Summary
Un protocole est présenté pour la cristallographie aux rayons X en utilisant des microcristaux protéiques. Deux exemples analysant les microcristaux végétaux in vivo après purification ou en cellulo sont comparés.
Abstract
L'avènement de lignes de feu de microfocus de haute qualité dans de nombreuses installations synchrotron a permis l'analyse de routine de cristaux inférieurs à 10 μm dans leur plus grande dimension, ce qui représentait un défi. Nous présentons deux flux de travail alternatifs pour la détermination de la structure des microcristaux protéiques par cristallographie aux rayons X avec un accent particulier sur les cristaux cultivés in vivo . Les microcristaux sont soit extraits de cellules par sonication et purifiés par centrifugation différentielle, soit analysés en cellulo après triage cellulaire par cytométrie en flux de cellules contenant des cristaux. Facultativement, les cristaux purifiés ou les cellules contenant des cristaux sont trempés dans des solutions d'atomes lourds pour le phasage expérimental. Ces échantillons sont ensuite préparés pour des expériences de diffraction de manière similaire par application sur un support micromesh et refroidissement instantané dans de l'azote liquide. Nous décrivons brièvement et comparons les expériences de diffraction en série de microcristaux isolés et de cristaux-Contenant des cellules à l'aide d'une ligne de rayonnement synchrotron microfocus pour produire des jeux de données appropriés pour la mise au point, la construction de modèles et le raffinement.
Ces flux de travail sont illustrés par des cristaux de la polyhédrine Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) produits par l'infection de cellules d'insectes avec un baculovirus recombinant. Dans cette étude de cas, l'analyse cellulo est plus efficace que l'analyse des cristaux purifiés et donne une structure en ~ 8 jours de l'expression au raffinement.
Introduction
L'utilisation de la cristallographie aux rayons X pour la détermination des structures à haute résolution des macromolécules biologiques a connu une progression constante au cours des deux dernières décennies. L'adoption croissante de la cristallographie par rayons X par des chercheurs non experts illustre la démocratisation de cette approche dans de nombreux domaines des sciences de la vie 1 .
Historiquement, les cristaux ayant des dimensions inférieures à ~ 10 μm ont été considérés comme difficiles, sinon inutilisables, pour la détermination de la structure. La disponibilité croissante de rayons microfocus dédiés sur les sources de rayonnement synchrotron à l'échelle mondiale et les progrès technologiques, tels que le développement d'outils pour manipuler les microcristaux, ont éliminé une grande partie de ces barrières qui empêchaient l'utilisation étendue de la microcristallographie aux rayons X. Les progrès de la microcrystallographie en série X 2 , 3 et la diffraction micro-électronique 4 haNous avons montré que l'utilisation de micro et nanocristaux pour la détermination de la structure n'est pas seulement possible mais aussi parfois préférable à l'utilisation de gros cristaux 5 , 6 , 7 .
Ces progrès ont d'abord été appliqués à l'étude des peptides 8 et des cristaux naturels produits par les virus des insectes 9 , 10 . Ils sont maintenant utilisés pour une gamme variée de macromolécules biologiques, y compris les systèmes les plus difficiles tels que les protéines membranaires et les grands complexes 11 . Pour faciliter l'analyse de ces microcristaux, ils ont été analysés dans le méso , en particulier les protéines membranaires 12 et dans les puces microfluidiques 13 .
La disponibilité de ces nouvelles méthodes de microcristallographie a soulevé la possibilité d'utiliser enCristallisation vivante comme nouvelle voie pour la biologie structurale 14 , 15 , 16 offrant une alternative à la cristallogénèse classique in vitro . Malheureusement, même lorsque des cristaux in vivo peuvent être produits, plusieurs obstacles demeurent tels que la dégradation ou la perte de ligands lors de la purification des cellules, la difficulté de manipulation et de visualisation des cristaux à la ligne du synchrotron et des expériences fastidieuses de diffraction des rayons X. Comme une alternative, les cristaux ont également été analysés directement dans la cellule sans aucune étape de purification 17 , 18 , 19 . Une analyse comparative suggère que, dans les approches cellulo , peut être plus efficace que l'analyse des cristaux purifiés et produire des données de résolution supérieure 20 .
Ce protocole est enOnt tendance à aider les chercheurs nouveaux à la microcristallisation des protéines. Il fournit des méthodologies axées sur la préparation et la manipulation des échantillons pour les expériences de diffraction des rayons X à une ligne de rayonnement synchrotron. Deux options sont proposées en utilisant des cristaux isolés pour la microcristallographie classique ou des cellules contenant des cristaux triés par cytométrie de flux pour l'analyse cellulo ( Figure 1 ).
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Protocol
Note: La cristallisation in vivo a été signalée dans de nombreux organismes, y compris dans les bactéries, les levures, les plantes, les insectes et les mammifères (examinés dans la référence 21 ). La cristallisation de protéines recombinantes a également été réalisée en laboratoire en utilisant une transfection transitoire de cellules de mammifères et une infection par baculovirus de cellules d'insectes. Le protocole suivant a été développé en utilisant le gène de la polyhédrine Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) clone dans un baculovirus recombinant sous le promoteur de la polyédrine de baculovirus, généré selon les instructions de la référence 22 . Ainsi, bien que ce protocole puisse être adapté à d'autres types de cellules ( p. Ex. Cellules de mammifères), nous décrivons ici les procédures pour les cellules d'insectes. Le protocole suppose que la surexpression de la protéine d'intérêt a déjà été réalisée. Les méthodes pour la production d'un baculovirus recombinant et son utilisation pour l'expression de la protéine d'intérêt sont avSelon les références 23 , 24 , 25 , 26 , 27 .
