема, как это возможно, убедившись, что образцы полностью погружены в раствор.
- Добавьте реагент TSA (смСписок реагентов) в буфер амплификации образца в разведении 1:50. Быстро перемешать раствор до тех пор пока реагент АСП не распределяется равномерно, покрывают пластины или трубы в оловянной фольги, и инкубировать образцов в течение 60 - 90 мин в темноте.
- Удалите раствор амплификации TSA и мыть образцы в TBST 3 раза в течение 5 минут каждый. Передача эксплантов обратно в 24-луночного планшета для культуры ткани в увеличивать объем стирки и инкубировать образцов в 1% -ной перекиси водорода в TBST в течение 1 ч. Промыть образцы с TBST 3 раза в течение 5 мин каждый раз, а затем два раза в течение 5 мин каждый с PBST до крепления образца (этап 4).
4. Подготовка образцов для обработки изображений
- Подготовьте один заряженный адгезию предметное стекло для каждой пары эксплантов путем добавления толстых распорки изображений 0,12-мм, которые предотвращают образцы от раздавливания путем добавления покровным. Удалите клейкую полоску с одной поверхности прокладки и поместить его клейкой стороной вниз на предметное стекло, нажав Firmly для герметизации распорки на слайде.
Примечание: Для остальных шагов, стремиться сохранить образцы в условиях низкой освещенности или в темноте, чтобы избежать фотообесцвечивания. Пипетка пары эксплантов на подготовленных слайд с помощью стеклянной пипетки Пастера в центре обработки спейсера, гарантируя, что расчлененный сторона эксплантов сталкивается с горкой. Устройте контралатеральной пары эксплантов бок о бок. - Удалить как можно больше жидкости, как это возможно из слайда с помощью стеклянной пипетки Пастера и фитиль от любой остаточной влажности окружающего образцы, используя кусок сложенной бумаги ткани низкого ворса.
- Разрешить образцы придерживаться слайда в течение 45 - 60 секунд, пока ткань не начинает казаться липким и прозрачным. В течение этого времени, удалите остатки клея вкладыш из распорки с помощью щипцов. Не позволяйте образцы высохнуть.
- Добавьте большую каплю бифункциональных mountant и клирингового раствора (0,5% п-фенилендиамина и 20 мМ Трис, рН 8,8, в 90% глицерина) к образцам в центрепроставки. Примечание: Это решение становится коричневым / черным, когда разрешено окисляется.
- Осторожно поместите круглую покровное (нет. 1.5) по образцам, гарантируя, что mountant распределяется равномерно и что все ребра покровного стекла в контакт с прокладкой. Поместите крышку-просочился слайд вниз головой на некоторую папиросную бумагу низкого ворса.
- С небольшим усилием надавите, чтобы гарантировать, что покровное полностью придерживается проставки и что любой избыток mountant удаляется. Повторяйте, пока не более mountant кляксами бумагу.
- Чистый и маркировать слайд (ы) надлежащим образом, а не хранить их в темноте до формирования изображения, краткосрочные при -20 ° С или долгосрочной перспективе, при -80 ° С. После удаления слайды из хранения, позволяют им полностью разморозить, прежде чем визуализации.
- Изображение смонтированные образцы с помощью конфокальной микроскопии с плиточным приобретением и высокой цели увеличения. Изображение пары эксплантов с использованием объектива масла погружения 40X на 4-мкм Z-интервалов с использованием 488 нм, 568 нм и 647-нм лазер Liуказанные в другом месте , чтобы возбудить зеленый, красный, и дальнего красного флуорофоров, соответственно, используемые для обнаружения белка и мРНК в этом исследовании 12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плиточные изображения были сшиты после приобретения для формирования единого изображения для анализа.
5. После сбора анализа изображений
- С помощью программного обеспечения для анализа изображений для определения области, представляющей интерес в PSM каждого экспериментального образца.
- Для количественной оценки уровней экспрессии, вычитать фон и пороговые изображения на уровне процедуры отсутствия первичного контрольного образца, перед последующим квантификации. Определить происхождение, ось, и единицы длины для каждого образца.
