Summary
Um protocolo é apresentado para cristalografia de raios X usando microcristais de proteína. São comparados dois exemplos de análise de microcristos criados em vivo após purificação ou em celulósio .
Abstract
O advento de linhas de luz de microfoco de alta qualidade em muitas instalações de sincrotrona permitiu a análise de rotina de cristais menores que 10 μm em sua maior dimensão, o que representava um desafio. Apresentamos dois fluxos de trabalho alternativos para a determinação da estrutura de microcristais de proteínas por cristalografia de raios X com foco particular em cristais crescidos in vivo . Os microcristais são extraídos de células por sonicação e purificados por centrifugação diferencial, ou analisados em celulo após classificação celular por citometria de fluxo de células que contêm cristais. Opcionalmente, os cristais purificados ou as células que contêm cristais são embebidos em soluções de átomos pesados para a fase experimental. Essas amostras são então preparadas para experiências de difracção de maneira similar por aplicação em um suporte micromesh e refrigeração instantânea em nitrogênio líquido. Nós descrevemos e comparamos brevemente experiências de difracção em série de microcristais isolados e cristal-Contendo células usando uma linha de luz de sincrotron microfocus para produzir conjuntos de dados adequados para faseamento, modelagem e refinamento.
Esses fluxos de trabalho são exemplificados com cristais do poliedro Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) produzido por infecção de células de insetos com um baculovírus recombinante. Neste estudo de caso, a análise do cellulo é mais eficiente do que a análise de cristais purificados e produz uma estrutura em ~ 8 dias da expressão ao refinamento.
Introduction
O uso de cristalografia de raios-X para a determinação de estruturas de alta resolução de macromoléculas biológicas experimentou uma progressão constante ao longo das duas últimas décadas. A crescente aceitação da cristalografia de raios-X por pesquisadores não especializados exemplifica a democratização desta abordagem em muitos campos das ciências da vida 1 .
Historicamente, os cristais com dimensões abaixo de ~ 10 μm foram considerados desafiadores, se não inutilizáveis, para a determinação da estrutura. A crescente disponibilidade de linhas de feixe de microfoco dedicadas em fontes de radiação sincrotrona em todo o mundo e os avanços tecnológicos, como o desenvolvimento de ferramentas para manipular microcristas, eliminaram grande parte dessas barreiras que bloquearam o amplo uso da microcristalografia de raios-X. Avanços em microcristalografia serial em raios-X 2 , 3 e difração micro-eletrônica 4 haMostramos que o uso de micro e nanocristais para a determinação da estrutura não é apenas viável, mas também às vezes preferível ao uso de cristais grandes 5 , 6 , 7 .
Estes avanços foram primeiro aplicados ao estudo de péptidos 8 e cristais naturais produzidos por vírus de insetos 9 , 10 . Eles são agora utilizados para uma variedade diversificada de macromoléculas biológicas, incluindo os sistemas mais difíceis, como proteínas de membrana e grandes complexos 11 . Para facilitar a análise desses microcristais, eles foram analisados em meso , particularmente proteínas de membrana 12 e em chips de microfluídica 13 .
A disponibilidade dessas novas metodologias de microcristalografia aumentou a possibilidade de usar emCristalização in vivo como uma nova rota para biologia estrutural 14 , 15 , 16 oferecendo uma alternativa à cristalogênese clássica in vitro . Infelizmente, mesmo quando os cristais in vivo podem ser produzidos, vários obstáculos permanecem como a degradação ou perda de ligandos durante a purificação das células, a dificuldade na manipulação e visualização dos cristais na linha do sincrotrão e as tediosas experiências de difracção de raios X. Como os cristais alternativos também foram analisados diretamente dentro da célula sem qualquer passo de purificação 17 , 18 , 19 . Uma análise comparativa sugere que tal em abordagens de celulo pode ser mais eficiente do que a análise de cristais purificados e produzir dados de maior resolução 20 .
Este protocolo está emTendeu a auxiliar pesquisadores novos na microcristalografia protéica. Ele fornece metodologias com foco na preparação e manipulação de amostras para experiências de difracção de raios X em uma linha de luz de sincrotrona. Duas opções são propostas usando cristais isolados para microcristalografia clássica ou células contendo cristais classificadas por citometria de fluxo para análise celular ( Figura 1 ).
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Protocol
Nota: a cristalização in vivo tem sido relatada em muitos organismos, incluindo bactérias, leveduras, plantas, insetos e mamíferos (revisado na referência 21 ). A cristalização de proteínas recombinantes também foi conseguida no laboratório usando transfecção transitória de células de mamíferos e infecção por baculovírus de células de insetos. O protocolo a seguir foi desenvolvido utilizando o gene de poliedrina Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) clonado em um baculovírus recombinante sob o promotor de poliedrina de baculovírus, gerado de acordo com instruções na referência 22 . Assim, embora este protocolo possa ser adaptado a outros tipos de células ( por exemplo, células de mamíferos), descrevemos aqui os procedimentos para células de insetos. O protocolo assume que a expressão excessiva da proteína de interesse já foi alcançada. Os métodos para a produção de um baculovírus recombinante e a sua utilização para a expressão da proteína de interesse são avPossivel nas referências 23 , 24 , 25 , 26 , 27 .
