Summary
Vroege endosome functies is afhankelijk van F-actine polymerisatie. Hier beschrijven we een microscopie gebaseerde in vitro -assay die reconstitutes de nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege endosomal membranen in proefbuizen, waardoor deze complexe reeks reacties vatbaar voor biochemische en genetische manipulaties.
Abstract
Vele vroege endosome functies, met name lading eiwit sorteren en membraan vervorming, afhankelijk van de patches van korte F-actine-filamenten nucleated op het endosomal-membraan. Wij hebben vastgesteld een microscopie gebaseerde in vitro -assay die reconstitutes de nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege endosomal membranen in proefbuizen, waardoor deze complexe reeks reacties vatbaar voor genetische en biochemische manipulaties. Endosomal breuken worden voorbereid door floating in sacharose verlopen uit cellen uiten van de vroege endosomal eiwit GFP-RAB5. Cytosolische breuken zijn bereid uit afzonderlijke batches van cellen. Zowel endosomal als cytosolische breuken kunnen worden opgeslagen bevroren in vloeibare stikstof, indien nodig. In de test, de endosomal en cytosolische fracties worden gemengd en het mengsel is geïncubeerd bij 37 ° C onder passende omstandigheden (bijvoorbeeld Ionische sterkte, vermindering van milieu). Op het gewenste tijdstip, het reactiemengsel is vast, en de F-actine wordt onthuld met phalloidin. Actin nucleatie en polymerisatie worden vervolgens geanalyseerd door fluorescentie microscopie. Wij rapporteren hier dat deze bepaling kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de rol van factoren die betrokken zijn, hetzij in actine nucleatie op het membraan, of in de daaropvolgende rek, vertakking, crosslinking van F-actine-filamenten.
Introduction
In hogere eukaryote cellen, zijn eiwitten en lipiden geïnternaliseerd in vroege Endosomen waar sorteren plaatsvindt. Sommige eiwitten en lipiden, die zijn bestemd om te worden reutilized, zijn opgenomen in de tubulaire regio's van de vroege Endosomen en vervolgens naar het plasma-membraan of de trans-Golgi network (TGN)1,2vervoerd. Andere eiwitten en lipiden zijn daarentegen selectief verpakt in regio's van de vroege Endosomen die een multivesicular uitstraling vertonen. Deze regio's uit te breiden en, op onthechting van vroege endosomal membranen, uiteindelijk volwassen in gratis endosomal vervoerder blaasjes of multivesicular organen (ECV/MVBs), die verantwoordelijk zijn voor vracht naar de late Endosomen1, 2.
Actin speelt een cruciale rol in het membraan remodelleert proces endosomal Sorteer capaciteit en endosome biogenese is gekoppeld. Eiwit sorteren langs de recycling trajecten aan het plasma-membraan of de TGN hangt af van de complexe retromer en de bijbehorende eiwitten. Deze Sorteer machine lijkt te worden gekoppeld aan de vorming van de recycling tubuli via interacties van de retromer complex, met WASP en litteken homologe (WASH) complexe en vertakt actine3,4,5 . Daarentegen moleculen bestemd voor afbraak, met name geactiveerd signalering receptoren, zijn ingedeeld in intraluminale blaasjes (ILVs) door de endosomal complexen vereist voor vervoer (ESCRT)2,6, sorteren 7. Terwijl de mogelijke rol van actine in de ESCRT-afhankelijke sorteren proces is niet bekend, speelt F-actine een belangrijke rol in de biogenese van ECV/MVBs en vervoer buiten de vroege Endosomen. Bovenal vonden wij dat Annexine A2 bindt cholesterol-verrijkt gebieden van vroege endosome, en samen met spire1, nucleëert F-actine polymerisatie. De vorming van het netwerk van de vertakte actine waargenomen op Endosomen vereist de vertakkende activiteit van de actine-gerelateerde eiwitten (ARP) 2/3 complex, evenals de ERM eiwit moesin en de actine-bindende eiwit cortactin8,9.
Hier beschrijven we een microscopie gebaseerde in vitro -assay die reconstitutes de nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege endosomal membranen in proefbuizen. Deze test is eerder gebruikt voor het onderzoeken van de rol van de Annexine A2 in F-actine nucleatie en moesin en cortactin in de vorming van endosomal actine netwerken8,9. Met dit protocol in vitro , de complexe reeks reacties die op Endosomen tijdens de actine polymerisatie optreden worden vatbaar voor de biochemische en moleculaire analyse van de opeenvolgende stappen van het proces, met inbegrip van actine nucleatie, lineaire polymerisatie, vertakking en crosslinking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. oplossingen en preparaten
Opmerking: alle buffers en oplossingen moeten worden voorbereid in tweemaal gedestilleerd (dd) H 2 O. Omdat de toestand van de hydratatie van sacharose varieert, de uiteindelijke concentratie van alle sacharose oplossingen moet worden bepaald met behulp van een refractometer.
