Summary
タンパク質微結晶を用いたX線結晶解析のためのプロトコールが提示されている。精製後又はcelluloにおける微結晶-grown インビボで分析する2つの例が比較されます。
Abstract
多くのシンクロトロン施設で高品質のマイクロフォーカスビームラインが出現したことにより、最大の次元で10μm以下の結晶の日常的な解析が可能になりました。本発明者らは、X線結晶学によるタンパク質微結晶の構造決定のための2つの代替のワークフローを提示し、特にin vivoで成長した結晶に焦点を当てる。微結晶は、超音波処理によって細胞から抽出され、微分遠心分離によって精製されるか、または結晶含有細胞のフローサイトメトリーによる細胞選別の後、セルロで分析される。場合によっては、精製された結晶または結晶含有セルを、実験段階的な調整のために重原子溶液に浸漬する。これらの試料は、マイクロメッシュ支持体上に塗布し、液体窒素中でフラッシュ冷却することにより同様の方法で回折実験用に調製する。我々は、単離された微結晶および結晶質結晶の連続回折実験を簡単に説明し、モデル構築および精密化に適したデータセットを生成するためにマイクロフォーカスシンクロトロンビームラインを使用している。
これらのワークフローは、昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させることによって産生されるBombyx mori cypovirus 1（BmCPV1）ポリヘドリンの結晶で例示される。このケーススタディでは、セルロ分析では精製された結晶の分析よりも効率的であり、発現から精製まで約8日間で構造が得られます。
Introduction
生物学的高分子の高分解能構造の決定のためのX線結晶学の使用は、過去20年間にわたり安定した進行を経験している。非専門家による研究者によるX線結晶学の益々の取り込みは、ライフサイエンスの多くの分野におけるこのアプローチの民主化を実証している1 。
歴史的に、約10μm以下の寸法を有する結晶は、構造決定のために使用できないとしても、困難であると考えられてきた。世界的なシンクロトロン放射源の専用マイクロフォーカスビームラインの利用可能性と、微結晶を操作するためのツールの開発などの技術的進歩により、X線マイクロ結晶の幅広い利用を妨げてきた多くの障壁が取り除かれました。シリアルX線microcrystallography 2,3及びマイクロ電子回折4ヘクタールの進歩構造決意用マイクロおよびナノ結晶の使用が可能でなく、大きな結晶5、6、7の使用に時々好ましくないだけであることが示されまし。
これらの進歩は、第一のペプチド8及び昆虫ウイルス9、10によって生成される天然の結晶の研究に適用しました。それらは現在、膜タンパク質や大きな複合体などの最も難しい系を含む多様な生物学的巨大分子に使用されています11 。これらの微結晶の分析を容易にするために、それらはメソ 、特に膜タンパク質12およびマイクロ流体チップ13において分析されている。
これらの新規な微結晶化方法の利用可能性は、古典的なインビトロ crystallogenesisに代わるものを提供する構造生物学14、15、16のための新たな経路として結晶体内。残念なことに、 インビボ結晶が産生されても、細胞からの精製中のリガンドの分解または喪失、シンクロトロンビームラインでの結晶の操作および視覚化の困難さ、退屈なX線回折実験などのいくつかの障害が残る。別の結晶はまた、任意の精製工程17、18、19せずに細胞内で直接分析されているように。比較分析はcelluloアプローチにおけるように精製された結晶およびより高い解像度20の収率データの分析よりも効率的であることを示唆しています。
このプロトコルはタンパク質微結晶学の新しい研究者を支援する傾向があった。それは、シンクロトロンビームラインでのX線回折実験のための試料調製および操作に焦点を当てた方法論を提供する。 2つの選択肢が、古典的な微結晶学のための単離された結晶またはフローサイトメトリーによってソーティングされた結晶含有細胞を用いて、セルロ分析で提案されている（ 図1 ）。
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Protocol
注： インビボでの結晶化は、細菌、酵母、植物、昆虫および哺乳類を含む多くの生物において報告されている（参考文献21で概説されている）。哺乳動物細胞の一過性トランスフェクションおよび昆虫細胞のバキュロウイルス感染を使用して、組換えタンパク質の結晶化も実験室で達成されている。参考文献22の指示に従って生成されたバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下で組換えバキュロウイルスにクローン化されたボンビクス・モリ・シポウイルス1（BmCPV1）ポリヘドリン遺伝子を用いて以下のプロトコールを開発した。したがって、このプロトコルは他の細胞型（ 例えば、哺乳動物細胞）に適合させることができるが、ここでは昆虫細胞のための手順を説明する。プロトコールは、目的のタンパク質の過剰発現が既に達成されていると仮定している。組換えバキュロウイルスの産生方法および目的のタンパク質の発現のためのその使用は、参照23、24でailable、25、26、27。
1.結晶含有細胞の同定