1. Identificação de células que contêm cristais
- Se as células são cultivadas em monocamada, inspecione-as diretamente no frasco. Se as células são cultivadas em cultura líquida, use o seguinte protocolo.
- Usando uma pipeta serológica estéril, transfira 500 μL de células para um tubo de microcentrífuga. Tome cuidado para garantir a manutenção da esterilidade da cultura principal; Lidar com as células em um gabinete de biossegurança Classe II e seguir técnicas assépticas padrão.
- Pipetar 5 μL de células do tubo de microcentrífuga em uma lâmina de vidro.
- Coloque cuidadosamente um lamínula de vidro no líquido, evitando a formação de bolhas de ar. Se o slide não puder ser visualizado dentro de 15 minutos, selar a lamínula com graxa de vácuo para evitar evaporaçãoAtion.
- Imagem do balão ou deslize com um microscópio invertido. Se disponível, use contraste de fase e / ou microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC). Ambas as técnicas melhoram o contraste em amostras transparentes e enfatizam linhas e bordas, facilitando assim a identificação de cristais in vivo .
- Examine cuidadosamente as células. Comece com uma ampliação de 200X e amplie a ampliação máxima ao detectar um cristal potencial. A presença de cristais pode ser sugerida indiretamente por mudanças na morfologia celular ( Figura 2 ). Procure bordas afiadas e mudanças na refractividade (se estiver usando contraste de fase ou DIC). Os cristais conhecidos in vivo adotam formas diferentes, incluindo varas, pilhas de agulhas, cubos, pirâmides e poliedros (ver Figura 2 e Tabela 1 para alguns exemplos).
Nota: A proporção de células contendo cristais será diferente em cada caso e pode aparecerN variam entre os preparativos, mas, em geral, não se deve esperar encontrar cristais em todas as células. Da mesma forma, o número de cristais por célula também é variável (ver Tabela 1 ), e mais de um cristal pode ser encontrado em uma célula. Esses fatores precisam ser otimizados sempre que possível, ajustando a multiplicidade de infecção, alterando o comprimento de expressão e variando a construção da proteína. Por um lado, as condições de expressão protéica e crescimento celular que maximizam o número de células que contêm cristais irão melhorar a produtividade ( por exemplo, maior multiplicidade de infecção e colheita tardia da cultura celular). Por outro lado, as condições em que as células contêm um único cristal facilitam a coleta de dados ( por exemplo, baixa multiplicidade de infecção). Dado o enriquecimento trazido pela classificação de fluxo descrito no passo 2.2, recomendamos apontar para cristais maiores ( por exemplo, um único cristal por célula), mesmo que a proporção de células contendo cristais seja baixa. - Se o cristalS são identificados, gravar sua posição (quando imaginar monocamada em um frasco), e estimar a porcentagem de células que contêm cristais. Se disponível, use um microscópio equipado com uma câmera capaz de rastrear mudanças em um único nível de célula.
- Para células em suspensão, determine o grau de viabilidade celular seguindo o protocolo detalhado na referência 28 . Para células cultivadas em monocamada, estimar por inspeção visual o grau aproximado de confluência e quantidade de células separadas.
- Monitorar o crescimento de cristais, crescimento celular e viabilidade duas vezes ao dia.
- Colhe as células assim que o crescimento do cristal parece parar. Para cristais notavelmente robustos como poliedros virais, tempos de incubação prolongados (> 4 dias) aumentam o número de cristais grandes. No entanto, para cristais de proteínas típicos, recomendamos colher células quando a viabilidade cair abaixo de 80% para evitar danos causados pela lise celular.
- Remova o frasco da incubadora e vá paraPasso 2.2 o mais rápido possível. Mantenha as células em gelo durante as etapas a seguir, a menos que especificado de outra forma.
2. Purificação da amostra
Nota: descrevemos dois métodos de análise dos cristais in vivo a partir de cristais purificados e em células , respectivamente.
- Purificação de cristais
Nota: A menos que existam evidências de que os cristais de interesse são sensíveis a baixas temperaturas, trabalham no gelo e usam tampões gelados para evitar a degradação de cristais.- Pipetar 50 mL de células Sf9 infectadas em um tubo de centrífuga cônico de 50 mL. Isso representa ~ 4 x 10 8 células em uma experiência típica.
- Células de pelota a 450 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento em 40 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4.
Nota: PBS é proposto como ponto de partida para a purificação como um buffer isotônico padrão com o objetivo de mimIcking o ambiente celular onde os cristais in vivo cresceram. Foi utilizado para a maioria dos cristais in vivo cultivados em cultura celular até à data de 9 , 14 , 29 . Alternativamente, o meio DMEM também foi utilizado com sucesso na purificação de cristais in vivo a partir de células de mamíferos 19 . Se os cristais sofrem visivelmente de sua transferência em PBS ou apresentam fraca difração, este parâmetro deve ser investigado como uma fonte potencial de degradação. - Sonicate o sedimento ressuspenso durante 30 s a 10 mA usando um sonicador equipado com uma sonda de 19 mm. Para evitar o aquecimento da amostra, coloque-a em uma taça cheia de gelo enquanto se sonica. A interrupção das células químicas ou mecânicas pode ser usada como alternativa se os cristais parecerem estar danificados pela sonicação conforme avaliado no passo 2.1.7.
- Centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Após a centrifugação, são aparentes 2 camadas:Uma camada superior de detritos celulares, que é marrom pálido, e um pellet menor de cristais de poliedrina, que é branco e calcário.
- Descarte o sobrenadante e remova a camada superior por pipetagem cautelosa. Responde o sedimento inferior em 40 mL de PBS arrefecido.
- Avalie a qualidade das amostras por imagem com um microscópio de luz.
- Pipetar 5 μL de células ou cristais purificados sobre uma lâmina de vidro. Isso pode ser feito à temperatura ambiente.
- Coloque cuidadosamente um lamínula de vidro no líquido, evitando a formação de bolhas de ar.
- Imagem do slide com um microscópio invertido com uma ampliação de 200 x. Imagem da amostra dentro de 15 minutos da sua preparação no slide. Se o slide não puder ser visualizado dentro de 15 minutos, selar a lamínula com graxa de vácuo para evitar a evaporação.
NOTA: No caso dos poliedros, os cristais aparecerão como cubos refringentes de ~ 1 a 10 μm por lado. Verifique a integridade dos cristais à procura de sinais de perda de nitidez(Por exemplo, bordas redondas), rachaduras ou dissolução. Também monitora a presença de detritos celulares que aparecerão como aglomerados e objetos de tamanho e forma irregulares.
- Repita as etapas 2.1.5 a 2.1.7, reduzindo para metade o volume de PBS usado para ressuspender o sedimento em cada ciclo até os cristais aparecerem livres de detritos. Ressuspenda o sedimento final em 1 mL de PBS arrefecido e transfira os cristais para um tubo de microcentrífuga. Armazene os cristais purificados a 4 ° C.
- Estimar a concentração de cristais usando um hemocitómetro conforme descrito pelo fabricante. Conte cristais como se contassem células.
Figura 3 : Microcristais in vivo purificados. Purificação representativa de cristais do poliedro BmCPV1 de células de insetos Sf9 que mostram ( a ) detritos celulares granulados e choramStals após a sonicação, e ( b ) close-up sobre os detritos e camadas de cristal. A camada de resíduo pode ser cuidadosamente ressuspensa no sobrenadante e descartada para uma purificação de cristal mais rápida. ( C ) Imagem de microscopia óptica de poliedros purificados. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Isolamento de células contendo cristais por citometria de fluxo
Nota: Para facilitar a definição de portões em citometria de fluxo, recomenda-se cultivar uma cultura de controle em paralelo com a que expressa a proteína de interesse. Isto pode ser feito infectando um balão de células Sf9 com um baculovírus recombinante não relevante, ou preparando células simuladas. A triagem e a imagem das amostras geralmente são feitas à temperatura ambiente.
CUIDADO: O iodeto de propídio é um susceptível de carcinógeno e deve ser tratadocom cuidado.- Pipetar 4 mL de células Sf9 infectadas - representando ~ 3 x 10 7 células - em um tubo adaptado à análise de citometria de fluxo. Além disso, prepare um segundo tubo com um número equivalente de células Sf9 infectadas com um baculovírus não recombinante.
- Adicione iodeto de propídio (PI) a ambas as amostras a uma concentração final de 1 μg / mL imediatamente antes da avaliação citométrica de fluxo. Este passo é necessário para identificar células mortas, aglomerados de células e detritos que podem alterar ou mascarar a distribuição celular no gráfico de espalhamento direto e lateral. Prepare estoques de PI de 1 mg / mL em água e armazene a 4 ° C protegido da luz.
- Aplica células a um citómetro de fluxo padrão capaz de classificar as células de acordo com a frente (FSC) e a dispersão lateral (SSC). Analisar pelo menos 20.000 eventos da amostra controle ( ou seja, não contendo cristal). Depois de descartar células mortas, aglomerados de células e detritos da análise, gerar o traçado FSC para SSC.
- Analise pelo menos 20 mil pessoas atéSt da amostra contendo cristais. Compare o traçado FSC para SSC com o mock one. Procure a aparência de uma população distinta correspondente a células que contêm cristais. Tipicamente, as células com cristais intracelulares terão um SSC mais elevado devido ao aumento da complexidade morfológica. O FSC também pode aumentar se o crescimento do cristal provoca um aumento no volume da célula. Defina os portões do classificador de fluxo para isolar populações de células correspondentes às áreas do gráfico de dispersão que diferem da trama simulada. Imagem as amostras ordenadas por microscopia óptica como descrito no passo 1 para confirmar qual população está associada com células que contêm cristais.
