Introduction
Somiter är de första segmenten är utformade i elongating kroppsaxel i utvecklings ryggradsdjur och är föregångare av ryggraden, revben och dermis vävnad, såväl som av muskel och endotelceller. Under somitogenesis, epitelceller somites bildar från unsegmented presomitic mesoderm (PSM) (översikt i ref 1). Denna process regleras av "segmente klocka", som består av ett nätverk av oscillerande gener och proteiner, för det mesta som hör till Notch-signalvägen. Segmente klockan består av olika negativa återkopplingsslingor, som möjliggör pulserande produktionen av Notch aktivitet inom en enda cell 2 (granskas i Referenser 3-6). Medan den intracellulära metod för oscillation är väl karakteriserad, är det fortfarande till stor del okänt hur dessa svängningar är koordinerade över PSM vävnad. Det har nyligen visats genom både experimentella och teoretiska studier, att dessa svängningar är essential till processen för somitogenesis och att Notch-vägen spelar en avgörande roll i processen för att både segmentering och oscillerande genexpression 7, 8. Emellertid har det varit allmänt rapporterats att Notch-receptor 1 (Notch1) och Delta-liknande ligand (Dll) -1 har statiska gradienter i PSM 9, 10, 11.
Vi antar att Notch beroende svängningar i PSM segmente klockan beror på den återkommande aktivering av huvud Notch vägen receptor och ligand, Notch1 och Dll1 respektive över musen PSM. Slutsatserna från tidigare studier som rapporterade en statisk rostralt-caudal gradient av dessa proteiner berodde vi förutse, till en brist på känslighet i immunfärgning tekniker. De var därför inte upptäcka låg nivå fluktuationer i Dll1 och Notch1 i stjärtfenan PSM.
vi have utarbetat en metod för att närmare undersöka dessa faktorer, som kombinerar experimentella data med matematisk modellering för att förutsäga en mekanism genom vilken svängningar av proteinerna av komponenter klock samordnas över PSM 12.
Det övergripande målet med denna metod är att detektera och kvantifiera låg nivå, dynamiska proteinuttryck i PSM och att kartlägga uttryck profiler av proteiner av intresse enligt uttrycket av den kända klock genen Lunatic frans (Lfng). Sedan en cykel av segmente klockan i musembryo tar två timmar att slutföra, är olika prover som krävs för att bygga en komplett Spatiotemporal profil Dll1 och Notch1 proteinuttryck under en Lfng svängning i PSM. Vi har därför utvecklat detta protokoll för att möjliggöra hög genomströmning detektion av lågaktivt proteinuttryck i hela-fäste, kontra PSM explants. Emellertid kan denna teknik även vara användbar för studier thatt syftar till att karakterisera låg nivå proteindynamik inom en embryonal vävnad som kan delas upp i kontralaterala halvor.
Protocol
Alla experiment utfördes under projektet licensnummer 6004219 i strikt följsamhet till djuren (Scientific Procedures) Act från 1986 och det brittiska inrikesministeriet Code of Practice för användning av djur i vetenskapliga försök.
1. PSM Explantation Dissection
- Skaffa svansen vävnad från embryon som producerats av den tidsinställda parning av vild-typ (CD1) möss 13. I korthet, vid embryonal dag (E) 10,5, avliva den gravida givare mus i en koldioxidkammare. Skörda livmoderhornet och placera den i 1x steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning i enlighet med hemmakontoret Licens förfaranden eller motsvarande lokala regler. Överföra livmoderhornet till en vävnadsodlingsskål innehållande färsk, steril PBS. Utför alla efterföljande dissektion steg i den här lösningen.
- Under en stereomikroskop, skär tjocka muskel membran av livmoderhornet med hjälp av böjd sax och extrahera varje embryo försiktigt med fin pincett. Ta hand om digför att säkerställa att svansen vävnaden inte skadas i denna process. Använda böjd sax och fin pincett, dissekera bort fostersäcken från varje embryo, noga med att inte skada embryot.