- 細胞を単層で培養する場合は、フラスコ内で細胞を直接検査してください。液体培養で細胞を増殖させる場合は、以下のプロトコールを使用します。
- 滅菌血清ピペットを使用して、500μLの細胞をマイクロ遠心チューブに移す。主な培養物の無菌性が維持されるように注意してください。クラスIIバイオセーフティーキャビネット内の細胞を処理し、標準的な無菌技術に従う。
- 微量遠心チューブから5μLの細胞をガラススライド上にピペットで移す。
- 気泡の形成を避けるために、注意深く液体にガラスカバースリップを置きます。 15分以内にスライドを視覚化できない場合は、真空を避けるためにカバーグラスを真空グリースで密封してくださいation。
- フラスコまたはスライドを倒立顕微鏡で画像化する。可能であれば、位相コントラストおよび/または微分干渉コントラスト顕微鏡（DIC）を使用する。どちらの手法も、透明なサンプルのコントラストを強調し、ラインとエッジを強調し、インビボ結晶の識別を容易にします。
- 慎重に細胞を調べる。潜在的な水晶を検出すると、倍率200倍から最大倍率でズームインします。結晶の存在は、細胞形態の変化によって間接的に示唆され得る（ 図2 ）。鮮明なエッジと屈折率の変化（位相コントラストまたはDICを使用する場合）を探します。既知のインビボ結晶は、ロッド、針、キューブ、ピラミッドおよび多面体のスタック（いくつかの例については図2および表1を参照）を含む様々な形状を採用する。
注：結晶を含む細胞の割合は、それぞれ異なる場合があり、前夜nは調製間で異なりますが、一般的にはすべての細胞に結晶が見られるはずはありません。同様に、細胞あたりの結晶の数も可変であり（ 表1参照）、1つの細胞内に複数の結晶が見出され得る。これらの因子は、感染の多重度を調整し、発現の長さを変え、タンパク質構築物を変化させることによって可能な限り最適化する必要がある。一方で、結晶含有細胞の数を最大にするタンパク質発現および細胞増殖の条件は、生産性（ 例えば感染のより高い多重度および細胞培養の後期収穫）を改善する。一方、細胞が単結晶を含む条件では、データ収集が容易になる（ 例えば 、感染多重度が低い）。ステップ2.2で説明したフローソーティングによる豊富化を考慮すると、結晶含有セルの割合が低い場合であっても、より大きな結晶（ 例えば 、セル当たり単結晶）を目指すことをお勧めします。 - もし結晶（フラスコ内のイメージング単層の場合）の位置を記録し、結晶含有細胞のパーセンテージを推定する。可能であれば、単一細胞レベルで変化を追跡することができるカメラを備えた顕微鏡を使用する。
- 懸濁液中の細胞については、参考文献28に詳述されたプロトコールに従って細胞生存度を決定する。単層で培養された細胞の場合、目視検査により、おおよそのコンフルエント度および分離した細胞の量を推定する。
- 結晶成長、細胞増殖および生存率を1日2回モニターする。
- 結晶の成長が止まるとすぐに細胞を採取する。ウイルス多面体のような非常に堅牢な結晶の場合、インキュベーション時間を長くする（> 4日間）と、大きな結晶の数が増加します。しかし、典型的なタンパク質結晶の場合、細胞溶解によって引き起こされる損傷を防ぐために生存率が80％以下に低下したときに細胞を採取することを推奨します。
- インキュベーターからフラスコを取り出し、可能な限り早い段階2.2。他に指定されていない限り、以下の手順で細胞を氷上に置いてください。
2.サンプルの精製
注：我々は、精製された結晶およびセルロースからの生体内結晶の2つの分析方法をそれぞれ説明する。
- 結晶の精製
注：目的の結晶が低温に敏感であるという証拠がない限り、氷上で作業し、結晶劣化を避けるために氷冷緩衝液を使用する。- 50mLコニカル遠心管内で50mLの感染Sf9細胞をピペットで吸引する。これは典型的な実験で約4×10 8個の細胞を表す。
- ペレット細胞を450xgで10分間、4℃でインキュベートする。
- 上清を捨て、ペレットを40mLの冷リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）（pH 7.4）に再懸濁する。
注：PBSは、標準的な等張緩衝液としての精製の出発点として、mim生体内の結晶が成長した細胞環境を蹴る。それは日付9、14、29に細胞培養で増殖させたインビボ結晶で最も使用されてきました。あるいは、DMEM培地は、哺乳動物細胞由来の生体内結晶の精製にも首尾よく用いられている19 。結晶がPBS中で転写されているかまたは貧弱な回折を示している場合、このパラメータは潜在的な分解源として調べる必要があります。 - 再懸濁したペレットを19mmプローブを備えた超音波処理器を用いて10mAで30秒間音波処理する。サンプルを加熱するのを避けるため、サンプルを超音波処理しながらビーカーに入れます。結晶がステップ2.1.7で評価したように超音波処理によって損傷しているように見える場合、化学的または機械的細胞破壊を代替として使用することができる。
- 4℃で10分間450xgで遠心分離する。遠心分離後、2つの層が明らかである：薄い茶色である細胞破片の上層、および白色で白っぽい多角形結晶のより低いペレットを含む。
- 上清を捨て、慎重なピペッティングにより上層を除去する。下のペレットを40mLの冷PBSで再懸濁する。
- 光学顕微鏡でイメージングすることによってサンプルの品質を評価する。