- Voorbereiden met fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder divalente kationen (PBS-): 137 mM NaCI, 2,7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4 en 6.5 mM nb 2 HPO 4. Breng de pH op 7.4. Steriliseren in autoclaaf (1 cyclus bij 121 ° C gedurende 15 minuten) en bij kamertemperatuur bewaren.
- Bereiden stockoplossing van 300 mM imidazool: 0.204 g van imidazool in 10 mL ddH 2 O.Adjust de pH aan 7.4 bij 4 ° C met behulp van HCl. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 μm porie grootte filter en bewaren bij 4 ° C.
- Voorbereiden homogenisering buffer (HB; voorbereiding van ongeveer 100 mL): 250 mM sacharose in 3 mM imidazool. Breng de pH op 7.4 bij 4 ° C met behulp van een pH-meter. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 μm filter voor de grootte van de poriën en bewaren bij 4 ° C. aanvulling de HB net voor gebruik met een cocktail van proteaseinhibitors op eindconcentraties overeenkomt met leupeptin van 10 mM, 1 mM pepstatin A, en 10 ng/mL aprotinin.
- Voor de stap Floating kleurovergangen, bereiden 62%, 39% en 35% sacharose oplossingen in 3 mM imidazool, pH 7.4, zoals hieronder beschreven. Precies bepalen de uiteindelijke concentratie van alle sacharose oplossingen met behulp van een refractometer.
- Bereiden 100 mL van 62% sacharoseoplossing in 3 mM imidazool, pH 7.4. Los door roeren 80.4 g van sacharose in ddH 2 O vooraf opgewarmd tot 35 ° C. Add 1 mL van 300 mM imidazool stockoplossing en opvulling met ddH 2 O. aanpassen tot 100 mL pH 7.4 bij 4 ° C. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 μm porie grootte filter en winkel bij 4 ° C.
- Bereiden 100 mL 35% sacharoseoplossing in 3 mM imidazool, pH 7.4. Ontbinden door roeren 40.6 g van sacharose in ddH 2 O. Add 1 mL van 300 mM imidazool stockoplossing en vul met ddH 2 O. aanpassen tot 100 mL pH 7.4 bij 4 ° C. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 μm porie grootte filter en bewaren bij 4 ° C.
- Bereiden 50 mL van 39% sucrose in 3 mM imidazool, pH 7.4. Verdun de 62% sacharoseoplossing met de 35% sacharoseoplossing. Bewaren bij 4 ° C.
- Los 3 g paraformaldehyde (PFA) door roeren in 100 mL PBS-pre-warmed tot 60 ° C terwijl het toevoegen van 1 M NaOH ontkleuring; 7.4 met NaOH op definitieve pH. Filter-steriliseren met behulp van een filter van 0.22-μm porie grootte en opgeslagen bij -20 ° C.
Let op: 3% PFA is een giftige reagens. - Bereiden 1 M KCl stamoplossing. Los 3,73 g KCl door roeren in 50 mL ddH 2 O. Filter-steriliseren met behulp van een filter van 0.22-μm porie grootte en bewaren bij kamertemperatuur.
- Voorbereiden 50 X geconcentreerde stamoplossing met 0.625 M Hepes bij pH 7.0 en 75 mM MgOAc 2 in ddH 2 O. Aliquot en winkel bij -20 ° C.
- Voorbereiden montage medium. Meng door roeren 2.4 g van poly(vinylalcohol) M w ~ 31.000 (PVA) met 6 g glycerol. Voeg 6 mL ddH 2 O en laat gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur. Voeg 12 mL 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) en warmte tot ongeveer 53 ° C met af en toe roeren totdat het PVA is ontbonden.
- Verduidelijken de oplossing door centrifugatie bij 5.000 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verzamelen van het supernatant en toevoegen van 2,5% (m/v) 1,4 - diazabicyclo-[2.2.2] octaan (DABCO) om te voorkomen dat photobleaching tijdens de fluorescentie detectie. Vortex voor ongeveer 30 s te ontbinden. ALIQUOT in 1.5-mL plastic buizen en opslag bij -20 ° C.
2. Cel cultuur
- cultuur HeLa cellen in Dulbecco ' s gewijzigd Eagle Medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 10% niet-essentiële aminozuren, 10% L-glutamine, en 1% penicilline-streptomycine. Ze onderhouden bij 37 ° C in een broedstoof 5% CO 2.
- Transfect van de cellen 24 uur voordat het experiment met GFP-RAB5 10, met behulp van commerciële transfectiereagens volgens de fabrikant ' s instructies.
- Wanneer nodig, bereiden endosomal breuken en cytosol uit cellen uitgeput van een proteïne van belang (dat wil zeggen, met behulp van RNAi of CRISPR/Cas9) en/of een wildtype of mutant vorm van de proteïne van belang overexpressing.