1. Identification des cellules contenant du cristal
- Si les cellules sont cultivées en monocouche, inspectez-les directement dans le flacon. Si les cellules sont cultivées dans une culture liquide, utilisez le protocole suivant.
- À l'aide d'une pipette sérologique stérile, transférez 500 μL de cellules dans un tube à microcentrifugeuse. Veillez à ce que la stérilité de la culture principale soit maintenue; Manipuler les cellules dans un coffre de sécurité de classe II et suivre des techniques aseptiques standard.
- Pipeter 5 μL de cellules du tube de microcentrifugeuse sur une glissière en verre.
- Placez soigneusement une lamelle de verre sur le liquide, en évitant la formation de bulles d'air. Si la glissière ne peut pas être visualisée dans les 15 min, scellez la lamelle avec une graisse sous vide pour éviter l'évaporationAtion.
- Imagez le flacon ou glissez avec un microscope inversé. Si disponible, utilisez un contraste de phase et / ou une microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC). Les deux techniques améliorent le contraste dans les échantillons transparents et mettent l'accent sur les lignes et les arêtes, facilitant ainsi l'identification des cristaux in vivo .
- Examinez attentivement les cellules. Commencez par un grossissement de 200X et agrandissez-vous à un grossissement maximal lors de la détection d'un cristal potentiel. La présence de cristaux peut être suggérée indirectement par des changements dans la morphologie cellulaire ( Figure 2 ). Recherchez des bords tranchants et des changements de réfractivité (si vous utilisez un contraste de phase ou DIC). Les cristaux in vivo connus adoptent différentes formes, y compris des tiges, des piles d'aiguilles, des cubes, des pyramides et des polyèdres (voir la figure 2 et le tableau 1 pour quelques exemples).
Note: La proportion de cellules contenant des cristaux sera différente dans chaque cas et peut être visibleN varie entre les préparations, mais en général on ne devrait pas s'attendre à trouver des cristaux dans toutes les cellules. De même, le nombre de cristaux par cellule est également variable (voir le tableau 1 ), et plus d'un cristal peut être trouvé dans une seule cellule. Ces facteurs doivent être optimisés dans la mesure du possible en ajustant la multiplicité des infections, en modifiant la durée d'expression et en variant la construction de protéines. D'une part, les conditions d'expression des protéines et la croissance cellulaire qui maximisent le nombre de cellules contenant des cristaux améliorent la productivité ( par exemple, une multiplicité d'infection élevée et une récolte tardive de la culture cellulaire). D'autre part, les conditions dans lesquelles les cellules contiennent un cristal unique facilitent la collecte de données ( par exemple, une faible multiplicité d'infection). Compte tenu de l'enrichissement apporté par le tri de flux décrit à l'étape 2.2, nous recommandons de viser des cristaux plus grands ( par exemple, un cristal unique par cellule), même si la proportion de cellules contenant des cristaux est faible. - Si le cristalS sont identifiés, enregistrent leur position (lors de l'imagerie monocouche dans un flacon), et estiment le pourcentage de cellules contenant des cristaux. Si disponible, utilisez un microscope équipé d'une caméra capable de suivre les changements à un seul niveau de cellule.
- Pour les cellules en suspension, déterminer le degré de viabilité cellulaire suivant le protocole détaillé dans la référence 28 . Pour les cellules cultivées dans une monocouche, estimer par inspection visuelle le degré approximatif de confluence et la quantité de cellules détachées.
- Surveiller la croissance des cristaux, la croissance cellulaire et la viabilité deux fois par jour.
- Récolte les cellules dès que la croissance des cristaux semble s'arrêter. Pour des cristaux remarquablement robustes comme les polyèdres virales, les temps d'incubation prolongés (> 4 jours) augmentent le nombre de cristaux importants. Cependant, pour les cristaux de protéines typiques, nous recommandons de récolter des cellules lorsque la viabilité descend en dessous de 80% pour prévenir les dommages causés par la lyse cellulaire.
- Retirez le flacon de l'incubateur et passez àÉtape 2.2 dès que possible. Gardez les cellules sur glace pendant les étapes suivantes, sauf indication contraire.
2. Purification de l'échantillon
Note: Nous décrivons deux méthodes d'analyse des cristaux in vivo à partir de cristaux purifiés et en cellulo , respectivement.
- Purification des cristaux
Note: Sauf s'il existe des preuves que les cristaux d'intérêt sont sensibles aux basses températures, travaillent sur de la glace et utilisent des tampons glacés pour éviter la dégradation des cristaux.- Pipeter 50 mL de cellules Sf9 infectées dans un tube de centrifugeuse conique de 50 mL. Cela représente ~ 4 x 10 8 cellules dans une expérience typique.
- Cellules de pastilles à 450 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 40 ml de solution salée tamponnée au phosphate refroidi (PBS), pH 7,4.
Note: PBS est proposé comme point de départ pour la purification en tant que tampon isotonique standard dans le but de mimerIcking l'environnement cellulaire où les cristaux in vivo ont augmenté. Il a été utilisé pour la plupart des cristaux in vivo cultivés en culture cellulaire jusqu'à la date 9 , 14 , 29 . En variante, les milieux DMEM ont également été utilisés avec succès dans la purification de cristaux in vivo à partir de cellules de mammifères 19 . Si les cristaux souffrent visiblement de leur transfert dans le PBS ou présentent une mauvaise diffraction, ce paramètre devrait être étudié comme une source potentielle de dégradation. - Sonicate la pastille remis en suspension pendant 30 s à 10 mA en utilisant un sonicateur équipé d'une sonde de 19 mm. Pour éviter de chauffer l'échantillon, placez-le dans un bécher rempli de glace lors de la sonication. La perturbation chimique ou mécanique des cellules peut être utilisée comme alternative si les cristaux semblent être endommagés par sonication comme évalué à l'étape 2.1.7.