- Använd antingen en kirurgisk nål eller böjd sax för att skörda svansen vävnad varje embryo genom att skära embryot bakre till de bakre lem knoppar.
- Balansera svansen vävnaden ventrala sida ner med både pincett och en nål. Generera par av PSM explants från varje embryonala svans genom att dissekera svansen vävnaden i två halvor längs mittlinjen; utföra en mild gungande rörelse med en nål. Se till att neuralröret, notochord och PSM vävnad är jämnt fördelade mellan de två explantat.
- Pipettera varje kontralate PSM explantat på undersidan av en 35-mm plastodlingsskål locket i en liten volym av förvärmd (37 ° C) odlingsmedium (DMEM-F12 + 0,1% L-glutamin substitut kompletterat med 10% fetalt kalvserum , 10 nM humant bFGF, och 1% penicillin / streptomycin). <li> Placera skålen på toppen av locket och snabbt invertera det så att PSM vävnaden är upphängd i locket i en "hängande droppe" medium. Kultur PSM explantaten i en fuktkammare vid 37 ° C under 1 - 2 h.
- Överförings par av PSM explants till de individuella brunnarna i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta. Inkubera i 4% paraformaldehyd i PBS under 1 h vid rumstemperatur (RT) eller 4 ° C över natten (O / N). VARNING: Paraformaldehyd är giftig, och lämpliga säkerhetsåtgärder måste vidtas vid arbete med denna lösning.
OBS: Utför alla efterföljande tvätt- och inkuberingssteg i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta. - Tvätta provbrunnarna i PBS vid RT på en gungande plattform, med hjälp av en fin plast pasteurpipett att byta PBS lösning på proven för färskt PBS 3 - 4 gånger. Bearbeta en PSM explantat från varje par med användning av immunohistokemi (steg 2) och den andra med användning av fluorescerande in situ-hybridisering för en känd klock gen (step 3).
2. Immunohistokemi av PSM explants
- Tvätta en PSM explantat från varje embryonala par genererats i steg 1 i 2% Triton X-100 i PBS under 1 h vid RT på en gungande plattform, och skölj sedan prover kortvarigt i PBS. Ersätta PBS på proverna med blockeringslösning (2% bovint serumalbumin (BSA) och 10% normalt getserum (NGS) i PBS + 0,1% Tween-20) och inkubera O / N vid 4 ° C på en gungande plattform.
OBS: Alla efterföljande tvättar och inkubation stegen i detta avsnitt måste utföras vid RT på en gungande plattform, om inte annat anges. Tvättlösningar kan enkelt ändras med hjälp av en spetsig plast eller glas pasteurpipett. - Späd de önskade primära antikropp / antikroppar i arbetsbuffert (0,1% BSA, 0,3% NGS, och 0,2% Triton X-100 i PBS). I det här exemplet, späd Dll1 och Notch1 antikroppar 1:25 i arbetsbuffert.
OBS: Optimering kommer att krävas för att bestämma lämplig utspädningsfaktor krävs i this steget om alternativa antikroppar används. - Inkubera explantat i antikroppslösningen för 3 - 5 dagar vid 4 ° C på en gungande plattform. Var noga med att inkludera några prover med arbetsbuffert innehållande ingen primär antikropp för att fungera som sekundära kontroller antikroppar.
- Återvinna den primära antikroppen lösning i en 1,5-ml lagringsröret med användning av en pipett och förvara den vid 4 ° C.
OBS: Återvunna primär antikropp kan användas flera gånger, beroende på den antikropp som används. - Utföra 2 tvättningar av proverna under 5 - 10 min vardera i PBS, följt av 3 tvättningar under 10 minuter vardera i 2% Triton X-100 i PBS vid RT på en gungande plattform.