3. Endosomal fractie voorbereiding
Opmerking: dit protocol beschrijft de eenvoudige bereiding van subcellular breuken met Endosomen en andere lichte membranen. Indien nodig, kunnen gezuiverde endosome breuken ook gebruikte 11. 2 petrischalen (buitendiameter van de 10-cm; 57 cm 2) bereiden van confluente cellen uiten GFP-RAB5 als grondstof. Het totale aantal confluente HeLa cellen in 2 petrischalen komt ruwweg overeen met 2.5 x 10 7 cellen. Wanneer nodig, de Endosomen kan ook bereid worden uit cellen uitgeput van een proteïne van belang (dat wil zeggen, met behulp van RNAi of CRISPR/Cas9) en/of overexpressing een wildtype of mutant vorm van de proteïne van belang altijd uitdrukken GFP-RAB5.
Let op: alle stappen van het fractionering-protocol moeten worden uitgevoerd op ice.
- Plaats van de petrischaaltjes op een natte metalen bord in een platte ijsemmer en onmiddellijk wassen de cellen tweemaal met 5 mL ijskoud PBS-.
- Verwijder alle PBS - uit de laatste wassen en voeg 3 mL ijskoud PBS-per schotel. Cellen moeten niet droog tijdens behandeling: indien nodig, plaats de ijsemmer op een rockende platform voor voldoende cellen met vloeistof. De cellen verwijderen in PBS
- mechanisch uit de petrischaaltjes met behulp van een flexibel rubber politieagent (dat wil zeggen, zelfgemaakte cel schraper). Schraap eerst de cellen uit de gerechten in een snelle, cirkelvormige beweging rond de buitenkant van de schotel, gevolgd door een neerwaartse beweging in het midden van de schotel. Schraap zachtjes te verkrijgen " vellen " van gekoppelde cellen. Zachtjes het overbrengen van de cellen met behulp van een plastic pipet van Pasteur met een brede opening naar een conische polypropyleen buis 15 mL op ice.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten op 175 x g- en 4 ° C.
- Voorzichtig Verwijder het supernatant (SN) en voeg 1-3 mL HB tot de pellet. Met behulp van een plastic pipet van Pasteur met een brede opening, zachtjes Pipetteer omhoog en omlaag Zodra om resuspendeer de cellen.
- Centrifuge voor 7-10 min op 1.355 x g- en 4 ° C. zachtjes verwijderen de SN.
- Uitvoeren van cel homogenisering.
Opmerking: Voorwaarden moeten zacht zodat de plasma membranen van de cellen gebroken zijn, maar de Endosomen intact blijft.- Toevoegen een bekend volume van HB met proteaseinhibitors op elke cel pellet (ongeveer 100 μl per cel pellet). Met behulp van een 1.000-µL micropipet, zachtjes Pipetteer op en neer totdat de cellen zijn geresuspendeerde. Niet doen introduceren van luchtbellen.
- Bereiden een 1 mL tuberculine-injectiespuit met een naald 22G gratis lucht of bubbels en vooraf gespoeld met HB.
- Vul de injectiespuit met de celsuspensie relatief langzaam (om te voorkomen dat er luchtbellen), plaats de schuine punt van de naald tegen de wand van de buis en het verdrijven van de celsuspensie snel wilt schuintrekken uit de plasma membranen van de gekoppelde cellen.
- Nemen een kleine hoeveelheid van het homogenaat (ongeveer 3 µL) en Verdun het in 50 µL van HB op een glasplaatje. Mix en bedek met een dekglaasje glas aan. Inspecteren van het homogenaat onder een Microscoop van de fase contrast uitgerust met een 20 X of 40 X doelstelling.
Opmerking: Onder optimale omstandigheden, de meeste cellen zijn gebroken, maar kernen, die worden weergegeven als donkergrijs en ronde structuren, zijn niet ( Figuur 1). - Herhaal stap 3.7.3 en 3.7.4 tot de meeste cellen zijn gebroken; meestal 3-6 en neergaande lijnen door de naald zijn noodzakelijk. Houden van een kleine hoeveelheid (10-30 µL) van het homogenaat voor eiwit bepaling.
- Centrifuge homogenaat gedurende 7 minuten op 1.355 x g- en 4 ° C.
Opmerking: na het centrifugeren, de pellet (gedefinieerd als de nucleaire pellet; NP) bevat de kernen en het supernatant (gedefinieerd als de postnuclear van de bovendrijvende substantie; PNS) bevat het cytosol en de organellen uitgebracht op de homogenisering en de schorsing van de vrije. - Verzamelen zorgvuldig de PNS. Behouden van kleine porties (10-30 µL) van de PNS en NP voor eiwit bepaling en negeren de NP.
- Pas de PNS tot 40,6% sacharose door verdunning van de 62% sacharoseoplossing met PNS met behulp van een verhouding van de 1:1.1 van PNS:62% sucrose. Meng voorzichtig maar grondig, zonder dat er luchtbellen. Controleer de concentratie van sacharose met behulp van de refractometer.