- Centrifuger à 450 xg pendant 10 min à 4 ° C. Après centrifugation, 2 couches sont apparentes:Une couche supérieure de débris cellulaires, qui est brun pâle, et une pastille inférieure de cristaux de polyédrine, blanc et crayeux.
- Jeter le surnageant et enlever la couche supérieure par un pipetage prudent. Respêtez le culot inférieur dans 40 mL de PBS refroidi.
- Évaluer la qualité des échantillons par imagerie à l'aide d'un microscope optique.
- Pipeter 5 μL de cellules ou des cristaux purifiés sur une glissière de verre. Cela peut être fait à température ambiante.
- Placez soigneusement une lamelle de verre sur le liquide, en évitant la formation de bulles d'air.
- Image la diapositive avec un microscope inversé à un grossissement de 200X. Image de l'échantillon dans les 15 minutes de sa préparation sur la diapositive. Si la glissière ne peut pas être visualisée dans les 15 min, scellez la lamelle avec de la graisse sous vide pour éviter l'évaporation.
NOTE: Dans le cas des polyèdres, les cristaux apparaîtront comme des cubes réfléchissants de ~ 1 à 10 μm par côté. Vérifier l'intégrité des cristaux à la recherche de signes de perte de netteté( P. Ex. Bords arrondis), fissures ou dissolution. Surveillez également la présence de débris cellulaires qui apparaîtront comme des touffes et des objets de taille et de forme irrégulières.
- Répétez les étapes 2.1.5 à 2.1.7, réduisant de moitié le volume de PBS utilisé pour remettre en suspension la pastille à chaque cycle jusqu'à ce que les cristaux semblent exempts de débris. Remettre en suspension la pastille finale dans 1 ml de PBS refroidi et transférer les cristaux dans un tube de microcentrifugeuse. Conserver les cristaux purifiés à 4 ° C.
- Évaluer la concentration de cristaux en utilisant un hémocytomètre tel que décrit par le fabricant. Comptez les cristaux comme si vous comptiez des cellules.
Figure 3 : Microcristaux In Vivo Purifiés. Purification représentative des cristaux de la polyédrine BmCPV1 à partir de cellules d'insectes Sf9 montrant ( a ) des débris de cellules granulés et pleurentStals after sonication, et ( b ) gros plan sur les débris et les couches de cristal. La couche de débris peut être soigneusement remis en suspension dans le surnageant et éliminée pour une purification plus rapide des cristaux. ( C ) Image de microscopie optique de polyèdres purifiés. Barre d'échelle = 50 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Isolation des cellules contenant des cristaux par cytométrie en flux
Remarque: Pour faciliter la définition des portes dans la cytométrie en flux, il est recommandé de cultiver une culture témoin parallèlement à celle qui exprime la protéine d'intérêt. Cela peut se faire en infectant un flacon de cellules Sf9 avec un baculovirus recombinant non pertinent, ou en préparant des cellules mal infectées. Le tri et l'imagerie des échantillons sont généralement effectués à température ambiante.
ATTENTION: L'iodure de propidium est un cancérogène suspecté et devrait être manipuléavec soin.- Pipeter 4 mL de cellules Sf9 infectées - représentant ~ 3 x 10 7 cellules - dans un tube adapté à l'analyse de cytométrie en flux. Préparez également un deuxième tube avec un nombre équivalent de cellules Sf9 infectées par un baculovirus non recombinant.
- Ajouter l'iodure de propidium (PI) aux deux échantillons à une concentration finale de 1 μg / mL juste avant l'évaluation de la cytométrie en flux. Cette étape est nécessaire pour identifier les cellules mortes, les agglomérats et les débris qui peuvent altérer ou masquer la distribution cellulaire sur la parcelle de diffusion avant et latérale. Préparer des cellules PI de 1 mg / ml dans l'eau et conserver à 4 ° C protégé de la lumière.
- Appliquer les cellules sur un cytomètre de flux standard capable de tri des cellules en fonction de l'avant (FSC) et de la diffusion latérale (SSC). Analyser au moins 20 000 événements de l'échantillon témoin ( c'est -à- dire non contenant de cristaux). Après avoir éliminé les cellules mortes, les agglomérats et les débris de l'analyse, génère le diagramme FSC vers SSC.
- Analyser au moins 20 000Ts de l'échantillon contenant des cristaux. Comparez le tracé FSC à SSC avec le mock. Recherchez l'apparence d'une population distincte correspondant à des cellules contenant des cristaux. Généralement, les cellules avec des cristaux intracellulaires auront un SSC plus élevé en raison d'une augmentation de la complexité morphologique. Le FSC peut également augmenter si la croissance des cristaux entraîne une augmentation du volume de la cellule. Définissez les portes du trieur d'écoulement pour isoler les populations de cellules correspondant aux zones du diagramme de dispersion qui diffèrent de la parcelle simulée. Image des échantillons triés par microscopie optique comme décrit à l'étape 1 pour confirmer quelle population est associée à des cellules contenant des cristaux.
- En utilisant les portes définies à l'étape 2.2.4, trier les cellules contenant des cristaux dans PBS ou dans n'importe quel autre tampon isotonique. Enregistrez le nombre de cellules contenant des cristaux triées ainsi que le volume final pour faciliter les étapes ultérieures. Conservez les cellules triées sur glace ou à 4 ° C.