- Usando os portões definidos no passo 2.2.4, classifique células contendo cristais em PBS ou em qualquer outro buffer isotônico. Registre o número de células contendo cristais ordenadas, bem como o volume final para facilitar as etapas subsequentes. Armazene as células ordenadas em gelo ou a 4 ° C.
Nota: em uma hora,> 300.000 poliedrosAs células detectadas são classificadas em um classificador de células com um bico de 100 mm (138 kPa com uma freqüência de 39 kHz). Essa quantidade de células é suficiente para preparar> 1.000 malhas. - Seguindo o protocolo detalhado no passo 2.1.7, crie as células com um microscópio de luz para confirmar o enriquecimento em células que contêm cristais. A preparação da amostra para a coleta de dados deve ser feita o mais rápido possível após a triagem celular, uma vez que os cristais podem se degradar ao longo do tempo ou serem liberados devido à lise celular.
Figura 4 : classificação celular. Parcelas de dispersão de citometria de fluxo representativas de ( a ) células não infectadas (simulação), que não contêm cristais, e ( b ) células Sf9 infectadas por um baculovírus recombinante exagerando para o poliedrina BmCPV1. Diferenças no padrão de dispersão entre as duas populações alGated da população de células contendo cristais (porta vermelha, valores elevados de SSC). Cada parcela representa 20.000 eventos de classificação. SSC: espalhamento de luz lateral; FSC: espalhamento de luz dianteira. ( C ) Imagem de microscopia óptica de uma população representativa das células classificadas, mostrando a presença de cristais intracelulares. Escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Preparação da amostra para coleta de dados
Nota: Se as células ou os cristais devem ser derivados para a fase experimental, siga o protocolo detalhado na seção 3.1. Caso contrário, vá diretamente para as seções 3.2 para cristais purificados ou 3.3 para análise celular .
- Derivatização de microcristais purificados ou em celulo
CUIDADO: Consulte todas as folhas relevantes de dados de segurança de material (MSDS) antes de usar.A maioria dos produtos químicos utilizados para a fase experimental são extremamente tóxicos. Use todas as práticas de segurança apropriadas, incluindo o uso de um exaustor químico e equipamento de proteção pessoal. Descarte os resíduos de acordo com a política da sua instituição.
Nota: A natureza dos átomos pesados, a sua concentração e o tempo de incubação são dados numa base indicativa para os cristais do poliedrina BmCPV1. Esses parâmetros devem ser determinados experimentalmente para cada novo alvo. A coloração subsequente com azul de tripano no passo 3.3.2 pode ser omitida se as células forem prontamente coloridas pelo composto químico utilizado para a fase.- Prepare soluções saturadas dos átomos pesados desejados (ou soluções de outros produtos químicos utilizados para a fase progressiva experimental). Tipicamente, serão necessários volumes inferiores a 100 μL para cada átomo pesado. Remova os sais e detritos não dissolvidos por centrifugação a velocidade máxima em uma microcentrífuga por 5 min à temperatura ambiente.
- Prepare alíquotas de ~ 50,000 cristaisOu células classificadas por composto de átomos pesados. Se PBS não é compatível com o produto químico utilizado para a derivatização (isto é, formação de um precipitado e a solução torna-se turva), sedimentar os cristais a 4000 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente numa microcentrífuga, ou as células a 150 xg durante 3 minutos, remover o Sobrenadante e ressuspender suavemente os cristais ou células em 20 μL de um tampão adequado. Repita a granulação e ressuspensão para garantir que ainda não haja vestígios de PBS. Ajuste o volume final para 20 μL para todas as alíquotas.
- Adicione 20 μL de solução de átomos pesados ou outro composto químico de escolha aos cristais ou células. A concentração ideal de átomos pesados dependerá de uma combinação de parâmetros celulares (permeabilidade, proteínas fora do alvo ...) e a natureza do cristal da proteína de interesse. Como ponto de partida, teste 3 concentrações diferentes: saturação total, 1 / 10e, 1 / 100e.
- Mantenha as amostras a 4 ° C por até 3 dias. Cristais do polímeroEdrin são muito resistentes e densos e requerem longos mergulhos para incorporar os átomos pesados; Para outros tipos de cristais, o período de incubação e a concentração de átomos pesados devem ser determinados experimentalmente. Os tempos de incubação muito curtos não permitirão a incorporação de quantidades adequadas do átomo pesado, enquanto os tempos de incubação prolongados podem afetar a integridade dos cristais, diminuindo assim a qualidade de sua difração ou mesmo dissolvendo-os. Como ponto de partida, experimente 3 tempos de incubação diferentes para cada solução de átomos pesados ( por exemplo, 1 min, 1 h e durante a noite). A derivação eficaz é avaliada por análise de dados de difracção como descrito sucintamente na seção 5 e referências nele contidas.
- Lavar o excesso de solução de átomos pesados através da granulação dos cristais a 4.000 xg durante 3 min a temperatura ambiente numa microcentrífuga, ou as células a 150 xg durante 3 min, remover o sobrenadante e ressuspender suavemente os cristais ou células em 10 μL de tampão .