- 5μLの細胞または精製された結晶をガラススライド上にピペットで入れる。これは室温で行うことができます。
- 気泡の形成を避けるために、注意深く液体にガラスカバースリップを置きます。
- 倒立顕微鏡を200倍の倍率で画像化する。試料をスライド上で調製してから15分以内に画像化する。 15分以内にスライドを視覚化できない場合は、蒸発を避けるためにカバーグラスを真空グリースでシールしてください。
注記：多面体の場合、結晶は1辺あたり約1〜10μmの反射キューブとして現れます。結晶の完全性をチェックして、シャープネスの喪失の兆候を探します（ 例えば、丸い縁）、亀裂又は溶解を生じさせる。また、不規則な大きさと形状の塊や物体として現れる細胞破片の存在を監視する。
- 手順2.1.5から2.1.7を繰り返し、各サイクルでペレットを再懸濁するために使用されるPBSの体積を半分にして、結晶に残骸がなくなるまで繰り返す。最終ペレットを1mLの冷PBSに再懸濁し、結晶をマイクロ遠心チューブに移す。精製した結晶を4℃で保存する。
- 製造元の説明に従って、血球計算器を使用して結晶の濃度を推定する。細胞を数えるかのように結晶を数える。
図3 ：精製されたインビボ微結晶。 Sf9昆虫細胞からのBmCPV1ポリヘドリンの結晶の代表的な精製は、（ a ）ペレット状の細胞破片および泣き声（ b ）破片および結晶層の上にクローズアップすることができる。デブリ層は、上清に注意深く再懸濁し、より速い結晶精製のために廃棄することができる。 （ c ）精製多面体の光学顕微鏡画像。スケールバー=50μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
- フローサイトメトリーによる結晶含有細胞の単離
注：フローサイトメトリーでのゲートの定義を容易にするために、関心対象のタンパク質を発現するものと並行して対照培養物を増殖させることが推奨される。これは、Sf9細胞のフラスコに非関連組換えバキュロウイルスを感染させることによって、または模擬感染細胞を調製することによって行うことができる。試料の選別およびイメージングは、通常、室温で行われる。
注意：ヨウ化プロピジウムは発癌性が疑われ、取り扱いが必要です注意して。- フローサイトメトリー分析に適合したチューブ内に、〜3×10 7個の細胞を表す4mlの感染Sf9細胞をピペットで採取する。また、非組換えバキュロウイルスに感染した等価Sf9細胞数の第2のチューブを調製する。
- フローサイトメトリー評価の直前に、ヨウ化プロピジウム（PI）を両方のサンプルに1μg/ mLの最終濃度で添加する。このステップは、前方および側方散乱プロット上の細胞分布を変更または隠蔽する可能性のある死細胞、細胞塊および残骸を同定するために必要である。水中で1mg / mLのPIストックを調製し、光から保護された4℃で保存する。
- 順方向（FSC）および側方散乱（SSC）に従って細胞選別が可能な標準的フローサイトメーターに細胞を適用する。コントロール（ すなわち、非結晶含有）サンプルの少なくとも20,000事象を分析する。分析から死んだ細胞、細胞塊および破片を廃棄した後、FSCからSSCプロットを生成する。
- 少なくとも2万も分析するtsである。 FSCとSSCプロットをモックワンと比較する。結晶含有細胞に対応する別個の集団の出現を探す。典型的には、細胞内結晶を有する細胞は、形態学的複雑性の増加のためにより高いSSCを有する。結晶成長がセルの体積を増加させるならば、FSCもまた増加し得る。モックプロットとは異なる散布図の領域に対応する細胞集団を分離するためにフローソーターのゲートを定義する。どの集団が結晶含有細胞に関連しているかを確認するために、ステップ1に記載されているように光学顕微鏡でソートされたサンプルを画像化する。
- ステップ2.2.4で定義したゲートを用いて、PBSまたは他の等張緩衝液中で結晶含有細胞を選別する。次のステップを容易にするために、選別された結晶含有細胞の数および最終体積を記録する。選別した細胞を氷上または4℃で保存する。
注：1時間で、> 300,000>多面体細胞を100mmのノズル（周波数39kHzの138kPa）で細胞選別機で選別する。この量の細胞は、> 1000メッシュを調製するのに十分である。 - ステップ2.1.7で詳述したプロトコールに従い、細胞を光学顕微鏡で画像化して、結晶含有細胞の濃縮を確認する。細胞分取後にできるだけ早くデータ収集のための試料調製を行う必要があります。これは、結晶が経時的に分解したり、細胞溶解により放出されたりするためです。
図4 ：細胞ソーティング。結晶を含み、（b）は、Sf9細胞を過剰発現BmCPV1ポリヘドリンための組換えバキュロウイルスに感染していない（a）は、非感染細胞（モック）から散布代表的なフローサイトメトリー。 2つの集団間の散乱パターンの差異結晶含有細胞集団のゲート制御（赤ゲート、高いSSC値）。各プロットは20,000件のソートイベントを表します。 SSC：サイドライト散乱; FSC：前方光散乱。 （ c ）選別された細胞の代表的な集団の光学顕微鏡画像であり、細胞内結晶の存在を示す。スケール=50μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
3.データ収集のためのサンプル準備