- Plaats de PNS in 40,6% sucrose op de onderkant van de buis van een ultracentrifugatie. Overlay zorgvuldig met de 35% sacharoseoplossing 2,5 mL en vul de centrifugebuis met HB.
Opmerking: De sacharose oplossingen moeten worden gelaagde zodat interfaces duidelijk zichtbaar zijn. - Ultracentrifuge de verlopen gedurende 1 uur bij ̴165, 000 x g en 4 ° C.
- Verwijder voorzichtig de witte laag van lipiden op de top van het verloop. Vervolgens verzamelen de interface met de Endosomen, tussen het HB en 35% sucrose, een 200-μL micropipet met een gesneden tip.
Opmerking: De endosomal breuken kunnen rechtstreeks in de in vitro-assay van het actine-polymerisatie worden gebruikt of kunnen aliquoted op ijs, flash-bevroren in vloeibare stikstof, en opgeslagen bij -80 ° C. - Bepalen de eiwitconcentratie van de fracties PNS en endosomal.
Opmerking: Deze concentratie moet ten minste 100 µg/mL. Ongeveer 2.5 x 10 7 cellen gekweekt in 2 Petrischaaltjes zijn nodig om het verkrijgen van een PNS met ten minste 100 µg/mL (Zie de bovenstaande opmerking).
4. Cytosol voorbereiding
Opmerking: bereiden 2 petrischalen (10 cm doorsnede; 57 cm 2) van confluente HeLa cellen als grondstof. Wanneer nodig, kan het cytosol ook bereid worden uit cellen uitgeput van een proteïne van belang (dat wil zeggen, met behulp van RNAi of CRISPR/Cas9) en/of overexpressing een wildtype of een gemuteerde vorm van het eiwit van belang. Wat betreft het endosome fractionering protocol, moeten alle stappen worden uitgevoerd op ice.
- Herhaal stap 3.1-3.8.
- Breng de PNS in een centrifugebuis en ultracentrifuge voor 45 min op ̴250, 000 x g en 4 ° C.
- Zorgvuldig verwijderen van de witte laag bovenop en verzamelen de SN (cytosol Fractie) zonder verstoring van de microsome pellet. Houden van een aliquoot deel van het cytosol breuk voor eiwit bepaling.
Opmerking: Het cytosol rechtstreeks in de in vitro-assay van het actine-polymerisatie kan worden gebruikt of kunnen aliquoted op het ijs, flash-bevroren in vloeibare stikstof, en opgeslagen bij -80 ° C. - Bepalen de eiwitconcentratie van het cytosol.
Opmerking: Het moet ten minste 3 mg/mL.
5. Measuring Endosome-afhankelijke actine polymerisatie In Vitro assay
Opmerking: Endosome-afhankelijke actine polymerisatie kan worden uitgevoerd met behulp van twee alternatieve benaderingen. In de eerste benadering, zijn de materialen gemengd in een reageerbuis, vaste, en overgebracht naar een dekglaasje aan en geanalyseerd. In de tweede benadering, die hier beschreven, kan de bepaling worden uitgevoerd direct in de beeldvorming kamer en kan worden vastgesteld en geanalyseerd zonder mechanische perturbation ( figuur 2C). In deze tweede benadering het assay mengsel wordt niet overgedragen van een reageerbuis naar een dekglaasje aan en dus blijft onverstoorbaar, verminderen het gevaar van F-actine netwerken fysiek wordt verstoord tijdens de overdracht. Deze tweede aanpak is bovendien compatibel met een time-lapse analyse van F-actine polymerisatie. Opgemerkt moet worden dat er geen verschil in de analyse van F-actine polymerisatie werd waargenomen met beide benadering.
Opmerking: Gebruik knippen tips in het gehele protocol.
- In een reageerbuis
- zachtjes mix ijskoude gezuiverde GFP-RAB5 Endosomen (stap 3) met cytosol (stap 4) in een verhouding van 1:10 (eiwitconcentratie) in een ijskoude conische reageerbuis 1.5-mL.
Opmerking: Een typisch experiment is uitgevoerd met ongeveer 40-50 µL. - Pas de ijskoude reactiemengsel om de eindconcentraties van 125 mM KCl (met behulp van de stockoplossing van de KCl 1 M), 12.5 mM Hepes en 1,5 mM MgOAc 2 (met behulp van de 50 x stockoplossing). Pas vervolgens het mengsel met proteaseinhibitors om de eindconcentraties van leupeptin 10 mM, 1 mM pepstatin A, en 10 ng/mL aprotinin. Voorzichtig mengen van alle componenten.
- Plaats de reageerbuis met het reactiemengsel bij 37 ° C, zonder te schudden, en incubeer gedurende de gewenste tijd.
Opmerking: Normaal gesproken duurt het ongeveer 3 min actine polymerisatie op Endosomen en 30 min. voor de vorming van een uitgebreid netwerk detecteren. - Op het gewenste tijdstip (dat wil zeggen, 3 min of 30 min), zet de reactie stop door het plaatsen van de test-buis op ijs en toevoegen van 1/10 (vol:vol) van de precooled oplossing van 3% PFA.