- Com base na concentração de cristal calculada no passo 2.1.9, ajuste a concentração para 10 7 cristais / mL diluindo a amostra; Ou pela granulação dos cristais a 4.000 xg durante 3 min a temperatura ambiente numa microcentrífuga, ajustando o volume final removendo o sobrenadante e ressuspensando suavemente os cristais.
- Se as amostras devem ser congeladas antecipadamente, esfriar o carregador seco ou dewar com nitrogênio líquido. Prepare os frascos ou discos, conforme apropriado, e esfrie-os com nitrogênio líquido.
- Ressuspender o sedimento de cristal e aplicar uma gota de cristais de 0,5 μL em um micromesh por pipetagem. Use malhas de 700 μm com 25 μm de quadradoBuracos como ponto de partida. A área da malha não é crítica, mas uma área maior proporciona mais cristais por malha e leva a uma evaporação mais lenta durante a preparação. O tamanho dos furos pode ser otimizado para se adequar ao tamanho de cristais maiores que 25 μm. Se necessário para estudos sistemáticos, as malhas indexadas estão disponíveis para facilitar uma verificação metódica da grade durante a coleta de dados.
- Remova a maior parte do excesso de líquido por mancha com um pavio de papel. Os cristais devem ser espalhados uniformemente na malha, sem se tocarem. Repita o passo 3.1.1. Para otimizar a concentração da amostra. Prossiga rapidamente e não remova muito líquido. Na ausência de crioprotector, o líquido evapora rapidamente com o risco de formação de cristais de sal e / ou perda do filme.
- Adicionar crioprotector: pipetar 0,5 μL de uma solução de 50% de etilenoglicol em água na malha (a composição do criobuffer deve ser adaptada à amostra, sugestões para otimização de cO ryoprotector pode ser encontrado na referência 30 ). Remova o excesso de líquido por mancha com um pavio de papel. Em contraste com o passo anterior, aqui o filme restante do solvente deve ser o mais fino possível para reduzir os efeitos de paralaxe que complicam o processo de alinhamento entre o cristal, o caminho do feixe e o goniômetro; E para minimizar o fundo causado pela dispersão de raios-X por líquido no caminho do feixe.
- Imediatamente esfriar o micromesh em nitrogênio líquido e transferir para um frasco para injectáveis ou robo, então para um carregador seco ou dewar para armazenamento.
- Preparação de micromesh com células que contêm cristais
CUIDADO: O uso de nitrogênio líquido está associado a perigos como asfixia, queimaduras a frio, incêndio em atmosfera enriquecida em oxigênio e explosão. Consulte a gestão de risco e as práticas de trabalho seguras da sua instituição.- Transfira as células ordenadas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Com base na célula cMontados pelo classificador de células, ajuste a concentração para 10 7 células / mL diluindo a amostra com PBS; Ou por sedimentação das células a 150 xg durante 3 min a temperatura ambiente numa microcentrífuga, ajustando o volume final removendo o sobrenadante e ressuspensando suavemente as células.
- Misture as células com um volume igual de solução de tripano azul (0,4% p / v) até uma concentração final de 0,2% p / v.
- Se as amostras devem ser congeladas antecipadamente, esfriar o carregador seco ou dewar down com nitrogênio líquido. Prepare os frascos ou discos, conforme apropriado, e também esfriar com nitrogênio líquido.
- Ressuspenda gentilmente as células e pipetar 0,5 μL de células ordenadas em um micromesh.
- Remova o excesso de líquido por mancha com um pavio de papel. As células devem ser espalhadas uniformemente na malha, sem se tocarem. Se não estiver usando crioprotetor (passo 3.3.6), a película restante de solvente deve ser tão fina quanto possível para reduzir os efeitos de paralaxe que compliquemE o processo de alinhamento entre o cristal, o caminho do feixe e o goniômetro; E para minimizar o fundo causado pela dispersão de raios-X por líquido no caminho do feixe.
- Opcionalmente, adicione crioprotector às células: pipetar 0,5 μL de 50% de etilenoglicol, 50% de solução de PBS na malha. A composição do criobuffer deve ser adaptada à amostra; Sugestões para otimização de crioprotectores podem ser encontradas na referência 30 . Remova o excesso de líquido por mancha com um pavio de papel, deixando apenas uma fina película de solvente.
Nota: A omissão do passo de crioprotecção não alterou a qualidade da difração de raios X quando os cristais da poliedrina foram analisados em celulo , enquanto este passo era necessário para cristais purificados 20 . Isto aplica-se apenas à incubação das células com solução crioprotectora; A amostra ainda deve ser analisada em 100K para minimizar os efeitos do dano de radiação nos cristais. - ImmediDesligue o microfone em nitrogênio líquido e transfira para um frasco ou puck do robô, depois para um carregador seco ou armazenamento dewar, conforme apropriado.
4. Coleta de dados
Nota: Os parâmetros utilizados para a coleta de dados são fornecidos como um guia e devem ser otimizados para cada tipo de cristal e linha de sincrotron.