Remarque: dans une heure,> 300 000 polyèdres-conLes cellules de détection sont triées sur un trieur de cellule avec une buse de 100 mm (138 kPa avec une fréquence de 39 kHz). Cette quantité de cellules suffit à préparer> 1 000 maillages. - En suivant le protocole décrit à l'étape 2.1.7, imagez les cellules avec un microscope optique pour confirmer l'enrichissement en cellules contenant des cristaux. La préparation des échantillons pour la collecte des données devrait se faire le plus tôt possible après le tri des cellules car les cristaux peuvent se dégrader avec le temps ou être libérés en raison de la lyse cellulaire.
Figure 4 : Tri des cellules. Des diagrammes de diffusion de cytométrie de flux représentatifs de ( a ) des cellules non infectées (fausses), qui ne contiennent pas de cristaux, et ( b ) des cellules Sf9 infectées par un baculovirus recombinant surexprimant la polyédrine BmCPV1. Les différences dans le diagramme de diffusion entre les deux populations alGated de la population cellulaire contenant des cristaux (porte rouge, valeurs SSC élevées). Chaque parcelle représente 20 000 événements de tri. SSC: diffusion de lumière latérale; FSC: diffusion directe de la lumière. ( C ) Image microscopique optique d'une population représentative des cellules triées, montrant la présence de cristaux intracellulaires. Échelle = 50 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
3. Préparation d'échantillons pour la collecte de données
Remarque: Si les cellules ou les cristaux doivent être dérivés pour le protocole de suivi progressif expérimental décrit dans la section 3.1. Sinon, passez directement aux sections 3.2 pour les cristaux purifiés ou 3.3 pour l'analyse cellulo .
- Dérivation des microcristaux purifiés ou en cellulo
ATTENTION: consultez toutes les fiches signalétiques pertinentes (fiche signalétique) avant utilisation.La plupart des produits chimiques utilisés pour la mise en phase expérimentale sont extrêmement toxiques. Utilisez toutes les pratiques de sécurité appropriées, y compris l'utilisation d'une hotte chimique et d'un équipement de protection individuelle. Éliminer les déchets conformément à la politique de votre établissement.
Note: La nature des atomes lourds, leur concentration et leur temps d'incubation sont donnés à titre indicatif pour les cristaux de la polyédrine BmCPV1. Ces paramètres doivent être déterminés expérimentalement pour chaque nouvelle cible. La coloration ultérieure avec le bleu de trypan à l'étape 3.3.2 peut être omise si les cellules sont facilement colorées par le composé chimique utilisé pour le phasage.- Préparez des solutions saturées des atomes lourds souhaités (ou des solutions d'autres produits chimiques utilisés pour le phasage expérimental). Typiquement, des volumes inférieurs à 100 μL seront nécessaires pour chaque atome lourd. Retirer les sels et les débris non dissous par centrifugation à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à température ambiante.
- Préparer des parties aliquotes de ~ 50 000 cristauxOu des cellules triées par composé atomique lourd. Si le PBS n'est pas compatible avec le produit chimique utilisé pour la dérivatisation ( c.-à-d. Les formes précipitées et la solution devient trouble), granuler les cristaux à 4 000 xg pendant 3 min à température ambiante dans une microcentrifugeuse ou les cellules à 150 xg pendant 3 min, enlever le Surnageant et resuspendre doucement les cristaux ou les cellules dans 20 μL d'un tampon approprié. Répéter la granulation et la resuspension pour s'assurer qu'aucune trace de PBS ne reste. Ajustez le volume final à 20 μL pour toutes les aliquotes.
- Ajouter 20 μL de solution d'atome lourd ou autre composé chimique de choix aux cristaux ou aux cellules. La concentration optimale de l'atome lourd dépendra d'une combinaison de paramètres cellulaires (perméabilité, protéines hors cible ...) et la nature du cristal de la protéine d'intérêt. Comme point de départ, testez 3 concentrations différentes: saturation complète, 1 / 10e, 1 / 100e.
- Conservez les échantillons à 4 ° C pendant 3 jours maximum. Cristaux du polyhL'édrin sont très résistants et denses et nécessitent de longs trempettes pour incorporer les atomes lourds; Pour d'autres types de cristaux, la période d'incubation et la concentration d'atomes lourds devraient être déterminées expérimentalement. Des temps d'incubation trop courts ne permettront pas l'incorporation de quantités appropriées de l'atome lourd, alors que les temps d'incubation prolongés peuvent affecter l'intégrité des cristaux, abaissant ainsi leur qualité de diffraction ou même les dissolvant. Comme point de départ, essayez 3 temps d'incubation différents pour chaque solution d'atome lourd ( p. Ex. 1 min, 1 heure et nuit). La dérivatisation réussie est évaluée par l'analyse des données de diffraction comme décrit brièvement dans la section 5 et les références qui y sont mentionnées.
- Laver l'excès de solution d'atome lourd en granulant les cristaux à 4000 xg pendant 3 min à température ambiante dans une microcentrifugeuse, ou les cellules à 150 xg pendant 3 minutes, en éliminant le surnageant et en remontant doucement les cristaux ou les cellules dans 10 μL de tampon .
- Sur la base de la concentration en cristaux calculée à l'étape 2.1.9, ajuster la concentration à 10 7 cristaux / ml en diluant l'échantillon; Ou en granulant les cristaux à 4 000 xg pendant 3 min à température ambiante dans une microcentrifugeuse, en ajustant le volume final en enlevant le surnageant et en remettant en suspension doucement les cristaux.