- 0.3:10 (vol:vol) toevoegen van 200 eenheden/mL (~6.6 μM) phalloidin geconjugeerd met rood-oranje kleurstof om vlek de gepolymeriseerde actine.
- Plaats 12 μl van het mengsel op 12 μL van PVA montage medium op een micro glasplaatje. Zet een 18 x 18 mm 2 glasplaat coverslipon.
- Analyseren het monster met confocale microscopie.
- zachtjes mix ijskoude gezuiverde GFP-RAB5 Endosomen (stap 3) met cytosol (stap 4) in een verhouding van 1:10 (eiwitconcentratie) in een ijskoude conische reageerbuis 1.5-mL.
- In de beeldvorming zaal
- microscopische beeldvorming kamers kunt maken plasma reiniger voor 1 min om een ronde 18-mm diameter dekglaasje aan en een ronde 35 mm diameter petrischaal uitgerust met een 20 mm glazen bodem schoon (0.16-0.19 mm).
- Broeden de schoongemaakte oppervlakken met 1% β-caseïne voor 20 min om te minimaliseren van de binding aan eiwitten aan het glas. Wassen tweemaal met 3 mM imidazool.
- Toevoegen endosome en cytosol, in hetzelfde als aanvulling op het mengsel assay met 0,1 μg/μL rhodamine-actine assay mengsel in stap 5.1.1 en 5.1.2, aan een reageerbuis precooled 1,5 mL.
- Pas de definitieve brekingsindex van het mengsel 1.375 (26,5% sucrose) met 39% sacharoseoplossing.
Opmerking: Doorgaans hetzelfde volume wordt toegevoegd; Dit moet echter worden empirisch opnieuw aangepast afhankelijk van de sucrose concentratie van de verzamelde breuk, bepaald met behulp van een refractomer, aangezien de concentratie van sacharose enigszins van experiment tot experiment veranderen kan. - Plaats van het mengsel op de pretreated 35-mm schotel (stap 5.2.1) en bedek het met de pretreated 18-mm dekglaasje aan (stap 5.2.1).
- Plaats van de kamer bij 37 ° C, zonder schudden.
- Analyseren het monster met behulp van fluorescentie confocale microscopie.
6. Afbeelding Acquisition en analyse van actine netwerk
- Beeldacquisitie
- verwerven de beelden op een omgekeerde confocale scanning microscoop.
Opmerking: Overname afbeeldingsinstellingen werden geoptimaliseerd voor een omgekeerde scanning confocal microscoop met een doelstelling van 63 X 1,25 NA olie. Aanpassen van de kracht van de laser (meestal ongeveer 50%) om een goede signal-to-noise verhouding.
- verwerven de beelden op een omgekeerde confocale scanning microscoop.
- Kwantificering van het actine-netwerk
- de fluorescerende microfoto analyseren. Gebruik van de opensource-software CellProfiler (v2.1.1) 12 voor het meten van de hoeveelheid actine per endosome (alternatieve software kan worden gebruikt).
- Eerst Endosomen als het primaire object met behulp van het GFP-RAB5-signaal. Vervolgens het kwantificeren van de F-actine gekoppeld aan individuele Endosomen met behulp van de verspreiding van het actine-signaal (rood-oranje kleurstof geconjugeerd Phalloidin) als een secundaire object.
- Gemiddelde en normaliseren van het aantal bijbehorende materiaal voor elk object de controle voorwaarde.
- de fluorescerende microfoto analyseren. Gebruik van de opensource-software CellProfiler (v2.1.1) 12 voor het meten van de hoeveelheid actine per endosome (alternatieve software kan worden gebruikt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben gevolgd om te krijgen inzicht in de vorming van F-actine patches op vroege endosome membranen, het protocol dat is geschetst in Figuur 2. Kort, cellen werden transfected met GFP-RAB5 en vervolgens de vroege Endosomen door subcellular fractionering werden voorbereid. Deze gezuiverde vroege Endosomen werden geïncubeerd met cytosol zodat actine zelf, alsmede andere factoren die mogelijk betrokken in de reactie. Aan het eind van de incubatietijd, was de reactie gestopt door fixatie van het mengsel. Een steekproef is vervolgens opgehaald en afgezet op een microscopische dia. Tot slot bleek F-actine met phalloidin (figuur 3A). De nucleatie van F-actine op vroege endosomal membranen, alsmede de latere polymerisatie-proces is snel opgetreden. Inderdaad, F-actine kon al worden gevisualiseerd op Endosomen binnen 1 minuut na het begin van de reactie (figuur 3A). Deze actine structuren, die aanvankelijk kort waren, werd al snel langer, vertakte en gekoppeld aan een ander leidt tot de vorming van een verweven netwerk van actine-filamenten (figuur 3A), vermoedelijk als gevolg van onevenwichtige actine dynamiek in vitro. Soortgelijke nucleatie en polymerisatie tarieven werden waargenomen wanneer de test werd uitgevoerd met gezuiverde rhodamine-geëtiketteerden actine naast cel cytosol. Dit werd gedaan in glassbottom gerechten zodat structuren kon direct, image worden gemaakt bij ontstentenis van enige verstoring (figuur 3B). In de hier beschreven assay, ervoor vroege Endosomen de novo actine polymerisatie selectief. Inderdaad, actine polymerisatie zich niet voor wanneer de reactie in vitro werd uitgevoerd bij gebrek aan Endosomen of cytosol. Aldus kan worden geconcludeerd dat de vroege Endosomen beschikken over de fundamentele capaciteit ter ondersteuning van de nucleatie en latere polymerisatie van actine-filamenten9,11.