- Coletar dados em uma fita de cristalografia de microfoco (ver referência 7 para uma lista de linhas de luz de microfoco e suas características). Se disponível, use um feixe colimado que corresponda ao tamanho dos cristais.
- Para a fase experimental por método de Dispersão Anômala de um único comprimento de onda (SAD), colete em uma energia que maximize o sinal anômalo do átomo pesado de eleição. Para a fase de uso do método de Substituição Isomorfa Múltipla (MIR), colete acima da energia de uma borda de absorção adequada para o átomo pesado de escolha (disponível em http://skuld.bmsc.washington.edu/scAtter / AS_periodic.html).
- Depois de carregar a malha no goniômetro, comece centrando o micromesh com o caminho do feixe usando as orientações de face-on (lado convexo) e lado a lado. Então, com o micromesh face-on, ajuste o alinhamento alinhando o centro de uma pista horizontal particular do micromesh (por exemplo, comece com o central). Em seguida, colete dados ao longo desta faixa horizontal com apenas pequenos reajustes ao alinhamento. Se disponível, use a centralização com base em rastering em difração de raios X de baixa dose para afinar o alinhamento (consulte o contato local na linha do sincrotron).
Nota: Como uma quantidade limitada de dados pode ser coletada em microcristais devido a danos por radiação (tipicamente, 10 a 30 imagens com 1 ° de oscilação), em teoria, o cristal só precisa ser alinhado com o caminho do feixe de 10 a 30 °. No entanto, é fundamental que o alinhamento seja preciso, pois o cristal pode facilmente ser perdido pelo microbeam (geralmente colimado a um diametroEr de ~ 10 μm ou menor). - Coletar dados de difracção até que a difracção seja perdida por danos causados pela radiação. Para os cristais do poliedrina, o tempo de exposição de 10 seg é tipicamente usado para uma oscilação de 1 ° para um fluxo de aproximadamente 3,6 x 10 11 fotões / s a 13 keV com um detector CCD (dose total <30 MGy). Otimize essas configurações de acordo com a linha de luz e a natureza do cristal usado. Em particular, são recomendadas doses baixas e cortes finos para detectores de raios X de pixel.
Nota: Se estiver usando o na estratégia cellulo, as células coradas com azul trypan aparecerá como pontos azuis contra o fundo de apoio, tornando-os mais fácil para alinhar ao feixe. Se o microbeam colimado tem aproximadamente o mesmo tamanho que as células (~ 10 μm), todos os cristais contidos em uma célula serão iluminados simultaneamente. Para células contendo múltiplos microcristais, isso leva à observação de múltiplos padrões de difração, que podem ser difíceis de processar. No entanto, diA fração de um dos cristais freqüentemente tende a dominar o padrão de difração e é preferencialmente indexada durante o processamento de dados. Para linhas de luz com um feixe de raios-X significativamente menor que a célula, rastering com fluxo de raios-X muito baixo (> atenuação de 95%) deve ser usado para se centrar em um único cristal antes da coleta de dados. - Prossiga para o próximo cristal na pista.
- Uma vez que todos os cristais da pista foram testados, avance para a próxima pista e repita o procedimento de alinhamento. Continue até obter dados suficientes ou todos os cristais tenham sido testados.
- Certifique-se de que as pistas que foram processadas são claramente identificadas de modo que os cristais não sejam perdidos ou disparados duas vezes (se necessário, desenhe um esboço). Tipicamente, o azul de tripano fica amarelo depois que a célula foi irradiada, o que pode ser usado como marcador.
Figura 5 : Estratégia de Coleta de Dados de Amostras no Suporte Micromesh. (A) Estratégia de recolha de dados por pista; O alinhamento é feito no início de cada pista (pontos) e os dados são coletados ao longo da pista. ( B ) Close-up de uma célula que contém cristais de azul de tripa de tripa em uma malha, como se vê na tela de fita de microcristalografia. ( C ) Close-up de um poliedro purificado em uma malha, como visto na tela de laminação de microcristalografia. Os quadrados de malha são de 25 μm x 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Processamento de dados
NOTA: Aqui, apenas mencionamos brevemente as etapas do processamento de dados que são específicas da microcristalografia em série, onde os dados de vários cristais são mesclados. Muitos artigos excelentes sãoDisponível descrevendo o processamento de dados em profundidade 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 e a determinação da estrutura está além do escopo deste protocolo.
- Selecione o cristal com a melhor resolução e qualidade de difração como referência.
- Processe individualmente cada cristal usando pacotes de cristalografia padrão, como HKL-2000 31 , Mosflm 32 ou XDS 33 . Para garantir que os danos causados pela radiação não deteriorem a qualidade do conjunto de dados, selecione cuidadosamente a última imagem com danos de radiação aceitáveis. Os critérios de corte que indicam danos excessivos por radiação são específicos de cada tipo de cristal, prática de processamento e propósito da experiência. Para a fase dos cristais de poliedrina BmCPV1, os dados foram descartados uma vez que o sinal para o nOise <I> / <σ (I)> por imagem caiu abaixo de 2 ou o R sym excedeu 50% conforme relatado pelo HKL-2000 31 .