- Späd fluorescerande sekundär antikropp / antikroppar (epitop-anpassade till den primära antikroppen / antikropparna som används) i arbetsbuffert. Eventuellt tillsätt 20 mikrogram / ml Hoechst 33342 till denna lösning för att Motfärga kärnorna.
OBS: Optimering kan krävas för att bestämma den lämpliga utspädningsfaktorn som krävs i detta steg. I denna eXEMPEL, en utspädningsfaktor på 1: 400 var normalt användes. - Centrifugera den sekundära antikroppslösningen under 10 min vid 16 xg för att förhindra bildningen av aggregat antikropps. Tillsätt 250 - 500 mikroliter av den sekundära antikroppen lösning till varje provbrunn, noga med att inte använda de sista mikroliter av lösningen, som kan innehålla aggregat antikroppar.
- Täcka provplattan med stanniol för att minimera ljusexponering och inkubera proverna i den sekundära antikroppslösningen under 3 - 5 dagar vid 4 ° C i mörker.
- Före provmontering, tvätta proverna två gånger i 10 min vardera i 0,1% Tween-20 i PBS (PBST) och en gång under 5 min i PBS vid RT på en gungande plattform (se steg 4).
3. Fluorescerande In Situ Hybridisering (FISH) av PSM explants
- Om den förvaras i ett alternativt kärl, överföra de återstående kontra PSM explants till de enskilda brunnarna i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta.
- Tvätta proverna för10 min i 50% etanol i PBST, och sedan utföra 2 tvättar i 10 min vardera i 100% etanol på en gungande plattform vid RT för att dehydratisera vävnaden.
OBS: Alla efterföljande tvättar och inkubation stegen i detta avsnitt måste utföras vid RT på en gungande plattform, om inte annat anges. - Rehydrera vävnaden genom tvättning under 10 min i 50% etanol i PBST, följt av tvättning två gånger under 5 min vardera i PBST.
OBS: Steg 3,2 och 3,3 är nödvändiga fixerings åtgärder som krävs för detta protokoll och kan inte uteslutas. - Inkubera proverna med 10 mikrogram / ml proteinas K i 0,1% Tween-20 i PBS (PBST) under 5 min utan omröring. Snabbt ta bort proteinas K och skölj proverna hastigt med PBST innan efter fastställande vävnaden under 30 min i 4% formaldehyd + 0,1% glutaraldehyd i PBST. VARNING: Både formaldehyd och glutaraldehyd är giftiga, och lämpliga säkerhetsåtgärder måste vidtas vid arbete med dessa lösningar.
OBSERVERA: Följande tvättningoch inkubationssteg omfattar 50% och 100% hybridiseringsbetingelser blandningar (steg 3,6-3,9) skall utföras utan omrörning. - Efter tvätt av proverna två gånger i 10 min vardera i PBST, tvätta proverna en gång i 50% hybridiseringsblandning (lämplig för intron prober: 50% formamid, 5 x saltlösning-natriumcitrat (SSC), 5 mM EDTA, 50 | ig / ml tRNA, 0,2% Tween-20, 0,1% SDS och 100 ^ g / ml heparin) i PBST ställdes vid RT. Inkubera proverna i denna lösning under 10 min vid 65 ° C utan omröring.
- Skölj proverna två gånger med förvärmd (65 ° C) hybridiseringsblandning före inkubering proverna i hybridiseringsblandning i ≥ 2 timmar (upp till 48 h) vid 65 ° C (längre inkubationstider förbättra den resulterande signal-till-brus-kontrast) . Ta bort hybridiseringsblandning från föregående steg, och ersätta den med 0,25-0,5 ml förvärmda (65 ° C) hybridiseringsblandning innehållande en digoxigenin (DIG) -märkta antisens-RNA-sond mot en känd segmente klocka komponent.
INTEE: Till exempel var en intron Lunatic frans (Lfng (i)) sond som används vid en koncentration av 20 mikroliter / ml för att detektera begynnande Lfng mRNA. Utspädningen som användes i detta steg är sond beroende och kommer att kräva optimering. - Förslut plattan med hjälp av tejp för att förhindra avdunstning och inkubera proverna i sondlösningen i två nätter vid 65 ° C.