Voor het analyseren van de hoeveelheid actine polymeervorm uit Endosomen, werden de beelden verkregen op verschillende tijdstippen geanalyseerd met behulp van CellProfiler (figuur 4A). Het bedrag van polymeervorm per endosome actine werd gemeten als het gebied van actine rondom een enkele vroege endosome. Het tarief van de polymerisatie actine was hoger aan het begin van het proces en verlaagd met de tijd (figuur 4B). Het actine-netwerk kan worden geanalyseerd in meer detail op vroege tijd-punten na het begin van de reactie. Op deze vroege tijd-punten, kon individuele actine-bevattende structuren worden nog steeds worden van elkaar onderscheiden. Om te evalueren van de complexe organisatie van actine netwerken, het aantal actine-filamenten die afkomstig zijn van elk endosome werd geteld (dat wil zeggen, primaire filamenten). Ook werden het aantal actine-filamenten afkomstig uit primaire filamenten (d.w.z., secundaire filamenten) geteld, alsook het aantal alle andere actine filamenten die kon worden geïdentificeerd in de netwerken en dat deed niet afkomstig is van Endosomen) dat wil zeggen, andere door samensmelting van filamenten) (figuur 4C-E. Zodra de actine-filamenten werden getraceerd, andere parameters, zoals de lengte van individuele actine-filamenten en aantal Endosomen verbonden met de dezelfde actine-filamenten, kan gemakkelijk worden berekend (figuur 4F).
Figuur 1: fase Contrast opname van een HeLa cel homogenaat. Na homogenisatie, werd het extract gemonteerd tussen een microscopische dia en een dekglaasje aan. Voor publicatie, werden microfoto gevangen met een 100 X doelstelling na olie-immersie. Voor routine-inspectie, echter werd het cel extract gevisualiseerd onder een 20 X of een 40 X doelstelling zonder olie-immersie. Twee voorbeelden van high-vergroting weergaven van het homogenaat staan (A-B). Kernen (ster) worden weergegeven als ronde structuren donkergrijs van kleur, zonder gekoppelde cel overblijfselen. Pijlen wijzen naar de karakteristieke submodules van wisselende grootte, vorm en doorschijnendheid, die zijn vrijgegeven bij cel homogenisering en komen overeen met de intracellulaire materialen (dat wil zeggen, organellen). Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: schematische weergave van het Protocol. Schematische beschrijving van de protocollen die worden gebruikt voor het bereiden de extracten van de endosomal (A) en het cytosol extracten (B) en het controleren van actine polymerisatie van Endosomen in vitro (C). Supernatant (SN), homogenisering buffer (HB) postnuclear supernatant (PNS), nucleaire pellet (NP) en paraformaldehyde (PFA). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege Endosomen In Vitro. (A) Endosomen, gezuiverd van Hela cellen waarin GFP-Rab5 (groen) en HeLa cytosol afzonderlijk werden voorbereid. In de analyse, vroege Endosomen (EWS) waren gemengd met cytosol, en het mengsel werd uitgebroed voor de aangegeven tijden. Het mengsel werd vervolgens vastgesteld, aangeduid met phalloidin (rood) aan label F-actine en geanalyseerd door fluorescentie confocale microscopie. Bars: 10 µm (bovenzijde) en 5 µm (onderkant). (B) EWS gezuiverd van Hela cellen uiten GFP-Rab5 (groen) en HeLa cytosol afzonderlijk werden opgesteld. Deze cel extracten werden geïncubeerd met gezuiverde rhodamine-actine (rood) voor de aangegeven tijden in Microscoop kamers en werden geanalyseerd door confocale microscopie. Schaal bar = 10 µm. (C) het experiment werd uitgevoerd zoals in A. HeLa cytosol (zonder EWS) en HeLa Endosomen (groen) aangeduid met GFP-Rab5 (zonder cytosol) afzonderlijk werden geïncubeerd (linker- en middelste panelen) of samen (rechtervenster) voor 30 min, vaste, aangeduid met phalloidin (rood) aan label F-actine en geanalyseerd door fluorescentie confocale microscopie. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: analyse van het netwerk van actine. (A) Workflow van CellProfiler analyse. (B) aantal gepolymeriseerde actine werden gekwantificeerd ten opzichte van het aantal Endosomen met behulp van de CellProfiler software. Gegevens zijn gemiddelde ± s.e.m. (n = 3). Gegevens zijn middelen ± s.d. (n = 3). 