- Para cada cristal, defina o limite de resolução eo número de quadros e reprocesse com os parâmetros corretos para evitar a integração de dados com pouco ou nenhum sinal.
- Escalar e mesclar dados dos melhores cristais para o (s) cristal (es) de referência usando pacotes padrão, como Scalepack em HKL-2000 31 , SCALA em CCP4 34 , 35 ou XSCALE no XDS 33 . Adicione os dados dos diferentes cristais progressivamente ao monitorar a qualidade global do conjunto de dados, idealmente até que o conjunto de dados atinja uma totalidade aceitável (> 95%). Rejeitar cristais que apresentam um mau isomorfismo com o cristal melhor / referência como detectado por diferenças nos parâmetros da célula unitária e pobre R intercalação / qui-quadrado por imagem. Se muitos conjuntos de dados de boa qualidadeNão faça escala com o (s) cristal (es) de referência, use um programa como o BLEND 36 que contém o agrupamento hierárquico para definir a melhor combinação de conjuntos de dados para a mesclagem.
Nota: em alguns grupos espaciais, opções alternativas de indexação precisam ser testadas para coincidir com o cristal de referência. - Proceda à fase experimental, substituição molecular ou refinamento usando pacotes de cristalografia padrão.
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Representative Results
Uma visão geral de ambos os métodos alternativos para a determinação da estrutura utilizando microcristais in vivo é apresentada ( Figura 1 ). Os poliedros podem ser facilmente purificados por sonicação e centrifugação. Devido à sua densidade, eles formam uma camada na parte inferior do tubo por baixo de uma camada de detritos que podem ser removidos por pipetagem ( Figura 3a e 3b ). A amostra é então submetida a várias rodadas de sonicação e lava até atingir um nível de pureza suficiente, conforme julgado pelo aspecto branco e calcário do grânulo ( Figura 3c ).
Para a abordagem intracelular , o perfil de citometria de fluxo de células não infectadas é comparado com o perfil de células contendo cristais e usado para determinar qual população de células deve ser selecionada para classificar as células que contêm cristais, longe deAs outras células ( Figura 4 ). Neste exemplo, as células que contêm poliedros apresentam maior dispersão lateral do que células não infectadas. Outras diferenças nos padrões de dispersão podem ser observadas para outros tipos de cristais e o gating deve ser modificado em conformidade.
Os microcristais purificados ou as células que contêm cristais são pipetados para um micromesh ( Figura 5 ). As células coloridas com azul de tripano podem ser visualizadas facilmente usando câmeras disponíveis na maioria das linhas de luz de sincrotron ( Figura 5b ), enquanto os cristais purificados são trabalhosos para identificar e alinhar com o raio de raio X devido ao tamanho pequeno deles ( Figura 5c ). Ao coletar dados, é melhor prosseguir em um padrão de grade para minimizar os procedimentos de centralização e para evitar expor duas vezes a mesma célula ou cristal, ou falta qualquer ( Figura 5a ). Coleta de dadosO ted deve ser processado cuidadosamente para explicar as diferenças nos limites de difracção, o efeito do dano da radiação e uma possível falta de isomorfismo.
Figura 1 : Visão geral de dois métodos para determinação da estrutura usando microcristais In Vivo . Os microcristais são produzidos em cultura celular por excesso de expressão da proteína de interesse utilizando um sistema de expressão recombinante. Em casos específicos, os microcristais também podem ser produzidos naturalmente pelas células em condições particulares. A linha superior mostra a abordagem clássica em que as células são lisadas e os cristais são purificados por centrifugação diferencial. Os microcristais purificados são pipetados em um micromesh. Após a remoção do excesso de líquido, é adicionada uma solução crioprotectora, o excesso de líquido é transferido novamente e a malha é arrefecida por flash. Para difusão de raios X Experimentos de fração, os cristais são cuidadosamente alinhados com o feixe de raios X, o que pode ser o passo de limitação de taxa na coleta de dados. A linha inferior apresenta a abordagem celular . As células são classificadas por citometria de fluxo para selecionar especificamente células contendo cristais. As células são coradas com azul de tripano para facilitar a visualização e se espalhar para um micromesh. Neste caso, a adição de um crioprotector é opcional. Para experiências de difração de raios X, as células são facilmente visualizadas usando câmeras típicas disponíveis em linhas de luz de sincrotron facilitando o processo de centralização.
Imagem do sistema automatizado de cromatografia líquida cortesia da GE Healthcare AB, Uppsala, Suécia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
= "Xfig"> Figura 2 : Exemplos de microcristais in vivo . Exemplos selecionados de cristais in vivo: ( a ) células Sf9 com poliedro com citoproteína; ( B ) células LD652 com esferóides de entomopoxvírus; ( C ) Bacillus thuringiensis com cristais Cry3A (seta); ( D ) células Sf9 com cristais de Trypanosoma brucei cathepsina B; ( E ) células Sf21 com cristais de calcineurina (setas); ( F ) monocamada de células COS7 com PKA: cristais Inka1; ( G ) células CHO com cristais de IgG. Reproduzido a partir de 14 , 18 , 29 , 37 , 39 , 42 , com permissão. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver um grandeE a versão desta figura.