- Med hjälp av en spetsig plast pasteurpipett, återställa sonden för återanvändning och förvaras vid 20 ° C. Skölj proverna två gånger med förvärmd (65 ° C) efter-hybridiseringsblandning (50% formamid, 0,2% Tween-20, och 1 x SSC) innan tvätt av proverna två gånger under 20 min vardera vid 65 ° C i pre- värmdes post-hybridiseringsblandning.
- Tvätta proverna under 15 minuter vid 65 ° C i förvärmda 50% hybridiseringsblandning i 0,1% Tween-20 i Tris-buffrad saltlösning (TBST). Skölj proverna två gånger med TBST innan du tvättar i 30 minuter vid RT i TBST på en gungande plattform.
- Pre-inkubera explants i blocking lösning (TBST + 2% blockeringsbuffert reagens (BBR) + 20% värmebehandlad getserum) under minst 2 timmar. Ersätta denna lösning med färsk blockeringslösning innehållande en 1: 200 utspädning av pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad anti-digoxigenin antikropp. Inkubera proverna O / N vid 4 ° C.
- Efter antikroppen inkubation skölj proverna 3 gånger med TBST vid RT och överföra dem till enskilda brunnar i en ny 24-brunnars vävnadsodlingsplatta. Tvätta explantaten med TBST 3 gånger under 1 h vardera.
- Vid denna punkt, överför proven i 0,5 ml-lagrings rör eller de individuella brunnarna i en 48-brunnars vävnadsodlingsplatta för att minska den erforderliga volymen av de tyramide signalförstärkning (TSA) detekteringsreagens i följande steg.
- Inkubera prov i TSA förstärkning buffert (se listan reagens) vid RT under 1 min utan omrörning med hjälp av en så liten volym som möjligt, se till att proven är helt nedsänkt i lösningen.
- Lägg TSA reagens (sereagenser listan) till provet förstärkningsbuffert vid en spädning av 1:50. Snabbt blanda lösningen tills TSA reagenset är jämnt fördelat, täck plattan eller rör i stanniol, och inkubera proverna under 60 - 90 minuter i mörker.
- Ta bort TSA förstärkningslösningen och tvätta proverna i TBST 3 gånger under 5 min vardera. Överföra explantaten tillbaka till en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta för att öka tvättvolymen och inkubera proverna i 1% väteperoxid i TBST under 1 h. Tvätta proverna med TBST 3 gånger under 5 min vardera, och sedan två gånger under 5 min vardera med PBST före provmontering (se steg 4).
4. Provberedning för Imaging
- Förbered en laddad vidhäftnings glasskiva för varje explantat par genom att tillsätta 0,12 mm tjocka avbildnings distanser, som hindrar proverna från att krossas genom tillsats av ett täckglas. Ta bort klister liner från en yta av en distans och placera den självhäftande sidan nedåt på en glasskiva, att trycka på firmly att täta distans till bilden.
OBS: För de återstående stegen, sträva efter att hålla proven i svagt ljus eller i mörker för att undvika fotoblekning. Pipette Explantation paren på en förberedd slid med användning av en glas pasteurpipett i centrum av distanselementet, vilket säkerställer att den dissekerade sidan av explantatet är vänd mot objektglaset. Ordna kontra par explants sida vid sida. - Ta bort så mycket vätska som möjligt från bilden med hjälp av en glas pasteurpipett och veken bort eventuell kvarvarande fukt som omger prover med en bit av vikt låg ludd mjukpapper.
- Tillåta proverna att vidhäfta till sliden under 45 - 60 s, tills vävnaden börjar uppträda klibbiga och genomskinlig. Under denna tid, ta bort kvarvarande klister fodret från distans med pincett. Tillåter inte proverna torka ut.