- Рассчитать интенсивность флуоресценции в зависимости от положения вдоль нормированного ростро-каудальной оси для каждой из М выборок 12. После нормализации графики интенсивности, поместите сторону профилей интенсивности бок и получить матрицу интенсивности F (I, J) , который описывает интенсивность в I
6. Временная Заказ образцов
- Для того, чтобы вывести временную упорядоченность известного компонента часов, определить ее матрицу интенсивности. Затем переставить столбцы матрицы интенсивности, с тем, чтобы получить временно периодический шаблон. Для этого определим функцию
где А (е J; к) представляет собой автокорреляционную функцию J - го столбца Г и Т является функцией целевой автокорреляции, выбирается для обеспечения временной периодичности рисунка, задается
- Используйте Метрополиса-Гастингса (или другой алгоритм минимизации) 12 , чтобы определить порядок образцов , которые сводят к минимуму функции г. Таким образом, определяют порядок изM образцы, которые максимизирует временную периодичность известного компонента часов.
- Использование INFERRED временного упорядочения М выборок, построить упорядоченную кимографе для паттерна экспрессии в Partnered канале 12.
Representative Results
Этот протокол позволяет визуализировать пространственно - временного профиля интересующего белка наряду с транскрипцией генов часов в PSM мыши 12. Например, Dll1 (рис 1A-C) и экспрессия белка Notch1 (рис 1D-F) показаны вибрировать из синхронности с зарождающейся транскрипции Notch-регулируемых генов сегментации часы Lfng. Количественное Dll1, Notch1 и Lfng (I) интенсивность сигнала по отношению к оси переднезадней (AP) на PSM (рис 1G) показывает четкой динамики колебательные выражение для этих целей (рис 1H-J). Пространственно-временной профиль экспрессии белка Dll1 и Notch1 на протяжении всего цикла часов четко визуализировать и количественно, используя этот протокол на основе анализа изображений после приобретения данных изображения с высокой разрешающей способностью фиксированных тканей.
Рисунок 1: Пространственно-временной визуализации и Количественное Dll1 и Notch1 экспрессии белка Dynamics. (AF) Пары эксплантов из шести E10.5 эмбрионов (AF) , показывающие пространственное распределение белка Dll1 (AC) или белка Notch1 (DF) в одной половине наряду с обнаружением Lfng пре-мРНК (Lfng (I)) в соответствующий контралатеральной половину каждой пары. Панели расположены в соответствии с этапа 1 (А и D), фаза 2 (В и Е), и этап 3 (C и F) цикла сегментации часов, как определено пространственным профилем (I) выражение LFNG. Степень экспрессии доменов для Dll1 (зеленый), Notch1 (красный), и Lfng (I) (серый) вдоль передне-задней оси ПСМ имеют Ьееп разграничены полосы, кодированные цветом. Пунктирные линии разграничить позиции совсем недавно сформированного сомитов (ами), внешними краями ПСМ и прилегающей нервной ткани (С и Е). Шкала баров (слева внизу каждой панели, AF) представляют 100 мкм. (G) Пример интенсивности участок изображающие осевое изменение интенсивности сигнала через ПСМ. Данные нанесены из двух эксплантов пар , показывающих LFNG пре-мРНК (черный хешированная линия) в одном эксплантов по сравнению с белком Notch1 (красного цвета) в контралатеральной эксплантов (Embryo 1), а также LFNG пре-мРНК (черная сплошная линия) в другой эксплантов по сравнению с белком Dll1 (зеленый) в контралатеральной эксплантов (Эмбрион 2). Измеренная интенсивность сигнала (ось у) представлен в зависимости от осевого положения (оси х; передняя PSM [A] к правой и задней PSM [P] слева). (Н) кимографе показывающая пространственное распределение Dll1, Notch1 и Lfng (I) помногочисленные PSMS. Каждая строка кимографе представляет интенсивность сигнала отдельного PSM эксплантов. Ряды расположены во временной последовательности в соответствии с пространственно - временного распределения Lfng пре-мРНК (I) пространственно - временного распределения Dll1, Notch1 и Lfng (I) через нескольких колебаний тактовых имитируется периодическим продолжением данных , представленных в (H) , выделяя колебательный характер динамики экспрессии Dll1 и Notch1. Экспрессия белка (J) Пульсирующие Notch1 в каудальной части PSM подсвечивается увеличением области разграничены в виртуальном кимограф , показанном на (I). Модифицированный из ссылки 12. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Критические шаги в рамках Протокола
Настоящий протокол описывает чувствительный метод для выполнения количественного анализа экспрессии белка и колебательной динамики низкоуровневых в E10.5 мыши PSM эксплантов. Надежный протокол для обоих иммуногистохимии и флуоресцентной гибридизация (FISH) в сопровождается высоким разрешением целом монтажа конфокальной микроскопии, а затем с помощью анализа изображений и временной сегментации kymographs для генерации пространственно - временную карту экспрессии белка через ПСМ. Высокое отношение сигнал-шум в белка и мРНК обнаружения имеет важное значение для обеспечения успеха этой техники. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы тщательно обмениваться все решения эффективно в течение стадий промывки и поддерживать температуру C стирок 65 ° в соответствующих стадиях шага 3. Это наиболее выгодно взять время, чтобы источником эффективных антител и РНК-зондов, направленными против объектами интереса и проверить эти реагентыТщательно на целом монтажа образцов перед началом этого протокола.