注：細胞または結晶を実験段階的に誘導体化する場合は、3.1節で詳述したプロトコールに従う。そうでなければ、精製された結晶についてはセクション3.2に、セルロース分析についてはセクション3.3に直接進む。
- 精製微生物または微生物微生物の誘導体化
注意：使用前に関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。実験段階で使用される化学物質のほとんどは急性毒性です。化学フュームフードや個人用保護具の使用など、適切な安全慣行をすべて使用してください。あなたの施設のポリシーに従って廃棄物を処分してください。
注：重原子の性質、それらの濃度およびインキュベーション時間は、BmCPV1ポリヘドリンの結晶についての指標として示される。これらのパラメータは、新しいターゲットごとに実験的に決定する必要があります。細胞が段階的に使用される化合物によって容易に着色される場合、工程3.3.2におけるトリパンブルーによるその後の染色は省略することができる。- 所望の重原子の飽和溶液（または実験的なフェージングに使用される他の化学物質の溶液）を調製する。典型的には、各重原子について100μL未満の容量が必要となる。室温で5分間、マイクロ遠心分離機で最高速度で遠心分離することによって、溶解していない塩および残渣を除去する。
- 約50,000の結晶のアリコートを準備するまたは重原子化合物あたりの選別された細胞である。 PBSが誘導体化に使用される化学物質（ すなわち、沈殿形態および溶液が曇る）と適合しない場合、マイクロ遠心機で室温で3分間4,000xgで結晶をペレット化するか、または3分間150xgで細胞を除去し、上清を除去し、結晶または細胞を適当な緩衝液20μL中に静かに再懸濁する。 PBSの痕跡が残らないように、ペレット化および再懸濁を繰り返す。すべてのアリコートについて最終容量を20μLに調整する。
- 20μLの重原子溶液または選択した他の化合物を結晶または細胞に加える。重原子の最適濃度は、細胞パラメータ（透過性、オフターゲットタンパク質...）と関心のあるタンパク質の結晶の性質との組み合わせに依存する。出発点として、完全飽和、1 / 10e、1 / 100eの3種類の濃度をテストします。
- サンプルを4℃で3日間保管してください。多結晶の結晶エドリンは非常に抵抗性があり、稠密であり、重原子を組み込むためには長い浸漬が必要である。他のタイプの結晶については、インキュベーション時間および重原子の濃度を実験的に決定すべきである。短すぎるインキュベーション時間は、重い原子の適量の取り込みを可能にしないが、長いインキュベーション時間は、結晶の完全性に影響を与え、その結果、それらの回折品質を低下させ、またはそれらを溶解することさえある。出発点として、各重原子溶液（ 例えば、 1分、1時間および一晩）について3つの異なるインキュベーション時間を試みる。成功した誘導体化は、セクション5およびその中の参考文献で簡単に説明されるような回折データの分析によって評価される。
- ミクロ遠心分離機で室温で3分間、または150xgで3分間、4,000xgで結晶をペレット化して過剰の重原子溶液を洗い流し、上清を除去し、緩衝液10μL中の結晶または細胞を静かに再懸濁する。
- ステップ2.1.9で計算した結晶濃度に基づいて、サンプルを希釈することによって濃度を10 7結晶/ mLに調整する;室温でマイクロ遠心機で4,000×gで結晶をペレット化し、上清を除去して最終体積を調整し、穏やかに結晶を再懸濁させることにより、調製することができる。
- 試料があらかじめ凍結されることになっている場合は、乾燥した荷送人を冷却するか、液体窒素でデュアーしてください。バイアルまたはパックを適切に準備し、液体窒素で冷却します。
- 結晶ペレットを再懸濁し、0.5μLの結晶滴をピペットでマイクロメッシュに塗布する。 25μm角の700μmメッシュを使用穴を起点として。メッシュの面積は重要ではないが、より大きい面積はメッシュ当たりより多くの結晶を提供し、調製中の蒸発が遅くなる。穴のサイズは、25μmを超える結晶のサイズに合わせて最適化する必要があります。体系的な研究のために必要な場合は、データ収集中に体系的なグリッドスキャンを容易にするためにインデックス付きメッシュを利用できます。
- 過剰の液体の大部分はペーパーウィックで吸い取ります。結晶は、互いに触れることなく、メッシュ上に均等に広がるべきである。手順3.1.1を繰り返します。試料濃度を最適化するためのものである。速やかに処理し、液体を多量に除去しないでください。凍結防止剤が存在しない場合、液体は塩結晶の形成および/または膜の損失の危険性を伴い急速に蒸発する。
- 凍結保護剤を添加する：水中の50％エチレングリコール溶液0.5μLをメッシュ上にピペットで加える（クライオバッファーの組成は試料に適合させる; cリプロプロテクタントは参考文献30 ）に見出すことができる。余分な液体をペーパーウィックで吸い取って取り除きます。前のステップとは対照的に、ここでは溶媒の残りの膜は、結晶、ビーム経路およびゴニオメータ間の位置合わせのプロセスを複雑にする視差効果を低減するために、できるだけ薄くすべきである。ビーム経路内の液体によるX線の散乱によって引き起こされるバックグラウンドを最小にすることができる。
- 液体窒素中でマイクロメッシュを直ちにフラッシュクールし、バイアルまたはロボットパックに移し、次に貯蔵用に乾燥した荷送人またはデュアーに移す。