- Lägg en stor droppe dubbel funktion monterings och clearing-lösning (0,5% p-fenylendiamin och 20 mM Tris, pH 8,8, i 90% glycerol) till proverna i centrumav distansorganet. OBS: Denna lösning blir brun / svart när tillåtet att oxidera.
- Placera försiktigt en cirkulär täck (nr. 1.5) över proven och se till att monterings är jämnt fördelad och att alla kanter på täck kontakt med distansen. Placera locket-halkade glida upp och ner på vissa låg-ludd mjukpapper.
- Tryck ner ordentligt för att säkerställa att täck följer fullt ut distansen och att eventuellt överskott monterings avlägsnas. Upprepa tills inga fler monterings blottar papperet.
- Ren och märka bilden (s) på lämpligt sätt, och förvara dem i mörker tills avbildning, kortsiktigt vid -20 ° C eller långvarig vid -80 ° C. Efter avlägsnande bilderna från lagring, tillåta dem att fullt ut tina innan avbildning.
- Bild de monterade proven med hjälp av en konfokalmikroskop med kaklade förvärv och en hög förstoring mål. Bild explantatet paren med en 40X oljeimmersion mål vid 4-im z-intervall med hjälp av 488 nm, 568 nm och 647 nm laser lines att uppväcka de gröna, röda, och långt röda fluoroforer, respektive, som används för protein och mRNA detektion i denna studie 12.
OBS: Kaklat bilder syddes efter förvärvet för att bilda en enda bild för analys.
5. Post förvärv bildanalys
- Använd bildanalys programvara för att definiera ett område av intresse i PSM varje experimentellt prov.
- För att kvantifiera uttrycksnivåer, subtrahera bakgrund och tröskel bilder till samma nivå som en icke-primär kontrollprov före efterföljande kvantifiering. Definiera ett ursprung, en axel, och en enhetslängd för varje prov.
- Beräkna fluorescensintensiteten som en funktion av läget längs den normaliserade rostro-caudal-axeln för var och en av de M proven 12. Efter normalisering intensitets tomter, placera intensitetsprofiler sida vid sida och erhålla en intensitetsmatris f (i, j) som beskriver intensiteten vid den i:
6. Tids Beställning av prov
- Att sluta tids beställning av en känd klockkomponent, definiera dess intensitet matris. Då, ordna om kolumnerna i intensitetsmatrisen så att man erhåller en tidsmässigt periodiskt mönster. För att göra detta, definiera funktionen
där A (f j; k) representerar autokorrelationsfunktionen för den j: te kolumnen av f och A T är ett mål autokorrelationsfunktionen, som valts för att genomdriva den temporala periodicitet av mönstret, som ges av
- Använda Metropolis-Hastings (eller en annan minimeringsalgoritm) 12 för att identifiera ordningen av proven som minimerar funktionen g. Således, bestämma i vilken ordning deM sampel som maximerar den temporala periodiciteten av en känd klockkomponent.
- Använda den antagna tids beställning av M prover, konstruera en ordnad kymograph för uttrycksmönstret i partnered kanal 12.
Representative Results
Detta protokoll tillåter visualisering av Spatiotemporal profilen hos ett protein av intresse tillsammans med klock gentranskription i mus-PSM-12. Exempelvis Dll1 (Figur 1A-C) och Notch1 (figur 1D-F) proteinuttryck är visade att oscillera ut ur synkront med den begynnande transkriptionen av Notch-reglerade segmenteklock genen Lfng. Kvantifiering av Dll1, Notch1 och Lfng (i) signalintensitet i förhållande till den antero-posterior (AP) axeln för PSM (Figur 1G) avslöjar tydliga oscillerande expressionsdynamik för dessa mål (figur 1 H-J). Den Spatiotemporal profil Dll1 och Notch1 proteinuttryck under klockcykel är tydligt visualiseras och kvantifieras med hjälp av detta protokoll genom efter förvärvet bildanalys av högupplösta fixerade vävnadsbilddata.