Модификации и устранение неисправностей
Основные вопросы, с которыми можно столкнуться при выполнении этого протокола возникают из-за плохой прочности обнаружения сигнала и качества. Это во многом зависит от эффективности антител или РНК-зондов, используемых для иммуногистохимии или FISH шагов в протоколе, соответственно. Ряд различных этапов может потребовать оптимизации перед тем, адекватного обнаружения сигнала достигается. Одной из распространенных причин для плохого обнаружения сигнала является неправильное крепление; крайне важно, чтобы либо свежей PFA или PFA хранят при температуре 4 ° С в течение не более чем за одну неделю используется для фиксации образцов. Длина записи, может также требуют оптимизации, в зависимости от зонда антитела или РНК, используемую. Для получения антител, рекомендуется следовать инструкциям производителя, где это возможно, а для РНК-зондов, мы рекомендуем консультацию опубликованной литературы.
Lfng часов. Из - за относительного отсутствия изобилия, обнаружение LFNG пре-мРНК требует длительного периода инкубации с зондом гибридизации смеси , содержащей 5x цитрат натрия-солевой раствор (SSC) для хорошего обнаружения сигнала. Те же самые условия могут применяться к другим зондами , которые обнаруживают слабо выраженные мРНК, но в нашем опыте, обнаружение более стабильных мРНК мишеней может потребоваться более короткий шаг гибридизации зонда и более низкие концентрации SSC в гибридизация смеси (например, 1.3x SSC). Для обоих иммуногистохимии и FISH, протокол сначала должен быть оптимизирован на целых эмбрионов, а также оптимальная концентрация антитела или зонда должны быть определены эмпирически.
Ограничения техники
Как уже упоминалось выше, успех этого метода сильно зависит от качества белка и обнаружение мРНК. Wе наметили несколько предложений относительно того, как белок и обнаружение мРНК может быть улучшена, но при отсутствии сигнала обнаружения флуоресцентного высокого качества, нет никакого способа, эксперимент может продолжиться. Число белковых мишеней, которые могут быть проанализированы в каждом образце ткани ограничена спектральным разрешением конфокальной микроскопии и эпитопов антител, используемых. В данном исследовании мы смогли использовать до трех эпитопов для обнаружения белка наряду с красителем ДНК на каждом образце 12. Этот протокол позволяет только обнаружение одной мРНК - мишени, хотя в настоящее время альтернативные методы могут быть использованы для увеличения это до трех мишеней 14.
Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов
Описанный здесь метод обеспечивает чувствительный метод для обнаружения колебаний белка низкого уровня в целом монтажа эксплантов PSM. Количественное этой динамикивозможно путем проведения FISH для известного гена часы в соответствующих контралатеральной эксплантов. Библиотека kymographs генерируется, что может быть организовано по одному сегментация тактовый цикл, выделяя пространственно-временные динамики экспрессии мишени интерес в течение этого времени. Основное различие в этой технике над другими является использование вычислительной автоматизации для заказа во времени больших массивов данных, что позволяет пространственно-временные динамику экспрессии новых компонентов тактовыми, подлежащих анализу беспристрастно. Например, этот метод при условии, понимание того, как Dll1 и Notch1 белки и их колебания совместно регулируются по всей PSM. Альтернативные методы в этом контексте также полагаться на иммунное окрашивание, но они не обнаружили небольшие колебания уровней белка Dll1 и Notch1 в хвостовом PSM, которые были очевидны с использованием этого метода. Вместо этого, они сообщили , устойчивый градиент выражения , что является самым сильным в ростральной области 9
Будущие приложения или направления после овладения техникой
После того, как этот протокол был освоен, анализ экспрессии с высокой пропускной способностью может быть выполнена для любого интересующего белка в PSM.PSM эксплантов, сгенерированные из нескольких пометов мыши могут быть обработаны сразу для создания номера высокого проб, необходимого для проведения анализа. Хотя мы использовали только эмбрионов дикого типа в этих исследованиях, можно провести такой анализ с использованием генетически модифицированных эмбрионов с целью оценки важности одного или нескольких факторов на динамику экспрессии белка. Помимо ПСМ, этот протокол может быть адаптирован к другим системам, которые состоят из двух половинок контралатеральной и могут быть использованы для обнаружения чувствительно экспрессии белка и колебательные Микродинамику. Одним из примеров , для которых этот протокол может быть адаптирован является исследование динамической экспрессии белка в мышиной нервной трубки, так как половинки контралатеральные может быть сгенерирован и культивируют, и активность Паз было показано, что оба присутствуют и важны для формирования паттерна 15. Мы призываем другие группы, чтобы адаптировать этот протокол к другим системам и обеспечить обратную связь для дальнейшего совершенствования.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана студенчества MRC на RAB-регулирование, с студенчества MRC к CSLB, и гранта WT проекта до JKD (WT089357MA). Работа была также поддержана Welcome Trust стратегического премии (097945 / Z / 11 / Z). Мы благодарим д - ра Е. Kremmer за любезное дар антитела Dll1 и д - р О. Pourquie для зонда Lfng РНК.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 11320033 | |
| GlutaMAX™-1 (100x) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 35050 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10270106 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140122 | |
| anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^ | BD Pharmingen | 552466 | |
| anti-rat polyclonal Dll1 antibody^* | N/A | N/A | |
| Lfng intronic anti-sense RNA probe^* | N/A | N/A | |
| 16% paraformaldehyde | Pierce (ThermoFischer Scientific) | PI28908 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche (Sigma-Aldrich) | 31158 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Made in house | N/A | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Normal goat serum (NGS) (heat-treated) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 16210072 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFischer Scientific | H3570 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Saline-sodium citrate (SSC) | Sigma-Aldrich | 93017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | |
| tRNA | Roche (Sigma-Aldrich) | 101095 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Made in house | N/A | |
| Blocking Buffer Reagent | Roche (Sigma-Aldrich) | 11096176001 | |
| anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody | Roche (Sigma-Aldrich) | 11207733910 | |
| Tyramide signal amplification (TSA) kit | Perkin Elmer | NEL744001KT | |
| *The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources. | |||
| ^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader. | |||
References
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139 (4), Cambridge, England. 625-639 (2012).
- Krol, A. J., Roellig, D., et al. Evolutionary plasticity of segmentation clock networks. Development. 138 (13), Cambridge, England. 2783-2792 (2011).
- Dequéant, M. -L., Ahnert, S., et al. Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock. PLoS ONE. 3 (8), 2856 (2008).
- Bailey, C., Dale, K. Somitogenesis in Vertebrate Development. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-15 (2015).
- Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. Somitogenesis. Development. 139 (14), Cambridge, England. 2453-2456 (2012).
- Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock. Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).
- Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites. PLoS Genetics. 5 (9), 1000662 (2009).
- Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock. eLife. 4, 05842 (2015).
- Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis. Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).
- Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis. Cell. 149 (2), 295-306 (2012).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nature communications. 3, 1141 (2012).
- Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM. Development. 141 (24), Cambridge, England. 4806-4816 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), 160 (2007).
- Denkers, N., García-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos. Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).
- Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo. Development. 142 (13), Cambridge, England. 2291-2303 (2015).