- Si les échantillons sont censés être congelés à l'avance, refroidir l'expéditeur sec ou dewar avec de l'azote liquide. Préparer les flacons ou les rondelles, le cas échéant, et les refroidir avec de l'azote liquide.
- Remettre en suspension la pastille de cristal et appliquer une gouttelette de 0,5 μL de cristaux sur un micromesh par pipettage. Utilisez des mailles de 700 μm avec un carré de 25 μmLes trous comme point de départ. La zone de la maille n'est pas critique, mais une surface plus grande fournit plus de cristaux par maille et conduit à une évaporation plus lente pendant la préparation. La taille des trous doit être optimisée pour correspondre à la taille des cristaux de plus de 25 μm. Si nécessaire pour des études systématiques, des mailles indexées sont disponibles pour faciliter une analyse méthodique de grille lors de la collecte de données.
- Enlevez la plupart des excès de liquide en dégageant une mèche de papier. Les cristaux doivent être répartis uniformément sur le maillage, sans se toucher les uns les autres. Répétez l'étape 3.1.1. Pour optimiser la concentration de l'échantillon. Procédez rapidement et ne retirez pas trop du liquide. En l'absence de cryoprotecteur, le liquide s'évapore rapidement avec le risque de formation de cristaux de sel et / ou de perte du film.
- Ajouter un cryoprotecteur: pipeter 0,5 μL d'une solution d'éthylène glycol à 50% dans de l'eau sur la maille (la composition du cryobuffer doit être adaptée à l'échantillon, suggestions d'optimisation de cLe ryoprotectant se trouve dans la référence 30 ). Retirer l'excès de liquide en le débruant avec une mèche de papier. Contrairement à l'étape précédente, ici, le film restant de solvant devrait être aussi mince que possible pour réduire les effets de parallaxe qui compliquent le processus d'alignement entre le cristal, le chemin du faisceau et le goniomètre; Et pour minimiser l'arrière-plan causé par la diffusion des rayons X par le liquide dans le chemin du faisceau.
- Rafraîchissez immédiatement le micromesh dans de l'azote liquide et transférez-le dans un flacon ou une rondelle de robot, puis vers un expéditeur sec ou dewar pour le stockage.
- Préparation de micromesh avec des cellules contenant des cristaux
ATTENTION: L'utilisation d'azote liquide est associée à des dangers tels que l'asphyxie, les brûlures à froid, le feu dans une atmosphère enrichie en oxygène et une explosion. Veuillez consulter la gestion des risques et les pratiques de travail sécuritaires de votre établissement.- Transférer les cellules triées dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Basé sur la cellule cOunts enregistrés par le trieur de cellules, ajustez la concentration à 10 7 cellules / mL en diluant l'échantillon avec du PBS; Ou en granulant les cellules à 150 xg pendant 3 min à température ambiante dans une microcentrifugeuse, en ajustant le volume final en enlevant le surnageant et en remontant doucement les cellules.
- Mélanger les cellules avec un volume égal de solution de trypan bleu (0,4% p / v) jusqu'à une concentration finale de 0,2% p / v.
- Si les échantillons sont censés être congelés à l'avance, refroidir l'expéditeur sec ou dégainer avec de l'azote liquide. Préparer les flacons ou les rondelles, selon le cas, et les refroidir avec de l'azote liquide.
- Ressusciter doucement les cellules et pipeter 0,5 μL de cellules triées sur un micromesh.
- Retirer l'excès de liquide en le débruant avec une mèche de papier. Les cellules doivent être réparties uniformément sur le maillage, sans se toucher les unes les autres. Si vous n'utilisez pas de cryoprotecteur (étape 3.3.6), le film restant de solvant devrait être aussi mince que possible pour réduire les effets de parallaxe qui compliquentE le processus d'alignement entre le cristal, le chemin du faisceau et le goniomètre; Et pour minimiser l'arrière-plan causé par la diffusion des rayons X par le liquide dans le chemin du faisceau.
- En option, ajouter un cryoprotecteur aux cellules: pipeter 0,5 μL de 50% d'éthylène glycol, 50% de solution de PBS sur le maillage. La composition du cryobuffer doit être adaptée à l'échantillon; Des suggestions pour l'optimisation du cryoprotecteur se trouvent dans la référence 30 . Enlevez l'excès de liquide en dégageant une mèche de papier, en laissant seulement un mince film de solvant.
Remarque: L'omission de l'étape de cryoprotection n'a pas modifié la qualité de la diffraction des rayons X lorsque des cristaux de polyhédrine ont été analysés dans le cellulo , alors que cette étape était nécessaire pour les cristaux purifiés 20 . Cela s'applique uniquement à l'incubation des cellules avec une solution cryoprotectrice; L'échantillon devrait encore être analysé à 100K pour minimiser les effets des dégâts d'irradiation sur les cristaux. - ImmédiatementRefroidissez instantanément le micromesh dans de l'azote liquide et transférez-le à un flacon ou à une rondelle de robot, puis à un expéditeur sec ou à un stockage de dewar, selon le cas.
4. Collecte de données
Remarque: Les paramètres utilisés pour la collecte de données sont donnés à titre indicatif et devraient être optimisés pour chaque type de cristal et ligne de synchrotron.
- Recueillir des données sur une ligne de cristallographie en microfocus (voir la référence 7 pour une liste des lignes de feu de microfocus et leurs caractéristiques). Si disponible, utilisez un faisceau collimaté qui correspond à la taille des cristaux.