Figur 1: spatiotemporala Visualisering och kvantifiering av Dll1 och Notch1 Protein Expression Dynamics. (AF) Par av explantat från sex E10.5 embryon (AF) som visar den rumsliga fördelningen av Dll1 protein (AC) eller Notch1 protein (DF) i en halv vid sidan detektion av Lfng pre-mRNA (Lfng (i)) i motsvarande kontra hälften av varje par. Paneler är ordnade efter Fas 1 (A och D), fas 2 (B och E), och fas 3 (C och F) av segmenteringsklockcykel, som bestämts av den rumsliga profil för Lfng (i) uttryck. Omfattningen av uttrycket domäner Dll1 (grön), Notch1 (röd), och Lfng (i) (grå) längs antero-posterior axel PSM har been avgränsas av färgkodade staplar. De streckade linjerna avgränsa positionerna för den senast bildade somit (s), de yttre kanterna av PSM, och den intilliggande nervvävnad (C och E). Skala barer (nedre vänstra hörnet av varje panel, AF) representerar 100 pm. (G) Ett exempel intensitets plot som visar den axiella variationen i signalintensitet över PSM. Data plottas från två Explantation paren visar Lfng pre-mRNA (svart streckade linjen) i ett explantat jämfört med Notch1 protein (röd) i den kontralate explantatet (Embryo 1), såväl som Lfng pre-mRNA (svart fast linje) i annan explantat jämfört med Dll1 protein (grön) i den kontralate Explantation (Embryo 2). Uppmätt signalintensitet (y-axeln) avsatts mot axiell position (x-axeln; anterior PSM [A] till höger och bakre PSM [P] till vänster). (H) En kymograph visar den geografiska fördelningen av Dll1, Notch1 och Lfng (i) övertalrika PSM. Varje rad i kymograph representerar signalintensiteten hos en individ PSM explantat. Rader är anordnade i tidsmässig sekvens enligt Spatiotemporal distribution av Lfng pre-mRNA (I) Den spatiotemporal distribution av Dll1, Notch1 och Lfng (i) genom flera klock oscillationer simuleras genom den periodiska förlängningen av de data som visas i (H) , med fokus på oscillerande natur Dll1 och Notch1 uttrycks dynamik. (J) pulserande Notch1 proteinexpression i den kaudala PSM markeras av förstoringen av regionen avgränsad i den virtuella kymograph visas i (I). Modifierad från ref 12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kvantifiering av tid och rum Dynamisk av Dll1 och Notch1 proteinuttryck. (A) Ett exempel intensitets plot skildrar axiell variation i signalintensitet över PSM. Data plottas från två Explantation paren visar Lfng pre-mRNA (svart streckade linjen) i ett explantat jämfört med Notch1 protein (röd) i den kontralate explantatet halv, liksom Lfng pre-mRNA (svart heldragen linje) i en halv explantat från en andra änden jämfört med Dll1 protein (grön) i den kontralate explantatet halvan av andra svans. Uppmätta intensiteter (y-axeln) är avsatt mot axiellt läge (x-axeln; rostral [A] till höger och kaudala [P] till vänster). (BH) Kymographs visar den geografiska fördelningen av Notch1, Dll1, NiCd, och Lfng (i) över flera PSM. (B och C) NICD (B) och Dll1 (C) expression i PSM sektioner; (D och E) Lfng (i) (D) och Dll1 (<strong> E) i kontralaterala Explantation halvor; (F och G) Lfng (i) (F) och Notch1 (G) i kontralaterala Explantation halvor. Från Referens 12. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
Det nuvarande protokollet beskriver en känslig metod för att utföra kvantitativ analys av lågaktivt proteinuttryck och oscillerande dynamik i E10.5 mus PSM explants. En robust protokoll för både immunohistokemi och fluorescerande in situ hybridisering (FISH) följs av högupplösande hela montering konfokala imaging, och sedan genom bildanalys och tidssegmentering av kymographs att generera en Spatiotemporal karta över proteinuttryck över PSM. En hög signal-brusförhållande på protein och mRNA upptäckt är avgörande för att nå framgång med denna teknik. Man måste vara försiktig för att grundligt utbyta alla lösningar på ett effektivt sätt under tvättstegen och att hålla temperaturen på 65 ° C tvättar i de relevanta stadierna av steg 3. Det är mest fördelaktigt att ta tid att köpa effektiva antikroppar och RNA-sonder mot mål av intresse och för att testa dessa reagensnoggrant på hela montering prover innan du börjar detta protokoll.