5 min versus 15 min (ns P= 0.0736), 5 min versus 30 min (* P = 0.0195), en 15 min versus 30 min (ns P = 0.3129). (C)Vroege Endosomen (EWS) gezuiverd van Hela cellen uiten GFP-Rab5 en HeLa cytosol afzonderlijk werden opgesteld, en de bepaling werd uitgevoerd zoals in figuur 2A. Monsters werden vastgesteld na 7 min. Het middelste paneel toont de dezelfde opname, met de overlapping van de sporen van F-actine structuren getekend met de NeuronJ plugin13 van de ImageJ software. Het rechter paneel toont alleen de sporen. Schaal bar = 10 µm. (D) vertegenwoordiging van de F-actine structuur de volgorde van de nummering in de kwantificering met ImageJ software gebruikt. (E) kwantificering van het aantal actine-filamenten, zoals gedefinieerd in de C-D. Gegevens zijn middelen ± s.d. (n = 3). Primaire takken versus secundaire takken (ns P = 0.5262), secundaire takken versus andere takken (ns P = 0.6815), en primaire takken versus andere takken (ns P = 0.2254). (F) de lengte van de F-actine structuren en het aantal van de EWS per actine structuur worden weergegeven als voorbeelden van andere parameters dan met de kwantificering gedefinieerd in C-Dkunnen worden geanalyseerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Actin speelt een cruciale rol in de endosome membraan dynamics4,14. Eerder meldden wij dat actine nucleatie en polymerisatie optreden op vroege Endosomen, vormen kleine F-actine patches of netwerken. Deze F-actine-netwerken zijn absoluut nodig voor Membraantransport buiten vroege Endosomen langs het traject van de afbraak. Mengen bij elke stap van dit proces nucleatie en polymerisatie voorkomt rijping van de endosome en dus stroomafwaarts vervoer naar laat Endosomen andlysosomes9,11,15. We gebruikten in het bijzonder de bepaling die hierboven beschreven voor het analyseren van de opeenvolgende stappen van F-actine polymerisatie op vroege Endosomen en te karakteriseren het proces op moleculair niveau.
In deze experimenten, zijn vroege Endosomen aangeduid met GFP-RAB5 in vivogezuiverd door subcellular fractionering en geïncubeerd in een reageerbuis in aanwezigheid van cytosol toe voor F-actine polymerisatie in vitro. Op het gewenste tijdstip, de reactie wordt gestopt en het reactiemengsel is overgezet naar een microscopische dia voor analyse door fluorescentie microscopie, met behulp van phalloidin op het etiket van de F-actine. Met behulp van deze experimentele strategie, toonden we dat Annexine A2 noodzakelijk voor de nucleatie van F-actine op vroege Endosomen, samen met SPIRE1, is terwijl ARP2/3 F-actine vertakking, bemiddelt zoals verwacht. We toonden ook dat moesin en cortactin zijn nodig voor de vorming van de F-actine-netwerken die ECV/MVB biogenese en rijping langs het traject van de afbraak van zoogdiercellen9,11 bemiddelen.
Het is belangrijk om in gedachten houden dat, hoewel de lage niveaus van ectopically uitgesproken RAB5 veranderen niets aan Endosomen tot een belangrijke mate10, deze kleine GTPase een belangrijke regulator van vroege endosome membraan dynamics16,17 is . In sommige experimenten dienstig het daarom te label Endosomen in de bepaling met behulp van alternatieve protocollen. Bijvoorbeeld, kan vroege Endosomen een gunstige gelabeld met behulp van endocytosed fluorescerende tracers, zoals de epidermale groeifactor of transferrine4,14.
Ook opgemerkt moet worden dat het technisch moeilijk te afbeelding individuele actine-filamenten met conventionele confocale microscopie is. Daarom verwijzen we door naar F-actine structuren in de gehele tekst te beschrijven van actine netwerken op Endosomen. Dientengevolge, zijn wij van mening dat de vorming van een netwerk van F-actine nauwkeuriger kan worden gekwantificeerd door het meten van de oppervlakte van de fluorescentie van de netwerken in plaats van hun intensiteit.
Het is niet gemakkelijk om volledig de mogelijkheid uitsluiten dat de actine nucleatie activiteit waargenomen in vitro wordt gemedieerd door sommige andere structuur of organel dat gebonden aan RAB5 Endosomen tijdens het zuiveringsproces ongehinderd blijft. Besmetting is echter hoogst onwaarschijnlijk. Terwijl sommige organellen mede op hellingen vanwege soortgelijke fysieke eigenschappen zuiveren, doen ze niet de neiging om het kwantitatief gebonden aan elkaar na zuivering blijven. Bovendien hangt de actine nucleatie activiteit strikt Annexine A24,14, die op vroege Endosomen met RAB514aanwezig is. Tot slot vinden we dat F-actine structuren gekoppeld selectief RAB5 Endosomen in vivo zijn en niet zijn gevonden op andere Endosomen of op andere cellulaire membranen4,14. Kortom, is actine nucleatie activiteit waarschijnlijk verbonden met RAB5 Endosomen, aangezien deze activiteit mede zuivert en co met RAB5 Endosomen lokaliseert.