- Pour la mise en phase expérimentale par la méthode de dispersion anormale à une seule longueur d'onde (SAD), rassemblez-vous à une énergie qui maximise le signal anormal du gros atome de choix. Pour la mise en phase à l'aide de la méthode de remplacement isomorphe multiple (MIR), rassemblez-vous au-dessus de l'énergie d'un bord d'absorption approprié pour l'atome lourd de choix (disponible à http://skuld.bmsc.washington.edu/scAtter / AS_periodic.html).
- Après avoir chargé le maillage sur le goniomètre, commencez par centrer le micromesh avec le chemin du faisceau en utilisant les orientations face (côté convexe) et les orientations latérales. Ensuite, avec le micromesh face-on, affinez l'alignement en alignant le centre d'une voie horizontale particulière du micromesh (par exemple, commencez par le central). Ensuite, collectez les données le long de cette voie horizontale avec des réajustements mineurs à l'alignement. Si disponible, utilisez le centrage basé sur le rastering à la diffraction des rayons X à faible dose pour affiner l'alignement (consultez le contact local à la ligne du synchrotron).
Note: Comme une quantité limitée de données peut être collectée sur les microcristaux en raison de dégâts d'irradiation (généralement, 10 à 30 images avec une oscillation de 1 °), en théorie, le cristal doit seulement être aligné avec le chemin du faisceau pendant 10 à 30 °. Cependant, il est essentiel que l'alignement soit précis car le cristal peut facilement être manqué par le microbeam (généralement collimaté à un diamètreEr de ~ 10 μm ou moins). - Collectez les données de diffraction jusqu'à ce que la diffraction soit perdue en raison de dommages causés par le rayonnement. Pour les cristaux de la polyédrine, le temps d'exposition de 10 secondes est généralement utilisé pour une oscillation de 1 ° pour un flux d'environ 3,6 x 10 11 photons / s à 13 keV avec un détecteur CCD (dose totale <30 MGy). Optimisez ces paramètres en fonction de la ligne de faisceau et de la nature du cristal utilisé. En particulier, des doses faibles et des tranches fines sont recommandées pour les détecteurs de rayons X en pixels.
Remarque: Si vous utilisez la stratégie cellulo , les cellules colorées avec du bleu trypan apparaîtront comme des points bleus contre le fond de support, ce qui les rend plus faciles à aligner sur le faisceau. Si le microbeam collimaté a approximativement la même taille que les cellules (~ 10 μm), tous les cristaux contenus dans une cellule seront éclairés simultanément. Pour les cellules contenant de multiples microcristaux, cela conduit à l'observation de multiples diagrammes de diffraction, qui peuvent être difficiles à traiter. Cependant, diLa ffraction d'un des cristaux tend souvent à dominer le diagramme de diffraction et est préférentiellement indexée pendant le traitement de données. Pour les lignes de faisceau avec un faisceau de rayons X significativement plus petit que la cellule, le raster à très faible flux de rayons X (> 95% d'atténuation) devrait être utilisé pour centrer sur un seul cristal avant la collecte des données. - Passez au prochain cristal dans la voie.
- Une fois que tous les cristaux de la voie ont été testés, passez à la voie suivante et répétez la procédure d'alignement. Continuez jusqu'à ce que des données suffisantes aient été collectées ou que tous les cristaux aient été testés.
- Assurez-vous que les voies qui ont été traitées sont clairement identifiées de sorte que les cristaux ne sont pas manqués ou tirés deux fois (si nécessaire, dessinez un croquis). Typiquement, le bleu de trypan devient jaune après que la cellule a été irradiée, ce qui peut être utilisé comme marqueur.
Figure 5 : Stratégie de collecte de données à partir d'échantillons sur le support de Micromesh. (A) la stratégie de collecte de données par piste; L'alignement se fait au début de chaque voie (points) et les données sont collectées le long de la voie. ( B ) Gros plan d'une cellule contenant des cristaux contenant du bleu de trypan sur un maillage, comme on le voit sur l'écran de la feuille de microcristallographie. ( C ) Gros plan d'un polyèdre purifié sur une maille, comme on le voit sur l'écran de la feuille de microcristallographie. Les carrés de maille sont de 25 μm x 25 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
5. Traitement des données
REMARQUE: ici, nous ne mentionnons que brièvement les étapes du traitement des données spécifiques à la microcristallographie en série, où les données provenant de multiples cristaux sont fusionnées. Beaucoup d'articles excellents sontDisponible décrivant le traitement des données en profondeur 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 et la détermination de la structure dépasse la portée de ce protocole.
- Sélectionnez le cristal avec la meilleure résolution de diffraction et la qualité en tant que référence.
- Procurez-vous individuellement chaque cristal en utilisant des paquets de cristallographie standard tels que HKL-2000 31 , Mosflm 32 ou XDS 33 . Pour s'assurer que les dégâts causés par les rayonnements ne détériorent pas la qualité de l'ensemble de données, sélectionnez soigneusement la dernière image avec des dégâts d'irradiation acceptables. Les critères de coupure indiquant des dégâts d'irradiation excessifs sont spécifiques à chaque type de cristal, à la pratique de traitement et au but de l'expérience. Pour la mise en phase des cristaux de polyédrine BmCPV1, les données ont été rejetées une fois que le signal-à-nOise <I> / <σ (I)> par image est tombé en dessous de 2 ou le symbole R a dépassé 50% comme indiqué par HKL-2000 31 .
- Pour chaque cristal, définissez la limite de résolution et le nombre de trames et retracez avec les paramètres appropriés pour éviter d'intégrer des données avec peu ou pas de signal.