- 結晶含有セルを有するマイクロメッシュの調製
注意：液体窒素を使用すると、窒息、冷たい火傷、酸素が豊富な大気中の火災、爆発などの危険が伴います。あなたの施設のリスク管理と安全な職場慣行をご確認ください。- 選別した細胞を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移す。セルcに基づいて細胞ソーターで記録したオントをPBSで希釈することにより10 7細胞/ mLに調整する。またはマイクロ遠心分離機で室温で3分間150xgで細胞をペレット化し、上清を除去することによって最終容量を調整し、細胞を穏やかに再懸濁する。
- 等容積のトリパンブルー溶液（0.4％w / v）で細胞を最終濃度0.2％w / vになるように混合する。
- サンプルがあらかじめ凍結されることになっている場合は、乾燥した荷送人を冷やすか、液体窒素でデュアールしてください。必要に応じて、バイアルまたはパックを準備し、液体窒素で冷却します。
- 穏やかに細胞を再懸濁し、ソーティングした細胞0.5μLをマイクロメッシュにピペットで入れる。
- 余分な液体をペーパーウィックで吸い取って取り除きます。細胞は、互いに触れることなく、メッシュ上に均等に広がるべきである。凍結保護剤を使用しない場合（ステップ3.3.6）、溶剤の残りのフィルムは、視差効果を軽減するためにできるだけ薄くすべきである結晶とビーム経路とゴニオメータとの位置合わせのプロセス。ビーム経路内の液体によるX線の散乱によって引き起こされるバックグラウンドを最小にすることができる。
- 必要に応じて、凍結保護剤を細胞に添加する：0.5％の50％エチレングリコール、50％PBS溶液をメッシュ上にピペットで加える。クライオバッファの組成は試料に適合させなければならない。凍結防止剤の最適化のための提案は、文献30に見出すことができる。溶媒の薄いフィルムだけを残して、紙の芯で吸い取って余分な液体を除去する。
注：凍結保護工程を省略した場合、ポリヘドリンの結晶をセルロで分析したときのX線回折の品質は変化しなかったが、この工程は精製結晶20に必要であった。これは、凍結保護剤溶液との細胞のインキュベーションにのみ適用される;結晶が放射線損傷の影響を最小限に抑えるために、試料を100Kで分析しなければならない。 - Immediマイクロメッシュを液体窒素で急速に冷却し、バイアルまたはロボットパックに移し、次に適切な場合には乾燥した荷送人または保管用デュワーに移す。
4.データ収集
注：データ収集に使用されるパラメータはガイドとして与えられており、水晶のタイプとシンクロトロンビームラインごとに最適化する必要があります。
- マイクロフォーカス結晶線ビームライン上のデータを収集する（マイクロフォーカスビームラインおよびその特性のリストについては、参考文献7を参照）。可能であれば、結晶のサイズに合ったコリメートされたビームを使用します。
- 単一波長異常分散法（SAD）による実験的位相調整のために、選択した重原子の異常信号を最大にするエネルギーで収集する。多重同形置換法（MIR）を用いた整相では、選択した重原子の適切な吸収端のエネルギーよりも高いエネルギーを集める（http://skuld.bmsc.washington.edu/scで入手可能）。atter / AS_periodic.html）。
- ゴニオメーターにメッシュをロードした後、フェース・オン（凸面側）および側面オン・オリエンテーションを使用してビーム・パスでマイクロメッシュをセンタリングすることから始めます。次に、マイクロメッシュをフェイス・オンして、マイクロメッシュの特定の水平レーンの中心を揃える（たとえば中央から開始する）ようにアラインメントを微調整します。その後、この水平レーンに沿ってデータを収集します。可能であれば、アライメントを微調整するために、低線量X線回折のラスタリングに基づいてセンタリングを行います（シンクロトロンビームラインの現地の担当者に相談してください）。
注：放射線損傷（通常は1°振動で10〜30枚）のために微結晶で限られた量のデータを収集できるため、理論的には水晶は10〜30°の間ビーム経路に合わせるだけでよい。しかしながら、結晶がマイクロビームによって容易に見逃されることができるので、位置合わせが正確であることが重要である（一般に、直径にコリメートされる〜10μmまたはそれ以下）。 - 放射線損傷により回折が失われるまで回折データを収集する。ポリヘドリンの結晶については、CCD検出器（全照射量<30MGy）で13keVで約3.6×10 11光子/秒のフラックスに対して1°振動に10秒の曝露時間が典型的に用いられる。ビームラインと使用するクリスタルの性質に応じて、これらの設定を最適化します。特に、ピクセルX線検出器には低線量と細かいスライスが推奨されます。
注： セルロー戦略を使用している場合、トリパンブルーで染色された細胞はサポートバックグラウンドに対して青色の点として表示され、梁に合わせやすくなります。コリメートされたマイクロビームがセル（〜10μm）とほぼ同じ大きさであれば、セルに含まれるすべての結晶が同時に照射されます。複数の微結晶を含むセルの場合、これは複数の回折パターンの観察につながり、これは処理するのが難しい可能性があります。しかしながら、ジ結晶の1つからの回折は、しばしば回折パターンを支配する傾向があり、データ処理中に優先的に指標付けされる。セルよりもはるかに小さいX線ビームを有するビームラインについては、データ収集の前に、非常に低いX線フラックス（> 95％減衰）でのラスタリングを用いて単一の結晶を中心にすべきである。 - レーンの次の結晶に進みます。