In deze test is veel als in andere tests die reconstrueren de complexe biochemische reacties dat besturingselement die de dynamiek van Endosomen16 of andere membranen18 en die worden uitgevoerd in een reageerbuis, het belangrijk ervoor te zorgen dat de voorbereiding van de cellulaire extracten is optimaal. Cellen moeten worden gehomogeniseerd zachte voorwaarden te beperken van schade aan Endosomen en andere organellen, met name kernen en lysosomen. Endosome breuken moeten ook worden gehouden op het ijs onder voorwaarden die zo weinig mogelijk stress van de osmotische en Ionische, evenals spontane actine polymerisatie. In extra, relatief hoge concentraties van endosome breuk (≥0.1 mg/mL) en cytosol (≥3 mg/mL) zijn nodig voor voldoende F-actine polymerisatie inzake Endosomen en opsporing, zoals aangegeven in stap 3.13 en 4.4, respectievelijk. Het is ook belangrijk voor het uitvoeren van de test met een 1:10 verhouding van endosome naar cytosol (eiwit: eiwit), zoals aangegeven in stap 5.1.1. Ten slotte pipetteren na actine polymerisatie (dat wil zeggen, om toe te voegen PFA en phalloidin) moet worden gedaan zeer voorzichtig om samen te vouwen of breken het actine-netwerk te voorkomen.
Indien nodig, kan de in vitro -assay van het actine-polymerisatie ook worden uitgevoerd direct in een Microscoop imaging kamer, na het gezuiverde rhodamine-actine toe te voegen aan het mengsel assay te beperken van mechanische verstoringen van de actine-netwerken polymeervorm op Endosomen (zie stap 5.2.3 en Figuur 2). In dit geval is het beste om aan te passen van het extract tot 26,5% (0,85 M) sacharose (refractieve index van 1.375), beperkende verspreiding en Brownse-achtige beweging (stap 5.2.3), en om mogelijke aggregaten van gezuiverd rhodamine-actine door ultracentrifugatie vóór gebruik. Onze observaties dat moesin bepaalt de vorming van F-actine netwerken op Endosomen werden volledig gerecapituleerd met behulp van deze alternatieve versie van onze assay4,14.
Beide versies van onze protocol, in de reageerbuis of in de beeldvorming zaal is optimaal voor een globale analyse van F-actine nucleatie en polymerisatie op Endosomen. Het is echter niet makkelijk te volgen van het proces van de polymerisatie van actine door de tijd met behulp van deze aanpak, gedeeltelijk omdat Endosomen niet onbeweeglijk. Dus het is niet gemakkelijk om te controleren de groei van individuele filamenten en dus te bepalen van de geschiedenis van het actine-netwerk. Bijvoorbeeld, kan het moeilijk zijn om F-actine vertakking uit crosslinking discrimineren. Wij zijn echter ervan overtuigd dat voorwaarden F-actine polymerisatie in real-time controleren in de beeldvorming zaal kunnen worden verbeterd door het optimaliseren van de voorwaarden om te immobiliseren van Endosomen. Evenzo, op zal zitten interessant voor F-actine polymerisatie van kunstmatige membranen met behulp van gezuiverde onderdelen controleren. In feite, toonden we eerder dat F-actine nucleatie en polymerisatie op liposomen na bindende t optreden kunnenHij nucleatie factor Annexine A2 op de dubbelgelaagde liposomen11. Deze strategie zal de rol van specifieke lipiden en eiwitten in het F-actine-nucleatie en polymerisatie-proces verder te ontleden en te karakteriseren de minimale componenten die nodig zijn om te vormen van een F-actine-netwerk op endosomal membranen nuttig zijn. Tenslotte menen wij dat deze strategie zal zitten zelfs nuttig om andere F-actine-afhankelijke processen die zich op de endosome membranen, met name de werving en de mobilisatie van de retromer/AFWAS machine voordoen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Steun was ontvangen van de Zwitserse nationale Stichting voor Wetenschappen; het Zwitserse Sinergia-programma; de Pools-Zwitsers onderzoeksprogramma (PSPB-094/2010); het NCCR in de chemische biologie; en LipidX van het initiatief van de Zwitserse SystemsX.ch, beoordeeld door de Zwitserse National Science Foundation (met J. G.). O. M. werd gesteund door een EMBO op lange termijn fellowship (ALTF-516-2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10 cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
- Huotari, J., Helenius, A.
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up! Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D.
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