- Échelle et fusionnez les données des meilleurs cristaux au ou aux cristaux de référence en utilisant des paquets standard tels que Scalepack dans HKL-2000 31 , SCALA dans CCP4 34 , 35 ou XSCALE dans XDS 33 . Ajouter les données des différents cristaux progressivement tout en surveillant la qualité globale de l'ensemble de données, idéalement jusqu'à ce que l'ensemble de données atteigne une exhaustivité acceptable (> 95%). Rejeter les cristaux qui présentent un faible isomorphisme avec le meilleur cristal de référence détecté par les différences dans les paramètres de la cellule unitaire et la mauvaise fusion R / chi-carré par image. Si trop de jeux de données de bonne qualitéNe pas étaler avec le (s) cristal (s) de référence, utilisez un programme comme le BLEND 36 qui contient un cluster hiérarchique pour définir la meilleure combinaison d'ensembles de données à fusionner.
Remarque: Dans certains groupes spatiaux, les options d'indexation alternatives doivent être testées pour correspondre au cristal de référence. - Procédez au phasage expérimental, au remplacement moléculaire ou au raffinement en utilisant des paquets standard de cristallographie.
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Representative Results
Un aperçu des deux méthodes alternatives pour la détermination de la structure à l'aide de microcristaux in vivo est présenté ( figure 1 ). Les polyèdres peuvent être facilement purifiés par sonication et centrifugation. En raison de leur densité, ils forment une couche au bas du tube sous une couche de débris qui peut être enlevée par pipettage ( Figure 3a et 3b ). L'échantillon est ensuite soumis à plusieurs cycles de sonication et se lave jusqu'à obtention d'un niveau de pureté suffisant, comme l'ont jugé l'aspect blanc et crayeux de la pastille ( Figure 3c ).
Pour l'approche intracellulo , le profil de cytométrie en flux de cellules non infectées est comparé au profil des cellules contenant des cristaux et utilisé pour déterminer quelle population cellulaire devrait être sélectionnée pour trier les cellules contenant des cristaux à l'écart deLes autres cellules ( Figure 4 ). Dans cet exemple, les cellules contenant des polyèdres ont une diffusion latérale plus élevée que les cellules non infectées. D'autres différences dans les schémas de diffusion peuvent être observées pour d'autres types de cristaux et la fermeture devrait être modifiée en conséquence.
Les microcristaux purifiés ou les cellules contenant des cristaux sont pipetés sur un micromesh ( figure 5 ). Les cellules colorées au bleu de trypan peuvent être visualisées facilement à l'aide de caméras disponibles à la plupart des lignes de transmission du synchrotron ( figure 5b ), tandis que les cristaux purifiés sont laborieux à identifier et à aligner avec le rayon X en raison de leur petite taille ( Figure 5c ). Lors de la collecte de données, il est préférable de procéder à un modèle de grille afin de minimiser les procédures de centrage et d'éviter d'exposer deux fois la même cellule ou le même cristal, ou en manque ( Figure 5a ). Collecte de donnéesTed doit être traité avec soin pour tenir compte des différences dans les limites de diffraction, l'effet des dégâts d'irradiation et un éventuel manque d'isomorphisme.
Figure 1 : Vue d'ensemble de deux méthodes de détermination de structure utilisant des microcristaux In Vivo . Les microcristaux sont produits en culture cellulaire par surexpression de la protéine d'intérêt en utilisant un système d'expression recombinant. Dans des cas spécifiques, les microcristaux peuvent également être produits naturellement par les cellules dans des conditions particulières. La rangée supérieure montre l'approche classique où les cellules sont lysées et les cristaux sont purifiés par centrifugation différentielle. Les microcristaux purifiés sont pipetés sur un micromesh. Après élimination de l'excès de liquide, une solution de cryoprotecteur est ajoutée, l'excès de liquide est de nouveau effacé et le maillage est refroidi par flash. Pour les rayons X Les expériences de fraction, les cristaux sont soigneusement alignés avec le faisceau de rayons X, ce qui peut être l'étape de limitation des taux dans la collecte de données. La ligne inférieure présente l'approche cellulo . Les cellules sont triées par cytométrie de flux pour sélectionner spécifiquement des cellules contenant des cristaux. Les cellules sont colorées avec du bleu trypan pour faciliter la visualisation et se propager sur un micromesh. Dans ce cas, l'ajout d'un cryoprotecteur est facultatif. Pour les expériences de diffraction des rayons X, les cellules sont facilement visualisées en utilisant des caméras typiques disponibles aux lignes de transmission du synchrotron facilitant le processus de centrage.
Image du système de chromatographie liquide automatisée avec la permission de GE Healthcare AB, Uppsala, Suède. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
= "Xfig"> Figure 2 : exemples de microcristaux In Vivo . Exemples choisis de cristaux in vivo: ( a ) Cellules Sf9 avec polyèdres de cypovirus; ( B ) cellules LD652 avec sphéroïdes d'entomopoxvirus; ( C ) Bacillus thuringiensis avec cristaux Cry3A (flèche); ( D ) Cellules Sf9 avec des cristaux de trypanosoma brucei cathepsine B; ( E ) cellules Sf21 avec des cristaux de calcineurine (flèches); ( F ) Cellule monocouche COS7 avec PKA: cristaux Inka1; ( G ) cellules CHO avec des cristaux d'IgG. Reproduit à partir du 14 , 18 , 29 , 37 , 39 , 42 , avec autorisation. Barre d'échelle = 10 μm. Cliquez ici pour voir un grandEr version de ce chiffre.