- レーンのすべての結晶がテストされたら、次のレーンに進み、アライメント手順を繰り返します。十分なデータが収集されるまで、またはすべての結晶が試験されるまで続行する。
- 処理されたレーンが明確に識別され、水晶が欠落したり、2度ショットされたりしないようにします（必要な場合は、スケッチを描きます）。典型的には、細胞が照射された後、トリパンブルーは黄色に変わり、マーカーとして使用することができる。
5.データ処理
注記：ここでは、複数の結晶からのデータが結合されるシリアル微結晶学に特有のデータ処理の手順について簡単に触れます。多くの優れた記事があります深さ31、32、33、34、35、36および構造決意で使用可能な記述データの処理は、このプロトコルの範囲を超えています。
- 最高の回折解像度と品質を持つ結晶を基準として選択してください。
- HKL-2000 31 、Mosflm 32 、またはXDS 33などの標準的な結晶学的パッケージを使用して、個々の結晶を個別に処理します。放射線被害がデータセットの品質を低下させないように、許容可能な放射線被害を伴う最後の画像を慎重に選択してください。過度の放射線被害を示すカットオフ基準は、各クリスタルタイプ、処理プラクティスおよび実験の目的に特有のものである。 BmCPV1多角体結晶の位相調整のために、データを一旦信号対nHKL-2000 31で報告されているように、1イメージあたりのoise <I> / <σ（I）>が2未満に低下したか、またはR symが50％を超えました。
- 各クリスタルについて、解像度限界とフレーム数を定義し、信号をほとんどまたはまったく使用しないでデータを統合しないように、正しいパラメータで再処理します。
- そのようなHKL-2000 31でSCALEPACK、CCP4 34にSCALA、XDS 33における35又はXSCALEなどの標準パッケージを使用して、基準水晶（単数または複数）に最もよく結晶からデータをスケールとマージ。理想的には、データセットが許容可能な完全性（> 95％）に達するまで、データセットの全体的な品質を監視しながら、異なる結晶のデータを徐々に追加します。単位セルのパラメータの違いや画像ごとのR merge / chi-squareの不一致によって検出される最高/基準結晶の劣った同形を示す結晶を拒否する。あまりにも多くの良質のデータセットリファレンスクリスタルでスケールしない場合は、階層クラスタリングを実行するBLEND 36などのプログラムを使用して、マージするデータセットの最適な組み合わせを定義します。
注：一部のスペースグループでは、参照用クリスタルと一致するように別のインデックスオプションをテストする必要があります。 - 標準的な結晶学的パッケージを使用して、実験段階的、分子置換または精密化に進む。
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Representative Results
生体内微結晶を用いた構造決定のための代替方法の両方の概要が示されている（ 図1 ）。多面体は、超音波処理および遠心分離によって容易に精製することができる。密度のため、ピペットで取り除くことができる破片の層の下のチューブの底に層を形成する（ 図3aおよび3b ）。次いで、サンプルを数回の超音波処理およびペレットの白色および白亜面から判断されるように十分なレベルの純度に達するまで洗浄する（ 図3c ）。
イン・セルロ・アプローチでは、非感染細胞のフローサイトメトリー・プロファイルを結晶含有細胞のプロファイルと比較し、どの細胞集団を選択して結晶含有細胞を他の細胞（ 図4 ）。この例では、多面体を含む細胞は、非感染細胞よりも高い側方散乱を有する。散乱パターンの他の違いが他の結晶型で観察され、それに応じてゲーティングを修正する必要があります。
精製された微結晶または結晶含有細胞をマイクロメッシュ上にピペットで移す（ 図5 ）。トリプタンブルーで染色された細胞は、ほとんどのシンクロトロンビームライン（ 図5b ）で利用可能なカメラを使用して簡単に視覚化することができますが、精製されたクリスタルは小型であるためX線ビームを識別し整列させるのに手間がかかります（ 図5c ）。データを収集するときは、センタリング手順を最小限に抑え、同一の細胞または水晶を2回曝露しないようにするか、または何も欠損させることを避けるために、グリッドパターンで進めることが最善です（ 図5a ）。データ収集者回折限界の違い、放射線損傷の影響、同型異性の可能性の欠如を考慮して注意深く処理する必要があります。