Ändringar och felsökning
De viktigaste frågorna som kan uppstå när du utför detta protokoll uppstår dålig styrka och kvalitet signaldetektering. Detta är till stor del beroende på effekten av antikropparna eller RNA-prober som används för immunohistokemi eller fisk steg i protokollet, respektive. Ett antal olika åtgärder kan kräva optimering innan tillräcklig signaldetektering uppnås. En vanlig orsak till dålig signaldetektering är felaktig fixering; Det är absolut nödvändigt att antingen färsk PFA eller PFA lagras vid 4 ° C under en längre tid än en vecka används för att fixera proverna. Längden av fixering kan också kräva optimering, beroende på den antikropp eller RNA-prob användas. För antikroppar, är det tillrådligt att följa tillverkarens anvisningar när så är möjligt, medan RNA-prober, rekommenderar vi samråd med publicerad litteratur.
Lfng. På grund av dess relativa brist på överflöd, detektion av Lfng pre-mRNA kräver en lång period av inkubation med sonden i hybridiseringsblandning innehållande 5x saltlösning-natriumcitrat (SSC) för god signaldetektering. Samma villkor kan gälla för andra prober som detekterar svagt uttryckta mRNA, men vår erfarenhet, kan detektion av stabilare mRNA-mål kräver en kortare probhybridisering steg och lägre SSC koncentrationer i hybridiseringsblandning (t.ex. 1,3x SSC). För både immunhistokemi och FISH måste protokollet först optimeras på hela embryon, och den optimala koncentrationen av antikropp eller sond måste bestämmas empiriskt.
Begränsningar av tekniken
Såsom nämnts ovan, är framgången med denna teknik i hög grad beroende av kvaliteten av proteinet och mRNA-detektering. We har skisserat flera förslag på hur protein och mRNA detektion kan förbättras, men i frånvaro av hög kvalitet fluorescerande signal upptäckt, det finns inget sätt experimentet kan fortsätta. Antalet proteinmål som kan analyseras i varje vävnadsprov är begränsad av den spektrala upplösningen hos konfokalmikroskop och av de epitoper av de antikroppar som används. I denna studie kunde vi använda upp till tre epitoper för proteindetektion vid sidan av en DNA-fläck på varje prov 12. Detta protokoll tillåter endast detektion av ett mRNA mål, även om dagens alternativa metoder kan användas för att öka denna till upp till tre mål 14.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Den metod som beskrivs här ger en känslig teknik för att upptäcka låg nivå proteinförändringar i hela montering PSM explants. Kvantifiering av denna dynamik ärmöjligt genom att utföra FISH för en känd klock gen i motsvarande kontra explantat. Ett bibliotek av kymographs genereras som kan organiseras under en segmenteklockcykel, med fokus på Spatiotemporal uttryck dynamiken i ett mål av intresse inom denna tidsram. En viktig skillnad i denna teknik framför andra är användningen av beräknings automatisering för att temporärt beställa stora datamängder, som tillåter Spatiotemporal uttryck dynamiken i nya komponenter klock som skall analyseras på ett opartiskt sätt. Till exempel, denna teknik gav en inblick i hur Dll1 och Notch1 proteiner och deras svängningar ges samtidigt regleras över hela PSM. Alternativa metoder I detta sammanhang har också åberopat immunfärgning, men att de inte upptäcka små variationer i Dll1 och Notch1 proteinnivåer i stjärtfenan PSM som var uppenbar med denna metod. Istället visade stabil gradient av uttryck som är starkast i rostral regionen 9
Framtida Program eller Vägbeskrivning efter Mastering Technique