Tableau 1: Résumé des cristaux In Vivo cultivés dans des cellules cultivées exprimant des protéines recombinantes. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole fournit deux approches pour analyser les microcristaux dans le but de faciliter l'analyse de très petits cristaux qui auraient été négligés par le passé.
Mesures critiques pour la purification du microcristal
Le protocole présenté a été optimisé en utilisant la polyhédrine Bombyx mori CPV1 exprimée dans les cellules Sf9 en tant que système modèle. Cependant, les microcristaux in vivo présentent une grande variabilité dans la résistance mécanique. Par exemple, les cristaux en forme d'aiguille de la cathepsine B cultivés dans des cellules d'insectes sont rigides et hautement résistants aux contraintes mécaniques et peuvent être purifiés en utilisant un protocole similaire à celui décrit ici 14 . D'autre part, les cristaux de luciférase de luciole, également cultivés dans des cellules d'insectes cultivées et avec une morphologie semblable à une aiguille, se dissolvent immédiatement après la lyse cellulaire 38 . Ainsi, le protocole d'extraction et de purification in vivoLes cristaux devront être adaptés selon une base d'erreur d'essai pour des cas particuliers, comme décrit aux étapes 1.3, 2a.3-4, 2b.4, 3.1.3-4 et 3.2a.5.
Pour les cristaux fragiles, la séparation (partielle) des débris cellulaires peut être obtenue par centrifugation à basse vitesse ( c.-à-d. 200 xg) ou addition d'un coussin de saccharose au fond du tube au lieu d'une sonication répétée. En règle générale, les échantillons de cristaux préparés pour la collecte de données de diffraction n'ont pas besoin d'être très purifiés. Ainsi, une purification rapide est préférable pour refroidir les cristaux avant qu'ils ne se décomposent.
Application aux microcristaux in vitro et in vivo
Bien que les deux protocoles soient ici illustrés par l'analyse de cristaux cultivés in vivo , la méthodologie peut être facilement utilisée pour les microcristaux cultivés dans des plateaux en cristal à partir de protéines recombinantes purifiées. Dans ceIl convient de tenir compte des modifications suivantes: i) le support de maille peut être utilisé pour récolter les microcristaux directement à partir de la goutte de cristallisation, plutôt que de les transférer par pipettage; Ii) étant donné que la quantité de cristaux peut être un facteur limitant, des précautions particulières devront être prises lors de la suppression de l'excès de liquide du support de maille, afin d'éviter l'élimination excessive des cristaux; Iii) différents tampons cryoprotecteurs devront être testés, comme c'est le cas dans la cristallographie conventionnelle (voir référence 30 ).
D'autre part, pour les cristaux en croissance in vivo , l'approche cellulo est fortement recommandée. Parce que les cellules sont plus faciles à visualiser et à manipuler que les cristaux purifiés, cette approche est plus efficace en termes d'utilisation du faisceau et plus accessible aux chercheurs ayant peu ou pas d'expérience en microcristallographie. Il est également plus approprié pour les cristaux fragiles qui peuvent être affectés par l'extraction et pur De la cellule en raison des changements dans l'environnement chimique, de la dilution des protéines environnantes et des dommages mécaniques. En outre, les cellules fournissent un environnement protecteur aux cristaux, ce qui soulève la nécessité d'ajouter un cryoprotecteur. L'omission du traitement de cryoprotection a précédemment été démontrée pour empêcher l'accumulation de défauts et amélioré l'isomorphisme entre les cristaux individuels, pour la collecte de données à température ambiante 40 . Le protocole cellulo contourne également l'exigence d'incubation en solution cryoprotectrice tout en permettant la collecte de données à la température cryogénique. Dans l'ensemble, la collecte de données de cellulo a deux avantages principaux: 1) il peut produire des données de meilleure qualité et plus haute résolution pour une période donnée de faisceau 20 ; Et 2) il maintient la protéine cristallisée dans un environnement cellulaire augmentant les chances de retenir un ligand biologiquement pertinent.
"> Limitations de la techniqueUne complication intrinsèque de la microcristallographie en série est le nombre important d'ensembles de données partielles générés lors de la collecte de données. Par conséquent, le traitement des données devient un processus de plus en plus long. Cependant, le flux de travail de base pour le traitement des données peut être automatisé en grande partie. Par exemple, la sélection optimale des cristaux isomorphes peut être déterminée par une analyse hiérarchique des grappes 28 , par exemple mise en oeuvre dans le mélangeur 36 . En outre, les programmes développés pour l'analyse des lasers à électrons sans rayons X (XFEL) peuvent également être adaptés pour traiter les données de microcristallographie en série collectées sur les lignes de synchronisation 2 du synchrotron et, dans certaines lignes de faisceau, la trame automatisée de la détection des mailles et des cristaux a été mise en place en facilitant grandement la production en série Collecte de données 2 , 41 .
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier Chan-Sien Lay pour avoir fourni des images de microcristaux purifiés, Daniel Eriksson et Tom Caradoc-Davies pour le soutien de la ligne MX2 du Synchrotron australien, et Kathryn Flanagan et Andrew Fryga de l'installation FlowCore à l'Université Monash pour leur Aide inestimable.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1 L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50 mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50 mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19 mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
References
- Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 0(2014).
- Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2 (0), e01345 (2013).
- Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M.
- Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
- Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
- Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
- Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
- Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
- Gallat, F. -X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
- Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
- Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
- Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
- Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
- Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
- Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).
- Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
- Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
- Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
- Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
- Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
- Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
- Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).
- Kabsch, W.
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).
- Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
- Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
- Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
- Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
- Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
- Nass, K. Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).