図1 ： 生体内微結晶を用いた構造決定のための2つの方法の概要。微結晶は、組換え発現系を用いて目的のタンパク質を過剰発現させることにより、細胞培養において産生される。特定の場合には、微結晶はまた、特定の条件下で細胞によって自然に産生され得る。一番上の行は、細胞が溶解され、結晶が分画遠心分離によって精製される古典的アプローチを示す。精製された微結晶をマイクロメッシュ上にピペットで移す。過剰の液体を除去した後、凍結保護剤溶液を添加し、過剰の液体を再び吸い取り、メッシュをフラッシュ冷却する。 X線回折の場合結晶をX線ビームと慎重に整列させ、これはデータ収集における律速段階である可能性がある。一番下の行は、 セルロのアプローチです。細胞をフローサイトメトリーで選別して、結晶含有細胞を特異的に選択する。視覚化を容易にし、マイクロメッシュ上に広げるために細胞をトリパンブルーで染色する。この場合、凍結保護剤の添加は任意である。 X線回折実験では、センタリングプロセスを容易にするシンクロトロンビームラインで利用可能な典型的なカメラを使用して、細胞を容易に視覚化します。
スウェーデン、ウプサラのGE Healthcare ABによる自動液体クロマトグラフィーシステムのイメージこの図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
= "xfig">図2 ： 生体内微結晶の例。インビボ結晶の選択された例：（ a ）サイフォウイルス多面体を有するSf9細胞; （ b ）エンテロポックスウイルススフェロイドを有するLD652細胞; （ c ）Cry3A結晶を有するバチルス・チューリンゲンシス （矢印）; （ d ） Trypanosoma bruceiカテプシンB結晶を有するSf9細胞; （ e ）カルシニューリン結晶を有するSf21細胞（矢印）; （ f ）PKAを有するCOS7細胞単層：Inka1結晶; （ g ）IgG結晶を有するCHO細胞。許可を得て、14、18、29、37、39、42から再生されました。スケールバー=10μm。 ラージを表示するにはここをクリックしてくださいこの図の赤版です。
表1： 組換えタンパク質を発現する培養細胞で増殖したインビボ結晶のまとめ。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、過去に見過ごされていた非常に小さな結晶の分析を容易にする目的で、微結晶を分析する2つのアプローチを提供する。
微結晶の浄化のための重要なステップ
提示されたプロトコールは、モデル系としてSf9細胞で発現されたボンビクス・モリ CPV1ポリヘドリンを用いて最適化されている。しかしながら、 in vivo微結晶は、機械的耐性に大きなばらつきを示す。例えば、昆虫細胞中で増殖したカテプシンBの針状結晶は、剛性であり、機械的ストレスに対して高度に耐性であり、本明細書に記載されたものと同様のプロトコールを用いて精製することができる14 。一方、ホタルルシフェラーゼ結晶は、培養された昆虫細胞で同様の針状形態で増殖し、すぐに細胞溶解に溶解する38 。したがって、 インビボの抽出および精製のためのプロトコール結晶は、ステップ1.3,2a.3-4,2b.4,3.1.3-4および3.2a.5に記載されている特定のケースについて試行錯誤的に適合させる必要がある。
壊れやすい結晶の場合、細胞破片からの（部分的な）分離は、低速遠心分離（ すなわち 200×g）または反復超音波処理の代わりにチューブの底部にスクロースクッションを加えることによって達成され得る。一般的な規則として、回折データ収集目的のために調製された結晶サンプルは高度に精製される必要はない。従って、結晶が腐敗する前に低温冷却することが迅速な精製が好ましい。
インビトロ および インビボ 微結晶 への応用
両方のプロトコールは、ここではインビボで成長した結晶の分析で説明されているが、この方法は、精製された組換えタンパク質からの結晶トレイ中で増殖した微結晶に容易に使用することができる。それでi）メッシュ支持体は、ピペットで移すのではなく、結晶滴から微結晶を直接回収するために使用することができる。 ii）結晶の量が制限要因となる可能性があるので、過剰な液体をメッシュ支持体から吸い取って結晶の過剰な除去を避けるために特別な注意を払う必要がある。 iii）従来の結晶学（文献30参照）で行われているように、異なる凍結保護緩衝液を試験する必要がある。
一方、 生体内で成長した結晶では、セルロのアプローチが強く推奨されます。細胞は精製された結晶よりも視覚化および操作が容易であるため、このアプローチは、ビーム時間の使用に関してより効率的であり、微結晶化の経験がほとんどまたはまったくない研究者にとってよりアクセスしやすくなります。それはまた、抽出およびpurの影響を受け得る脆弱な結晶に、より適している化学的環境の変化、周囲のタンパク質の希釈および機械的損傷による細胞からの感染。さらに、細胞は結晶に保護環境を提供し、凍結保護物質の添加の必要性を緩和する。凍結保護処理の省略は、以前に欠陥の蓄積を防止することが示されており、室温でのデータ収集のために、個々の結晶間の同形性を改善した40 。 イン・セルロ・プロトコルはまた、凍結保護溶液中でのインキュベーションの必要条件をバイパスし、極低温でのデータ収集も可能にする。全体として、 セルロデータの収集には2つの主な利点があります.1）ビームタイム20の一定期間、より良い品質と高解像度のデータを生成することができます。 2）細胞環境において結晶化したタンパク質を維持し、生物学的に関連するリガンドを保持する機会を増やす。