När detta protokoll har bemästrat, kan hög genomströmning expressionsanalys utföras för något protein av intresse i PSM.PSM explantat från ett flertal mus kullar kan bearbetas på en gång för att alstra det antal som krävs för analys med hög prov. Även om vi bara har använt embryon av vild typ i dessa studier, är det möjligt att utföra denna analys med användning av genetiskt modifierade embryon i syfte att bedöma betydelsen av en eller flera faktorer på proteinexpressions dynamik. Bortom PSM kan detta protokoll anpassas till andra system som är sammansatta av två kontralaterala halvor och kan användas för att varsamt detektera låg nivå proteinexpressions och oscillerande dynamik. Ett exempel på detta protokoll kan anpassas är studiet av dynamiska proteinuttryck i musen neuralrörsdefekter, eftersom kontra halvor kan genereras och odlas, och Notch aktivitet har visat sig vara både närvarande och viktig för mönstring 15. Vi uppmuntrar andra grupper för att anpassa detta protokoll till andra system och för att ge feedback för framtida förbättringar.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en MRC STUDENT till RAB, en MRC STUDENT till CSLB och WT projektbidrag till JKD (WT089357MA). Arbetet stöddes också av en Välkommen förtroende strategisk award (097.945 / Z / 11 / Z). Vi tackar Dr E. Kremmer för den typ gåva Dll1 antikropp och Dr. O. Pourquie för Lfng RNA-sond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 11320033 | |
| GlutaMAX™-1 (100x) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 35050 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10270106 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140122 | |
| anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^ | BD Pharmingen | 552466 | |
| anti-rat polyclonal Dll1 antibody^* | N/A | N/A | |
| Lfng intronic anti-sense RNA probe^* | N/A | N/A | |
| 16% paraformaldehyde | Pierce (ThermoFischer Scientific) | PI28908 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche (Sigma-Aldrich) | 31158 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Made in house | N/A | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Normal goat serum (NGS) (heat-treated) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 16210072 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFischer Scientific | H3570 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Saline-sodium citrate (SSC) | Sigma-Aldrich | 93017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | |
| tRNA | Roche (Sigma-Aldrich) | 101095 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Made in house | N/A | |
| Blocking Buffer Reagent | Roche (Sigma-Aldrich) | 11096176001 | |
| anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody | Roche (Sigma-Aldrich) | 11207733910 | |
| Tyramide signal amplification (TSA) kit | Perkin Elmer | NEL744001KT | |
| *The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources. | |||
| ^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader. | |||
References
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139 (4), Cambridge, England. 625-639 (2012).
- Krol, A. J., Roellig, D., et al. Evolutionary plasticity of segmentation clock networks. Development. 138 (13), Cambridge, England. 2783-2792 (2011).
- Dequéant, M. -L., Ahnert, S., et al. Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock. PLoS ONE. 3 (8), 2856 (2008).
- Bailey, C., Dale, K. Somitogenesis in Vertebrate Development. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-15 (2015).
- Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. Somitogenesis. Development. 139 (14), Cambridge, England. 2453-2456 (2012).
- Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock. Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).
- Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites. PLoS Genetics. 5 (9), 1000662 (2009).
- Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock. eLife. 4, 05842 (2015).
- Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis. Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).
- Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis. Cell. 149 (2), 295-306 (2012).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nature communications. 3, 1141 (2012).
- Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM. Development. 141 (24), Cambridge, England. 4806-4816 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), 160 (2007).
- Denkers, N., García-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos. Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).
- Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo. Development. 142 (13), Cambridge, England. 2291-2303 (2015).