Tabela 1: Resumo dos cristais in vivo cultivados em células cultivadas que expressam proteína recombinante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo fornece duas abordagens para analisar os microcristais com o objetivo de facilitar a análise de cristais muito pequenos que teriam sido ignorados no passado.
Passos críticos para a purificação de microcristal
O protocolo apresentado foi otimizado usando o poliedrino Bombyx mori CPV1 expresso em células Sf9 como um modelo de sistema. No entanto, os microcristais in vivo apresentam uma grande variabilidade na resistência mecânica. Por exemplo, os cristais tipo agulha de catepsina B cultivados em células de insetos são rígidos e altamente resistentes ao estresse mecânico e podem ser purificados usando um protocolo semelhante ao descrito aqui 14 . Por outro lado, os cristais de luciferase de vaga-lume, também cultivados em células de insetos cultivadas e com uma morfologia semelhante a uma agulha semelhante, imediatamente se dissolvem após a lise celular 38 . Assim, o protocolo para extração e purificação de in vivoOs cristais terão de ser adaptados numa base de erro de teste para casos específicos, conforme descrito nas etapas 1.3, 2a.3-4, 2b.4, 3.1.3-4 e 3.2a.5.
Para cristais frágeis, a separação (parcial) dos detritos celulares pode ser conseguida por centrifugação a baixa velocidade ( ou seja, 200 xg) ou a adição de uma almofada de sacarose na parte inferior do tubo, em vez de uma sonicação repetida. Como regra geral, amostras de cristal preparadas para fins de coleta de dados de difracção não precisam ser altamente purificadas. Assim, a purificação rápida é preferível para cryo-cool os cristais antes que eles possam decair.
Aplicação a microcristais in vitro e in vivo
Embora ambos os protocolos sejam aqui ilustrados com a análise de cristais crescidos in vivo , a metodologia pode ser prontamente usada para microcristais cultivados em bandejas de cristal a partir de proteínas recombinantes purificadas. NissoCaso as seguintes modificações devem ser consideradas: i) o suporte de malha pode ser usado para colher os microcristais diretamente da gota de cristalização, em vez de transferi-los por pipetagem; Ii) uma vez que a quantidade de cristais pode ser um fator limitante, será necessário tomar cuidado especial ao remover o excesso de líquido do suporte de malha, para evitar a remoção excessiva de cristais; Iii) diferentes tampões de crioprotetores precisam ser testados, conforme feito em cristalografia convencional (ver referência 30 ).
Por outro lado, para os cristais criados in vivo , a abordagem do cellulo é fortemente recomendada. Como as células são mais fáceis de visualizar e manipular do que os cristais purificados, esta abordagem é mais eficiente em termos de uso do feixe de luz e mais acessível para pesquisadores com pouca ou nenhuma experiência em microcristalografia. Também é mais adequado para cristais frágeis que podem ser afetados pela extração e pur Itio da célula devido a mudanças no ambiente químico, diluição das proteínas circundantes e danos mecânicos. Além disso, as células fornecem um ambiente protetor aos cristais, aliviando a necessidade de adicionar um crioprotetor. A omissão do tratamento de crioprotecção foi previamente demonstrada para evitar a acumulação de defeitos e melhorou o isomorfismo entre os cristais individuais, para a coleta de dados à temperatura ambiente 40 . O protocolo intracelular também ignora o requisito de incubação na solução crioprotectora, enquanto ainda permite a coleta de dados à temperatura criogênica. Em geral, na coleta de dados de celulo tem duas vantagens principais: 1) pode produzir dados de melhor qualidade e maior resolução para um determinado período de feixe de ondas 20 ; E 2) mantém a proteína cristalizada em um ambiente celular aumentando as chances de manter um ligando biologicamente relevante.
"> Limitações da técnicaUma complicação intrínseca da microcristalografia em série é o número importante de conjuntos de dados parciais gerados durante a coleta de dados. Conseqüentemente, o processamento de dados torna-se um processo cada vez mais demorado. No entanto, o fluxo de trabalho básico para o processamento de dados pode ser amplamente automatizado. Por exemplo, a seleção ótima de cristais isomorfos pode ser determinada por análise de cluster hierárquica 28 , por exemplo, implementada em BLEND 36 . Além disso, os programas desenvolvidos para a análise de lasers de elétrons sem raios X (XFEL) também podem ser adaptados para processar dados de microcristalografia em série coletados em linhas de sincrotrona 2 e, em algumas linhas de feixe, o rastering automatizado de malha e detecção de cristal foi implementado facilitando muito o serial Coleta de dados 2 , 41 .
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer Chan-Sien Lay por fornecer imagens de microcristais purificados, Daniel Eriksson e Tom Caradoc-Davies para obter suporte na linha de transmissão MX2 do Synchrotron australiano e Kathryn Flanagan e Andrew Fryga da unidade FlowCore na Universidade Monash para os seus Assistência inestimável.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1 L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50 mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50 mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19 mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
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