ontent "> 技術の限界連続微結晶学の本質的な複雑さは、データ収集中に生成される重要な数の部分データセットである。結果として、データ処理はますます時間を要するプロセスとなる。ただし、データ処理の基本的なワークフローは大部分が自動化できます。例えば、同形結晶の最適な選択は、ブレンド36に実装され、例えば、階層的クラスター分析28によって決定することができます。さらに、X線自由電子レーザー（XFEL）の解析のために開発されたプログラムは、シンクロトロンビームライン2で収集されたシリアル微結晶学データを処理するために適合させることができ、メッシュおよび結晶検出の自動ラスタリングは、データ収集2、41。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
著者たちは、オーストラリアシンクロトロンのMX2ビームラインでの支援のために精製微結晶、Daniel ErikssonとTom Caradoc-Daviesの写真を提供するChan-Sien Layと、Monash UniversityのFlowCore施設からのKathryn FlanaganとAndrew Fryga貴重な援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1 L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50 mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50 mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19 mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
References
- Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 0(2014).
- Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2 (0), e01345 (2013).
- Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M.
- Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
- Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
- Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
- Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
- Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
- Gallat, F. -X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
- Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
- Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
- Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
- Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
- Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
- Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).
- Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
- Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
- Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
- Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
- Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
- Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
- Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).
- Kabsch, W.
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).
- Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
- Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
- Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
- Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
- Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
- Nass, K. Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).
